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白蚁肠道降解木质素细菌资源挖掘及代谢过程与机制研究

2020-12-02阅读(222)

白蚁肠道降解木质素细菌资源挖掘及代谢过程与机制研究

论文摘要

化石能源的大量消耗带来严重的环境污染,促使人们开发清洁可再生能源替代化石能源。在众多可再生能源原料中,仅有木质纤维素可以直接转化为液体燃料或高附加值化学品。然而,难降解的木质素阻碍了木质纤维素的高值化利用。木质素是一类由苯丙烷基通过不同类型化学键连接构成的高分子聚合物,其储量仅次于纤维素位于全球生物质总量的第二位。自然界中存在多种生物转化系统可以高效降解木质素,如真菌、细菌和白蚁等。细菌具有丰富的多样性并且生长速度快、环境适应能力强和基因操作简便等特点,在木质素生物降解方面起着重要作用。白蚁肠道共生细菌可以帮助宿主高效降解木质纤维素,已经受到研究者们的广泛关注,但关于肠道共生细菌降解木质素的功能还缺乏系统深入的认识。本文以云南西双版纳采集的海南土白蚁（Odontotermes hainanensis）、土垅大白蚁（Macrotermes annandalei）、黑翅土白蚁（Odontotermes formosanus）和巴基斯坦小白蚁（Microtermes pakistanicus）为研究对象,挖掘白蚁肠道可培养的木质素降解细菌资源,并挑选木质素降解能力突出的细菌,对其进行木质素和木质纤维素降解特性研究,同时结合转录组测序技术研究细菌中木质素降解相关酶基因的功能,揭示其降解木质素的分子机制。主要研究结果如下:（1）以碱木质素为唯一碳源,成功从白蚁肠道筛选分离得到96株菌株,经16S rRNA基因序列鉴定,它们分布于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌菌门、放线菌门四大门类,在属水平上分布于21个属,种水平上分布于33个种;其中肠杆菌科细菌占绝大多数,首次从白蚁肠道中分离到Kosakonia属和假柠檬酸杆菌属（Pseudocitrobacter）细菌。（2）以P.anthropi MP-4和R.ornithinolytica MP-132为研究对象,考察它们对碱木质素的降解特性。两株细菌在木质素培养基中培养时COD去除率均可达到50%以上,同时,测得P.anthropi MP-4和R.ornithinolytica MP-132分泌漆酶活力分别为37.67 U/L和32 U/L,木质素过氧化物酶活力分别为84.5 U/L和105.6U/L。降解后碱木质素微观形态、红外特征峰及热解特性分析,表明碱木质素化学结构被破坏,如侧链、苯环骨架结构、芳醚键、碳碳键等。（3）系统研究了R.ornithinolytica MP-132降解不同类型木质素的特性。在pH为8时,碱木质素降解率最高达到25.3%。FTIR分析降解前后木质素结构表明细菌破坏了木质素的芳香环结构和使不同类型化学键断裂,如甲基或亚甲基的C–H键、C=O键和紫丁香基/愈创木酚基甲氧基的C–O键等。从木质素热分解特性来分析,降解前后木质素样品的热分解（TG/DTG）曲线存在较大不同,如热分解的起始和终止温度、失重速率和失重峰值点。由此证明降解前后木质素的侧链含量、官能团种类及连接化学键的类型等存在差异。（4）以松木屑为碳源,研究R.ornithinolytica MP-132对松木及其木质素的降解特性。在松木屑降解过程中,R.ornithinolytica MP-132分泌的木质素过氧化物酶、漆酶、纤维素酶和木聚糖酶的活力分别为142.6 U/L、55.97 U/L、2.92 U/mL和2.08 U/mL。同时纤维素、半纤维素和木质素降解率分别可达到28.78%、32.9%和30%。此外,通过XRD和FTIR分析发现处理后的松木结晶度明显降低,以及红外特征峰出现强度降低、位移和消失的现象。SEM对松木微观结构进行观察,发现处理后松木表面变得松散和出现孔洞。热解实验结果证实松木中木质素热裂解特性发生显著变化。（5）为了阐明R.ornithinolytica MP-132降解木质素分子机制,对其进行转录组测序及生物学信息分析。测序结果共得到差异表达基因共2644个,对其进行GO富集分析发现归入到生物过程中有1277个,分子功能的差异基因837个,细胞组分的差异基因277个。经KEGG富集pathways分析,共富集到104条代谢通路,其中大部分与异源物质降解或者代谢有关。转录组测序序列中含有丰富的木质素降解酶基因,如β-酮己二酸代谢途径相关基因、原儿茶酸-3,4-双加氧酶和儿茶酚-1,2-双加氧酶等。综合以上结果,推断R.ornithinolytica MP-132的木质素降解途径:首先,细菌将木质素解聚为各种类型小分子芳香族化合物,这些小分子化合物经经过一系列氧化还原反应后进入到以苯甲酸为中心的代谢途径。苯甲酸类物质转化为原儿茶酸或者儿茶酚后,经原儿茶酸-3,4-双加氧酶或者儿茶酚-1,2-双加氧酶催化苯环开环,然后进入到β-酮己二酸代谢途径,最终通过三羧酸循环完成木质素矿化。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 木质素来源及结构
  •   1.2 木质素的应用前景
  •   1.3 木质素的微生物降解
  •     1.3.1 木质素降解微生物种类
  •     1.3.2 木质素降解酶系
  •   1.4 白蚁及其肠道共生菌降解木质纤维素
  •     1.4.1 白蚁解聚木质素机制研究进展
  •     1.4.2 白蚁肠道共生细菌降解木质素研究进展
  •   1.5 细菌降解木质素及模型化合物代谢途径研究
  •   1.6 本课题研究意义、内容及技术路线
  •     1.6.1 研究内容
  •     1.6.2 技术路线
  • 第二章 高等白蚁肠道可培养木质素降解细菌多样性研究
  •   2.1 实验材料与仪器
  •     2.1.1 白蚁来源
  •     2.1.2 培养基与试剂
  •     2.1.3 主要仪器设备
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 木质素降解菌筛选
  •     2.2.2 细菌的16S rRNA基因序列及系统进化树分析
  •     2.2.3 木质素模型化合物降解菌复筛
  •     2.2.4 染料脱色检测细菌胞外分泌酶
  •     2.2.5 细菌生长pH范围测定
  •   2.3 实验结果与讨论
  •     2.3.1 白蚁肠道木质素降解细菌分离纯化
  •     2.3.2 木质素降解菌16S rRNA基因的分子鉴定
  •     2.3.3 木质素降解细菌复筛
  •     2.3.4 细菌对不同种类染料脱色能力评价
  •     2.3.5 木质素降解菌序列比对与系统发育树
  •     2.3.6 菌株MP-4和MP-132 生长pH范围
  •   2.4 本章小结
  • 第三章 R.ornithinolytica MP-132和P.anthropi MP-4 降解碱木质素过程特征研究
  •   3.1 实验材料与仪器
  •     3.1.1 材料与试剂
  •     3.1.2 实验仪器及设备
  •   3.2 实验方法
  •     3.2.1 细菌培养条件
  •     3.2.2 细菌生长及木质素降解率测定
  •     3.2.3 木质素降解相关酶活力测定
  •     3.2.4 场发射扫描电子显微镜分析（FE-SEM）
  •     3.2.5 傅里叶变换红外色谱分析（FTIR）
  •     3.2.6 热重分析（TGA）
  •     3.2.7 热裂解-气相色谱质谱联用分析（Py-GC/MS）
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 细菌生长与碱木质素降解
  •     3.3.2 碱木质降解相关酶活力
  •     3.3.3 细菌降解碱木质素后微观结构分析
  •     3.3.4 傅里叶红外光谱（FTIR）分析
  •     3.3.5 热重分析（TGA）
  •     3.3.6 Py-GC/MS检测木质素热裂解产物
  •     3.3.7 初步推断细菌降解碱木质素的机制
  •   3.4 本章小结
  • 第四章 R.ornithinolytica MP-132降解不同类型木质素特性分析
  •   4.1 实验材料与仪器
  •     4.1.1 材料与试剂
  •     4.1.2 实验仪器及设备
  •   4.2 实验方法
  •     4.2.1 玉米秸秆中磨木木质素提取
  •     4.2.2 普鲁士法测定木质素浓度
  •     4.2.3 细菌培养条件
  •     4.2.4 细菌不同培养条件对碱木质素降解率的影响
  •     4.2.5 场发射扫描电子显微镜分析（FE-SEM）
  •     4.2.6 傅里叶变换红外色谱分析（FTIR）
  •     4.2.7 热重分析（TGA）
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 细菌降解木质素的培养条件
  •     4.3.2 SEM分析木质素微观结构
  •     4.3.3 木质素的FTIR分析
  •     4.3.4 TGA分析木质素热稳定性
  •   4.4 本章小结
  • 第五章 解析R.ornithinolytica MP-132 降解松木过程中木质素化学结构变化
  •   5.1 实验材料与仪器
  •     5.1.1 材料与试剂
  •     5.1.2 实验仪器及设备
  •   5.2 实验方法
  •     5.2.1 细菌培养条件
  •     5.2.2 松木中磨木木质素的提取
  •     5.2.3 还原糖浓度测定
  •     5.2.4 木质纤维素相关酶活力测定
  •     5.2.5 松木的纤维素、半纤维素和木质素测定
  •     5.2.6 X-射线衍射（XRD）分析
  •     5.2.7 场发射扫描电子显微镜分析（FE-SEM）
  •     5.2.8 傅里叶变换红外色谱分析（FTIR）
  •     5.2.9 热重分析（TGA）
  •     5.2.10 热裂解-气相色谱质谱联用分析（Py-GC/MS）
  •   5.3 结果与讨论
  •     5.3.1 R.ornithinolyticaMP-132 降解松木屑过程中还原糖浓度及组分含量变化分析
  •     5.3.2 R.ornithinolytica MP-132 降解松木过程中相关酶活力分析
  •     5.3.3 扫描电子显微镜（SEM）分析松木微观结构
  •     5.3.4 X-射线衍射（XRD）分析松木结晶度
  •     5.3.5 松木及其磨木木质素红外光谱（FTIR）分析
  •     5.3.6 TGA分析磨木木质素热稳定性
  •     5.3.7 Py-GC/MS分析磨木木质素热解产物
  •   5.4 本章小结
  • 第六章 基于转录组解析R.ornithinolytica MP-132 降解木质素分子机制
  •   6.1 实验材料与仪器
  •     6.1.1 材料与试剂
  •     6.1.2 实验仪器及设备
  •   6.2 实验方法
  •     6.2.1 细菌培养条件
  •     6.2.3 细菌总RNA提取及质量检测
  •     6.2.4 构建文库及上机测序
  •     6.2.5 生物信息学分析
  •   6.3 结果与讨论
  •     6.3.1 细菌总RNA质量检测结果
  •     6.3.2 样品测序数据统计及参考基因比对分析
  •     6.3.3 差异表达基因分析
  •     6.3.4 差异表达基因的GO分析
  •     6.3.5 差异表达基因的KEGG代谢通路分析
  •     6.3.6 R.ornithinolytica MP-132 降解木质素相关基因分析
  •     6.3.7 R.ornithinolytica MP-132 降解木质素相关代谢途径分析
  •   6.4 本章小结
  • 第七章 结论与展望
  •   7.1 结论
  •   7.2 本研究的创新点
  •   7.3 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 博士期间发表论文及其他科研成果

    • 文章来源

    类型: 博士论文

    作者: 李锋

    导师: 孙建中

    关键词: 白蚁,共生细菌,解鸟氨酸拉乌尔菌,木质素,降解机制

    来源: 江苏大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用,环境科学与资源利用

    单位: 江苏大学

    基金: 国家自然科学基金面上项目(31772529),江苏省高校优势学科建设工程项目

    分类号: X172;X705

    总页数: 149

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