首页> 正文

塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）水解酶的基因挖掘与催化性能研究

2020-12-08阅读(775)

塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）水解酶的基因挖掘与催化性能研究

论文摘要

邻苯二甲酸酯（Phthalate esters,PAEs）,俗称增塑剂,被广泛地应用于各类塑料制品的生产和加工。其中的邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）在全球范围内的使用量最大,近年的年消费量超过300万吨。研究表明,PAEs作为环境激素（Environmental Endocrine Disruptors,EEDs）会对生态环境和人类健康造成极大的危害,在低浓度下即可干扰人和动物的内分泌系统。在过去的几十年中,生物降解法作为PAEs主要的降解方式被国内外学者广泛地报道。目前,已知的PAEs水解酶主要作用于短烷基侧链PAEs和邻苯二甲酸单酯中酯键的水解,然而,最受关注的DEHP降解酶的报道却很少。至今为止,DEHP降解酶的基因和蛋白质序列,以及酶学特征仍是未知的,这阻碍了我们对大侧链PAEs酶学降解的认识和进一步的应用。本研究首先采用菌种驯化的方法从200份被塑料垃圾污染的土壤样品中分离鉴定出6株对DEHP具有催化活性的菌株,包括1株Rhodococcus sp.,1株Micrococcus sp.和4株Gorrdonia sp.,其中,Gordonia polyisoprenivorans 5F催化活性最高。通过对降解中间产物的分析,我们推测出DEHP在菌株5F中的降解路径。接着通过基因挖掘技术从5F菌株中克隆得到17个潜在的酯酶基因,将它们连接到pET-28a质粒载体上,导入大肠杆菌BL21（DE3）中进行异源表达。最终成功筛选到可降解DEHP的目标酶（GoEst15）,该酶可将DEHP降解成邻苯二甲酸单（2-乙基已）酯（MEHP）。通过对GoEst15的纯化,确定了该酶蛋白的分子量为58 kDa,利用酯酶的模式底物对硝基苯酚丁酸酯（pNPB）测出其反应的最适pH和温度分别为7.0和30。对于DEHP,GoEst15的Km和kcat/Km值分别为0.31 mM和0.16 s-1mM-1。降解反应研究显示,在1 mL反应体系中,0.15 mg GoEstl5可在24小时内完全降解5mM的DEHP;而完全降解5 mM的DBP,仅需要1小时。底物谱测试实验表明,该酶能够催化十一种PAEs的降解反应,是一种罕见的广谱酯酶。此外,我们还挖掘到了Gordoniapoly soprenivorans 5F中的MEHP水解酶（GoEstM1）,并构建了GoEst15和GoEstM1的共表达体系,利用该体系可实现从PAEs到邻苯二甲酸（PA）的一步转化。综上所述,GoEst15是新发现的一种能够降解DEHP的酯酶。由于其良好的降解效果和广泛的底物谱,该酶将是一种很有前景的生物催化剂,可作为蛋白质工程的起始酶,为未来污染物生物降解,土体生物修复和水治理开发绿色、温和、高效的技术。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第1章 绪论
  •   1.1 邻苯二甲酸酯概述
  •     1.1.1 邻苯二甲酸酯的简介
  •     1.1.2 PAEs的应用现状
  •     1.1.3 PAEs的污染及危害性
  •   1.2 非生物法降解PAEs
  •   1.3 生物法降解PAEs
  •     1.3.1 微生物降解法研究现状
  •     1.3.2 PAEs的代谢途径
  •     1.3.3 酶降解法研究现状
  •     1.3.4 目前生物法降解研究存在的问题
  •   1.4 本课题的研究目的及意义
  •   1.5 本课题的主要研究内容
  • 第2章 DEHP降解菌株的筛选与鉴定
  •   2.1 引言
  •   2.2 材料与方法
  •     2.2.1 主要试剂和仪器
  •     2.2.2 土壤样品采集
  •     2.2.3 培养基配制
  •     2.2.4 培养条件
  •     2.2.5 富集培养
  •     2.2.6 薄层色谱分析（TLC）
  •     2.2.7 菌株初筛
  •     2.2.8 纯种分离
  •     2.2.9 菌株复筛
  •     2.2.10 菌种鉴定
  •   2.3 结果与讨论
  •     2.3.1 菌株初筛结果
  •     2.3.2 纯种分离结果
  •     2.3.3 菌株复筛结果
  •     2.3.4 菌种鉴定结果
  •   2.4 本章小结
  • 第3章 DEHP降解菌株的降解特性研究
  •   3.1 引言
  •   3.2 材料与方法
  •     3.2.1 主要试剂和仪器
  •     3.2.2 培养基配制
  •     3.2.3 培养条件
  •     3.2.4 菌液处理方法
  •     3.2.5 测定菌降解DEHP的最适pH
  •     3.2.6 测定菌降解DEHP的最适温度
  •     3.2.7 HPLC分析方法
  •     3.2.8 GC-MS分析方法
  •     3.2.9 DEHP降解进程
  •     3.2.10 底物谱
  •     3.2.11 降解中间产物的测定
  •   3.3 结果与讨论
  •     3.3.1 反应最适pH
  •     3.3.2 降解反应最适温度
  •     3.3.3 底物谱
  •     3.3.4 DEHP降解进程
  •     3.3.5 降解中间产物的鉴定结果
  •   3.6 本章小结
  • 第4章 DEHP 水解酶的基因挖掘
  •   4.1 引言
  •   4.2 材料与方法
  •     4.2.1 主要试剂和仪器
  •     4.2.2 数据库挖掘
  •     4.2.3 Gordonia polyisoprenivorans 5F 基因组数据挖掘
  •   4.3 结果与讨论
  •     4.3.1 数据库挖掘结果
  •     4.3.2 Gordonia polyisoprenivorans 5F基因组数据挖掘结果
  •     4.3.3 GoEst15蛋白序列分析
  •     4.3.4 GoEst15同源建模
  •   4.4 本章小结
  • 第5章 GoEst15对PAEs的催化性能研究
  •   5.1 引言
  •   5.2 材料与方法
  •     5.2.1 主要试剂和仪器
  •     5.2.2 蛋白纯化
  •     5.2.3 四级结构分析
  •     5.2.4 酶活力分析方法
  •     5.2.5 pH和温度对酶活力的影响
  •     5.2.6 有机溶剂和金属离子对酶活力的影响
  •     5.2.7 降解产物的鉴定
  •     5.2.8 动力学参数测定
  •     5.2.9 酶的底物谱测定
  •     5.2.10 反应进程曲线的测定
  •   5.3 结果与讨论
  •     5.3.1 蛋白纯化
  •     5.3.2 四级结构信息
  •     5.3.3 GoEst15反应的最适pH
  •     5.3.4 GoEst15的pH稳定性
  •     5.3.5 GoEst15反应的最适温度
  •     5.3.6 GoEst15的热稳定性
  •     5.3.7 GoEst15的有机溶剂耐受性
  •     5.3.8 GoEst15的金属离子耐受性
  •     5.3.9 GoEst15对PAEs物质降解产物的鉴定
  •     5.3.10 GoEst15的动力学参数
  •     5.3.11 GoEst15的底物谱
  •     5.3.12 GoEst15对DBP和DEHP的降解进程曲线
  •   5.4 本章小结
  • 第6章 双酶共表达体系的建立
  •   6.1 引言
  •   6.2 材料与方法
  •     6.2.1 主要试剂和仪器
  •     6.2.2 MEHP水解酶的挖掘
  •     6.2.3 双酶共表达载体的构建
  •     6.2.4 共表达体系与DEHP反应
  •     6.2.5 共表达体系底物谱及其反应进程的测定
  •   6.3 实验结果与讨论
  •     6.3.1 MEHP水解酶挖掘
  •     6.3.2 双酶共表达体系的构建
  •     6.3.3 双酶共表达体系的选择
  •     6.3.4 双酶共表达体系的底物谱及其反应进程曲线
  •   6.4 本章小结
  • 结论与展望
  • 参考文献
  • 攻读硕士期间论文发表和专利公开情况
  • 致谢
  • 附录

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 黄晗

    导师: 徐殿胜,谢天培

    关键词: 邻苯二甲酸酯,邻苯二甲酸二乙基已酯,生物降解,代谢途径,酯酶

    来源: 华东理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

    专业: 生物学,环境科学与资源利用

    单位: 华东理工大学

    分类号: X592;Q78

    总页数: 79

    文件大小: 4699K

    下载量: 121

    相关论文文献

    • [1].塑料垫圈中DEHP对水质污染的神经网络模拟分析[J]. 塑料科技 2020(07)
    • [2].增塑剂DEHP生物毒性及控制策略的研究进展[J]. 山西化工 2020(04)
    • [3].植物叶际微生物的分离及对DEHP降解条件的初探[J]. 大众标准化 2020(19)
    • [4].豆类植物接种微生物对土壤DEHP的降解效果研究[J]. 环境与发展 2018(05)
    • [5].DEHP的污染现状及生物降解研究进展[J]. 河南科技 2017(13)
    • [6].不同使用类型红壤中DEHP的降解研究[J]. 农业与技术 2020(09)
    • [7].DEHP对3β-羟类固醇脱氢酶表达水平的影响[J]. 癌变·畸变·突变 2017(06)
    • [8].DEHP诱导自噬抑制原始卵泡发育[J]. 中国细胞生物学学报 2018(05)
    • [9].DEHP的降解及其对土壤细菌群落的影响[J]. 西部皮革 2018(11)
    • [10].医疗器械检测用DEHP标准物质的研究[J]. 癌变·畸变·突变 2017(04)
    • [11].增塑剂DEHP生物毒性及控制策略的研究进展[J]. 环境科学与技术 2016(S1)
    • [12].DEHP胁迫下萝卜的亚显微结构及应答转录组分析[J]. 食品与发酵工业 2020(21)
    • [13].DEHP在变应性鼻炎发病机制中作用的研究[J]. 免疫学杂志 2020(12)
    • [14].水环境中DEHP污染现状及其去除的研究进展[J]. 化工进展 2014(02)
    • [15].DEHP对中国林蛙肝组织抗氧化酶活性的影响[J]. 陕西师范大学学报(自然科学版) 2014(02)
    • [16].食品塑料包装材料中DEHP的风险评估[J]. 印刷技术 2013(16)
    • [17].邻苯二甲酸二乙基己酯(DEHP)毒理与健康效应研究进展[J]. 生态毒理学报 2012(01)
    • [18].高效液相色谱法测定一次性使用输液器中DEHP溶出量[J]. 中国医疗器械信息 2012(06)
    • [19].食品包装材料中DEHP的危害及其在食品中的暴露评估[J]. 食品科技 2008(04)
    • [20].孕期DEHP暴露对新生大鼠海马神经元凋亡的影响[J]. 神经解剖学杂志 2019(04)
    • [21].DEHP对高脂饮食大鼠血脂代谢的影响[J]. 山西大学学报(自然科学版) 2018(01)
    • [22].塑化剂DEHP暴露对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用[J]. 农业环境科学学报 2018(04)
    • [23].高级氧化技术对化工污染场地土壤中DEHP的修复效果[J]. 安全与环境工程 2018(03)
    • [24].Arthrobacter sp.JQ-1菌株胞外聚合物对DEHP吸附特性研究[J]. 东北农业大学学报 2018(10)
    • [25].出生前后DEHP暴露对小鼠神经行为的影响[J]. 浙江师范大学学报(自然科学版) 2015(01)
    • [26].DEHP对黑土微生物数量及酶活性的影响[J]. 东北农业大学学报 2015(01)
    • [27].不含DEHP输液器临床应用调查分析[J]. 医院管理论坛 2013(12)
    • [28].塑化剂DEHP的来源及其对机体健康的危害[J]. 中国食品 2011(13)
    • [29].六种蔬菜累积DEHP能力的研究[J]. 中小企业管理与科技(中旬刊) 2014(07)
    • [30].增塑剂DEHP的性能、合成、检测方法及其对人体健康的影响[J]. 湖北农业科学 2012(22)

    标签：;  ;  ;  ;  ;  

    塑化剂邻苯二甲酸二（2-乙基己）酯（DEHP）水解酶的基因挖掘与催化性能研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢

    © 2024 毕论降 版权所有 鄂ICP备12018319号-6