王君[1]2004年在《表面活性剂辅助蛋白质复性过程机理研究》文中研究指明蛋白质复性技术的研究对于基因工程重组蛋白质的生产具有重要意义。本论文以天然溶菌酶为模拟体系,综合运用实验研究、结构分析和分子模拟等方法研究表面活性剂十六烷基叁甲基溴化铵(以下简称CTAB)辅助溶菌酶复性过程的热力学和动力学特性。在此基础上,以重组人溶菌酶与重组甘露聚糖酶为实际体系,通过实验研究CTAB及其它类型折迭助剂的辅助复性效果,以考察此类技术的适用范围。第一章对蛋白质复性技术及其研究现状进行了简要综述。本章首先介绍了蛋白质复性技术研究所涉及的基本理论和实验检测方法;评述了目前发展的各种复性技术及其在基础研究和实际应用方面存在的问题;总结了表面活性剂辅助蛋白质复性技术的研究成果并重点分析了此类技术研究中存在的问题。继而提出了本文的研究设想,即从复性中间产物形成过程的分析入手来认识复性过程的热力学和动力学特性;将活性分析、结构测定和分子模拟等方法相结合来研究复性过程微观机理;采用不同的重组蛋白质产品进行复性实验以考察复性技术的适用性。以此为基础确立了本文研究工作的目标和内容框架。第二章通过实验研究发现在复性液中加入低浓度CTAB能够有效地提高溶菌酶的复性率,当CTAB与变性溶菌酶摩尔比为10时复性效果最佳。溶液表面张力与酶活力的变化显示变性溶菌酶首先与CTAB快速形成复合物,进而在氧化/还原剂作用下开始复性并缓慢与CTAB发生解离,圆二色性光谱与荧光光谱分析表明CTAB在与变性溶菌酶形成复合物时帮助其形成丰富的二级结构而促进折迭;但若结合CTAB过多则会阻碍折迭过程进行。非还原型SDS-PAGE、离子交换色谱等技术的分析结果表明CTAB辅助复性的主要产物包括具有活性的溶菌酶、无活性的溶菌酶多聚体及溶菌酶单体,产物的分布取决于溶液中CTAB与溶菌酶的摩尔比。以上实验结果未见国内外文献报道。第叁章通过实验考察了CTAB与β-环糊精(以下简称β-CD)构成的人工分子伴侣系统辅助溶菌酶复性过程。对不同类型表面活性剂的考察结果表
吴晓月[2]2006年在《色素亲和反胶团辅助溶菌酶复性的研究》文中进行了进一步梳理反胶团复性法是目前国内外最为新颖的蛋白质复性方法之一,可见报道有限,其中除一篇使用的是非离子型反胶团外,其余几篇使用的都是离子型反胶团,且均未修饰亲和配基。本文利用新型的反胶团—色素亲和反胶团辅助溶菌酶复性,色素亲和反胶团是一种修饰了亲和配基的非离子型反胶团,是由亲和配基—活性色素辛巴蓝(CB)、非离子型表面活性剂—失水山梨醇叁油酸酯(Span 85)、有机溶剂正己烷(n-hexane)等在一定条件下反应得到的。本文系统研究了CB/Span 85/n-hexane系统辅助溶菌酶复性的实验方法以及操作参数的影响,包括Span 85、CB、脲、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)、溶菌酶的浓度,pH值,反胶团含水率(W_0),反应时间等。成功实现了较高浓度(3～3.5 mg/mL)溶菌酶的完全复性,体现出反胶团法较直接稀释法的巨大优势,以及非离子型亲和反胶团较单纯非离子型反胶团在复性效果方面的较大优势;同时保证95%以上的溶菌酶能够被0.5 mol/L MgCl2溶液反萃回收,且圆二色光谱分析证明了最终所得溶菌酶二级结构的正确性,体现出非离子型亲和反胶团较离子型反胶团在蛋白质回收方面的较大优势。在此基础上,尝试改进反胶团性能,如添加助溶剂、助表面活性剂等以期进一步提高复性浓度,取得了一定的效果。在成功实现CB/Span 85/n-hexane系统辅助溶菌酶复性基础上,本文进一步将色素亲和反胶团与人工伴侣,即阳离子型表面活性剂十六烷基叁甲基溴化铵(CTAB)与β-环糊精(β-CD)的联合作用系统,耦合辅助溶菌酶复性。系统研究了二者耦合作用辅助溶菌酶复性的实验方法以及操作参数的影响,包括脲、GSSG、GSH、溶菌酶、CTAB、β-CD的浓度,W_0等。耦合复性法在很多方面起到了优化作用,并使得4 mg/mL溶菌酶被完全复性。本文在此基础上还尝试了使用其它方法与色素亲和反胶团耦合辅助溶菌酶复性,如醇类小分子添加剂等,也取得了一定成效。
王君, 卢滇楠, 林莹, 周蕊, 刘铮[3]2004年在《表面活性剂辅助溶菌酶复性:表面活性剂-蛋白质复合物结构分析》文中认为研究了十六烷基叁甲基溴化铵 (CTAB)辅助天然溶菌酶的复性过程及其影响因素 .发现向复性液中单独添加低浓度CTAB即可导致溶菌酶复性 ,且当变性溶菌酶浓度在 0 2mg·ml-1以上、CTAB与溶菌酶的摩尔比为 10时复性效果最佳 .采用表面张力、离子交换色谱、非还原性SDS PAGE及荧光发射光谱法对复性体系进行物性和结构分析 ,显示CTAB可与变性溶菌酶形成不同结构的表面活性剂 蛋白质复合物 ,且复合物的组成和结构可随时间发生变化 .最后 ,对于表面活性剂 蛋白质复合物形成过程机理进行了探讨
史广泉[4]2004年在《添加剂与流加操作辅助变性溶菌酶复性动力学》文中研究说明本文研究了添加剂与流加操作辅助变性溶菌酶复性动力学。首先针对氧化型谷胱苷肽与还原型谷胱苷肽的比例对于人工伴侣辅助溶菌酶复性的影响进行了研究，优化了人工伴侣辅助复性的反应条件；然后详细研究了酰胺类添加剂对促进溶菌酶的复性作用，并根据叁阶复性动力学模型，分析了复性动力学行为；在此基础上，开发出流加操作耦合人工伴侣辅助溶菌酶复性的新方法，并且考察了各种因素对复性效果的影响；最后，通过对流加结束后间歇阶段计算方法的修正，完善了流加条件下溶菌酶复性的过程动力学模型，并通过实验做了进一步验证。 实验结果表明，在适量的还原型谷胱苷肽存在下，改变氧化型谷胱苷肽浓度对反应速率常数 KN及 KA都有影响。当两者浓度比适宜时，会使 KN/KA出现最大值，即可获得最好的复性收率。固定氧化型谷胱苷肽，改变还原型谷胱苷肽浓度对伴侣辅助溶菌酶复性速率常数 KN和 KA影响都较小。六种酰胺类添加剂辅助溶菌酶复性，均存在最佳浓度使复性收率最大。其辅助溶菌酶复性机理与盐酸胍类似，KN值均随添加剂浓度的增大而减小，KA值则在最佳添加剂浓度下出现最小值，此时，KN/KA值最大，复性收率 r 值最大。 流加作用耦合人工伴侣可使较高浓度的变性溶菌酶(2mg/ml)在较低的盐酸胍浓度下（1mol/L）达到完全复性。人工伴侣系统中 CTAB 是影响复性效果的重要因素，当β-CD 浓度一定时，CTAB 浓度存在最佳值，使复性收率最高。另外，盐酸胍与人工伴侣存在协同作用，当人工伴侣浓度和盐酸胍浓度适当时，能够获得较高的复性收率。 利用修正的流加结束后间歇阶段计算方法，分别对低、高酶浓度的复性动力学进行拟合，并用拟合得到的复性速率常数对不同酶浓度、不同盐酸胍浓度、不同流加时间下复性 24h 后的复性收率进行预测，通过对实验与模型计算结果的对比，证明了模型可准确地对低、高酶浓度的复性过程进行预测，具有一定的适用性。
王硕[5]2015年在《亲和双水相胶团萃取与荷电磁性粒子辅助蛋白质复性研究》文中认为蛋白质的分离纯化与体外复性是基因重组蛋白生产过程中的两个关键步骤。随着基因工程和发酵技术的快速发展,重组蛋白质的种类和表达量不断提高,急需研发高效的分离纯化和复性技术。本文研发了一种新型亲和双水相胶团系统用于蛋白质分离,以及两种荷电磁性纳米粒子用于辅助同电荷蛋白质复性。双水相胶团萃取是一种简单、快速的生物分离技术,但是选择性较低。本文开发了一种新型亲和双水相胶团系统,以提高其分离选择性,系统研究了该系统的性质及其蛋白质分离纯化性能。首先,通过在非离子表面活性剂Triton X-114(TX-114)上偶联亚氨基二乙酸(iminodiacetic acid,IDA)基团合成了可螯合镍离子的表面活性剂TX-Ni,研究了TX-Ni与TX-114混合溶液的性质。结果表明,二者在溶液中形成了混合胶束,但是由于空间位阻较大和静电排斥作用,TX-Ni的加入不利于胶团的形成,并且抑制了胶团间的聚集。加之IDA基团极性大、水化能力强,使系统的浊点温度随TX-Ni含量的增大而升高;无机盐对浊点的影响则符合Hofmeister离子序列,可以通过加入亲液离子降低浊点,使萃取在较低的温度下进行。将亲和双水相胶团系统应用于蛋白质的分离纯化,研究了带有六组氨酸标签的重组绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)和溶菌酶在亲和双水相胶团系统中的分配行为。研究发现,亲和双水相胶团系统对富含组氨酸的蛋白质具有高选择性,在TX-Ni的摩尔分率由0增大至0.1时EGFP的分配系数从0.6增大到12.4,提高了20倍。p H和盐浓度对分配系数的影响显着,说明亲和作用在萃取过程中占主导地位。最后,将该亲和双水相胶团系统用于细菌裂解液中萃取EGFP,终产物纯度可达70%,收率大于80%。近年的研究表明,表面修饰有聚电解质的聚合物微球能够有效抑制同电荷蛋白质的聚集,从而辅助蛋白质复性。由于微球粒径越小、电荷密度越高,辅助复性的效果越好,本文致力于研发高电荷修饰密度的磁性纳米粒子。以N,N,N-叁甲基-3-(2-甲基烯丙酰氨基)-1-氯化丙铵([3-(methacryloylamino)propyl]-trimethylammonium chloride,MAPTAC)和甲基丙烯酸(methacrylic acid,MAA)为单体,通过原子转移自由基聚合反应,在Fe3O4纳米颗粒表面修饰聚电解质。研究表明,制备的阳离子磁性纳米粒子Fe3O4@PMAPTAC和阴离子磁性纳米粒子Fe3O4@PMAA可以具有较高的电荷密度,对蛋白质的静态吸附容量较高。因为颗粒表面的非特异性吸附较强,聚合物链较长时才能获得好的辅助复性效果。同时,荷电磁性纳米粒子可以用外加磁场进行快速分离与回收利用。
董晓燕[6]2005年在《辅助因子促进蛋白质复性的研究》文中研究指明蛋白质的体外复性研究不仅对基因工程重组蛋白质的生产具有重要意义,而且对探索蛋白质错误折迭导致疾病的机理也具有积极的指导作用。本文以变性还原溶菌酶为模型蛋白质,研究了不同折迭辅助因子对促进蛋白质复性的作用;复性动力学特性;以及辅助因子与色谱耦合作用提高蛋白质复性收率的途径。首先研究了分子伴侣,固定化分子伴侣以及固定化分子伴侣色谱辅助蛋白质复性特性。结果表明,在1 mol/L的最佳盐酸胍浓度下,固定化分子伴侣色谱法的最高复性收率可达到97%,复性产率达到54 mg/L.h,是尺寸排阻色谱法的4倍,证明固定化分子伴侣色谱复性方法在高通量复性方面具有明显的优势。为了解明分子伴侣辅助蛋白质复性的动力学特性,建立了分子内折迭与分子间聚集的竞争反应动力学模型。模型分析表明,分子伴侣的存在可有效抑制聚集体的生成,降低聚集体反应级数(为2级反应);叁磷酸腺苷(ATP)作为多肽链释放驱动剂是十分重要的,GroEL和ATP的同时作用可提高复性速率2倍以上;在一定的酶浓度下,添加适当GroEL和ATP浓度,可实现蛋白质的高收率和高速度复性。其次研究了人工伴侣系统,即十六烷基叁甲基溴化胺(CTAB)+β-环糊精(β-CD)促进高浓度变性溶菌酶的复性作用。结果表明,人工伴侣系统的辅助复性收率较直接稀释的自发复性提高约70%,比仅有β-CD存在下的复性提高约40%。动力学分析表明,人工伴侣存在下聚集体的生成为叁级反应,与直接稀释复性相同;盐酸胍和人工伴侣的作用都是抑制聚集体的生成,并且两者具有协同作用,利用此协同效应,可使高浓度的酶(1mg/mL)获得高收率复性(>80%)。此外,若有人工伴侣的存在,在较低浓度的盐酸胍条件下就可实现快速、高收率的蛋白质复性。根据上述人工伴侣辅助复性的研究成果,提出了尺寸排阻色谱与人工伴侣耦合作用促进蛋白质复性的耦合复性方法,并实验证明该方法的有效性。利用此方法,获得较高的复性收率的色谱流速高于单纯的尺寸排阻色谱,因此利用耦合色谱有利于提高蛋白质复性产率。另外,该方法还可实现连续色谱复性,因此可获得较高的产物浓度和复性收率,具有实际应用前景。最后,研究了各种简单稀释添加剂的辅助复性效果和动力学特性。证明添加剂可分为两类,一类如乙酰胺、硫脲、丙酮和精氨酸,它们与盐酸胍类似,既抑制分子间聚集,又抑制分子内折迭,因此,存在最佳浓度使复性收率最高;另一类如甘油,为天然蛋白质稳定剂,可促进分子内折迭,提高复性速率和收率。但达到一定浓度后继续增大其浓度对复性收率影响很小。
韩广杰[7]2013年在《核糖核酸酶A包含体高效复性方法的研究》文中进行了进一步梳理受二硫键正确生成速率慢和蛋白质聚集的影响，核糖核酸酶A（RNase A）包含体的高浓度复性成为制约RNase A大规模生产的主要因素。因此，本文从促进二硫键形成和抑制蛋白质聚集两方面，研究开发了辅助RNase A包含体高效复性的方法。为了提高RNase A内二硫键正确生成的速率，本研究提出以4-巯基苯乙酸为还原剂（ArSH）、己酰胱胺(HCA)为氧化剂组成新型氧化还原系统（ArSH/HCA）辅助RNase A复性。研究结果显示，相对于传统的氧化还原系统（还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽，GSH/GSSG），ArSH/HCA可以显着加速RNase A的复性，使变性还原的商品RNase A（0.3mg/mL）2h的复性收率达94%，复性速度提高2倍；亦使RNase A包含体（含RNase A0.3mg/mL）3h的复性收率达89%，复性时间缩短了60%。体现出新的氧化还原系统辅助RNase A复性的优势。高浓度RNase A包含体复性时，蛋白质聚集是复性收率低下的主要原因。为了解决这一问题，本研究首先根据本研究室前人发现的同电荷介质通过诱导蛋白质分子在带电介质表面定向排列，从而降低蛋白质聚集促进复性的机理，制备了电荷密度不同的带电介质，考察了它们辅助高浓度RNase A包含体的复性效果。结果显示，带电荷介质可使RNase A包含体（蛋白总浓度为1.4mg/mL，RNase A浓度为0.9mg/mL）的复性收率达63%，较稀释复性收率（49%）提高29%。同时发现，高电荷密度介质在低浓度范围内即可获得显着的辅助复性效果，体现出其在实际应用中的优势。另外，本研究还考察了人工分子伴侣系统（十六烷基叁甲基溴化铵（CTAB）/β-环糊精（β-CD））与新氧化还原系统耦合辅助高浓度RNase A包含体的复性。研究发现，在低脲素浓度(0.8mol/L)时，人工分子伴侣可抑制蛋白质聚集，显着提高RNase A的复性收率，使0.9mg/mL RNase A（包含体蛋白质浓度为1.4mg/mL）复性收率达77%，较稀释复性收率（49%）提高57%。而在高脲素浓度（1.6mol/L）和高包含体浓度（总蛋白质为2.3mg/mL，RNase A浓度为1.5mg/mL）时，不仅复性收率可达62%，而且CTAB还有选择性沉淀杂质蛋白质、纯化RNase A的作用，使RNase A包含体纯度从复性前的65%提高至复性后的87%。上述研究结果对实现高浓度RNase A包含体的高效复性和纯化具有实际指导意义。
刘洋, 刘燕, 郭荣[8]2007年在《β-环糊精对蛋白-表面活性剂相互作用的调控》文中进行了进一步梳理体外复性是从基因工程包含体中获得活性蛋白质的主要手段,受分子伴侣辅助蛋白质折迭机制的启发而开发的人工伴侣系统也可促进蛋白质复性。人工伴侣系统由表面活性剂和环糊精构成,具有成本低廉、性质稳定等优点,但是,该系统促进蛋白质复性过程的明确机理至今尚未得以解决。
肖庆敏[9]2003年在《添加剂辅助变性碳酸脱水酶复性的研究》文中进行了进一步梳理本文研究了不同添加剂对促进变性牛碳酸脱水酶(CAB)的复性作用。考察了各种因素(添加剂浓度、pH值、温度和较低盐酸胍浓度下添加剂浓度)对复性收率的影响。并应用相关动力学模型,对酰胺化合物辅助CAB复性的动力学过程进行了深入分析,探讨了乙酰胺促进CAB复性的机理,试验了其它酰胺化合物对CAB复性的可能性。结果表明,乙酰胺、脲、硫脲、丙酮、β-CD、CTAB+β-CD 和Tween 40+β-CD均能有效促进变性CAB复性。β-CD、CTAB+β-CD 和Tween 40+β-CD随着浓度增大,促进作用增强;而乙酰胺、脲、硫脲均存在最佳浓度使变性CAB复性收率最大。乙酰胺、脲、硫脲、丙酮等添加剂不改变复性液的pH值,均可在较宽的pH范围(5.5~8.5)内促进CAB复性;添加剂的加入改变了CAB复性收率不随温度变化的规律,脲、乙酰胺在37℃、硫脲在45 ℃时复性收率最大。利用叁级反应动力学方程拟和酰胺化合物辅助CAB复性的动力学过程。结果表明,模型计算值与实验数据能较好吻合。酰胺化合物与盐酸胍类似,复性速率常数 KN值大于没有添加剂时的自发复性,但随添加剂浓度增加而降低,聚集体生成速率常数KA值则在最佳添加剂浓度下出现最小值,从而使KN/KA值最大,复性收率r值最大。降低复性液中盐酸胍浓度,适当提高添加剂浓度,乙酰胺和脲仍可使变性CAB得到同样的复性效果;而硫脲必须在一定浓度的盐酸胍存在下,才能有效促进CAB复性。由于高浓度乙酰胺会引起蛋白质的不可逆变性,因此乙酰胺虽可用做辅助蛋白质复性的有效添加剂,但不能作为复性蛋白质的变性剂使用。为了进一步探明乙酰胺辅助变性CAB复性的作用机理,根据上述结果进一步对类似化合物如含有酰胺基团的甲酰胺、丙酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺促进变性CAB的复性作用进行了研究,发现它们均能有效地促进CAB复性,无论从其辅助CAB复性的动力学特性,还是随pH和温度的变化规律都与乙酰胺相似,因此认为酰胺基团对蛋白质复性的促进作用具有较大的贡献。
王祺[10]2017年在《高压下蛋白质折迭、修饰及装载药物的过程研究》文中研究指明高压对蛋白质的影响在生物过程中有应用潜力。本论文以蛋白质生产的下游过程为对象,探索高压对蛋白质复性、蛋白质修饰和蛋白质装载药物这叁个单元的作用,发展了蛋白包涵体高浓度复性、蛋白质的高压聚乙二醇修饰和高压下蛋白纳米笼装载小分子药物技术,主要创新点如下:(1)开发了高压下直接溶解并复性重组人睫状神经营养因子(rhCNTF)包涵体的新过程。通过压力作用,有效抑制了传统稀释复性过程中极易生成的疏水聚集体,当蛋白浓度为4 mg/mL时,200 MPa压力作用16 h可以获得近100%的复性收率,是现有文献报道的最高值,解决了高复性浓度与高复性收率难以兼顾的问题。通过强阴离子交换层析获得了 rhCNTF,纯度高于95%,具有与标准品相似的二/叁级结构和生物活性,整体收率为54.1%,高于传统方法(36.7%)。(2)建立了强疏水性的重组人干扰素β-1b(rhIFN β-1b)包涵体的高压复性工艺。使用8M脲结合1%TritonX-100溶解杂蛋白,提升包涵体中目标蛋白纯度至65%。然后在320 MPa压力下辅以0.4%Zw3-14,0.5 M Arg和5 mM DTT作用rhIFN β-1b包涵体16 h,在4 mg/mL初始蛋白浓度条件下达到100%的质量收率和近80%的复性收率。通过强阳离子交换和丁基硫疏水层析的组合,获得了rhIFN β-1b,纯度大于95%,并且具有与标准品相似的二/叁级结构和生物活性,整体收率为37.8%,高于传统制备方法(23.1%)。(3)提出了高压辅助蛋白质聚乙二醇(PEG)修饰策略。利用压力作用提升蛋白表面被修饰位点氨基酸残基的暴露程度,增大PEG修饰试剂与蛋白被修饰位点的可及程度,减弱常规修饰反应参数的影响,增强修饰反应效率。在250 MPa压力,pH 7.0条件下按修饰摩尔比1:1.2(rhCNTF:mPEG-MAL)使用mPEG-40kDa-MAL修饰rhCNTF蛋白5 h后修饰率达到近90%,相同条件下的常压修饰率不足5%。200 MPa压力下使用mPEG-40kDa-MAL和mPEG-20kDa-MAL定点修饰rhG-CSF时分别能够提升蛋白单修饰率达到32%和45%,而常压下几乎不发生修饰反应。在250 MPa压力下使用mPEG-30kDa-ALD定点修饰rhG-CSF氮末端氨基的修饰率为82%,相较于常压修饰结果(72.4%)提升幅度不明显。(4)尝试了高压下重链铁蛋白(HFn)纳米颗粒装载阿霉素(DOX)药物的方法。在500 MPa压力pH 5.5条件下,DOX可以被载入HFn纳米球中。与此同时,在高压下辅以20 mM Arg几乎可以完全抑制蛋白沉淀,实现HFn蛋白的100%回收。高压处理结束后通过梯度降压策略以及将样品在常压pH 7.4条件下继续透析放置,进一步提升了药物装载比例至32:1(DOX:HFn)。通过高压方法制备的HFn-DOX纳米颗粒中不含有聚集体而且在长期存储过程中药物泄露比例低于20%,在体内外相比单独使用DOX具有更高的抗肿瘤生物活性。使用脱盐层析的方法可以分离并回收未被装载的DOX药物。
参考文献：
[1]. 表面活性剂辅助蛋白质复性过程机理研究[D]. 王君. 清华大学. 2004
[2]. 色素亲和反胶团辅助溶菌酶复性的研究[D]. 吴晓月. 天津大学. 2006
[3]. 表面活性剂辅助溶菌酶复性:表面活性剂-蛋白质复合物结构分析[J]. 王君, 卢滇楠, 林莹, 周蕊, 刘铮. 化工学报. 2004
[4]. 添加剂与流加操作辅助变性溶菌酶复性动力学[D]. 史广泉. 天津大学. 2004
[5]. 亲和双水相胶团萃取与荷电磁性粒子辅助蛋白质复性研究[D]. 王硕. 天津大学. 2015
[6]. 辅助因子促进蛋白质复性的研究[D]. 董晓燕. 天津大学. 2005
[7]. 核糖核酸酶A包含体高效复性方法的研究[D]. 韩广杰. 天津大学. 2013
[8]. β-环糊精对蛋白-表面活性剂相互作用的调控[C]. 刘洋, 刘燕, 郭荣. 中国化学会第十一届胶体与界面化学会议论文摘要集. 2007
[9]. 添加剂辅助变性碳酸脱水酶复性的研究[D]. 肖庆敏. 天津大学. 2003
[10]. 高压下蛋白质折迭、修饰及装载药物的过程研究[D]. 王祺. 中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所). 2017
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