佚名[1]2004年在《肿瘤生物标志物与肿瘤转移》文中进行了进一步梳理14—3—3zeta蛋白对肿瘤转移抑制作用的探讨陈惠华’王妍徐元基杜芝燕陆应麟军事医学科学院基础医学研究所,北京,100850 摘要目的:探讨14—3—3zeta蛋白与肿瘤转移的关系。, 方法:通过联合抑制消减杂交和基因芯片技术筛选在肺巨细胞癌高、低转移株中表达水平存在显着差异的序列,其中一条与14—3—3zeta高度同源。在RNA和蛋白水平对其表达水平进行验证;构建14—3—3zeta的正反义真核表达载体并分别转染肺巨细胞癌高、低转移株;并对转染后细胞的增殖能力、黏附能力以及迁移能力等生物学行为进行研究。
雷斌[2]2013年在《非小细胞肺癌PBK/TOPK与Ki-67及p53表达的关系及预后意义》文中研究表明研究背景：近年的研究表明肺癌已成为世界上最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的80%～85%。一直以来,对肺癌的早期诊断及治疗缺乏有效的手段,手术切除、化疗和放疗是非小细胞肺癌患者治疗的主要方式。然而,患者术后的生存情况并不理想,5年的生存率不足20%,肿瘤转移及复发决定着患者术后的生存。因此,研究与肺癌发生、发展及转移相关的分子标志物,探讨其作用机制对肺癌的早期诊断、治疗及预后评估具有极其重要的意义。PBK/TOPK(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase)是一种新颖的蛋白激酶,最早于淋巴因子激活的杀伤性T细胞(T-LAK)中发现,具有322个氨基酸,与恶性肿瘤的增殖调控密切相关,在恶性肿瘤中呈高表达,除正常睾丸组织和一些胚胎组织外,其它正常组织中均难以检测到其表达。Ki-67是一种较为常见的细胞增殖标记物,现广泛应用于临床病理诊断中。p53基因是一种抑癌基因,分为野生型及突变型两种亚型,其中野生型p53可调节DNA的修复及细胞的凋亡,突变型p53与肿瘤的形成密切相关。关于PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的作用机制是否与Ki-67及p53有关,未见相关报道,为此我们进行了研究。研究目的及内容：1.探讨PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的表达及其预后意义；2.探讨PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中表达的相关性及其预后意义；3.探讨PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响；4.探讨PBK/TOPK在非小细胞肺癌细胞中的表达与Ki-67及p53的关系；材料及方法：1. PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达及其预后意义分析免疫组化SP法检测30例正常成人肺组织、30例肺良性病变、279例非小细胞肺癌原发灶及32例淋巴结转移灶中PBK/TOPK蛋白的表达；用计算机ImageproPlus6.0(IPP)图像分析软件定量测试蛋白表达的阳性单位(PU值),结合临床相关病理资料及随访资料进行统计学分析及术后生存分析。2. PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中表达的相关性及其预后意义分析免疫组化SP法检测279例非小细胞肺癌组织中PBK/TOPK、Ki-67及p53蛋白的表达,采用半定量方法对免疫组化结果进行分析,探讨PBK/TOPK蛋白与Ki-67及p53蛋白表达的相关性,结合临床相关病理资料及随访资料进行术后生存分析。半定量分析方法及参考标准：阴性：无色或淡黄色；阳性：棕黄色或棕褐色；分别统计PBK/TOPK、Ki-67及p53在非小细胞肺癌组织中阳性表达细胞的百分比,取其平均值作为半定量判定的临界值。3. PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响实验分为干扰组和对照组,选用PBK/TOPK高表达的A549和GLC-82两株腺癌细胞同时进行。干扰组采用siRNA干扰片段对两株细胞中PBK/TOPK的表达进行干扰,使PBK/TOPK表达明显下调,对照组未进行任何处理。通过划痕实验和Transwell实验检测PBK/TOPK下调后细胞的迁移能力,同时采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法及台盼蓝染色法检测PBK/TOPK下调后细胞的增殖及存活能力。4. PBK/TOPK在非小细胞肺癌细胞中的表达与Ki-67及p53的关系采用四株肺癌细胞,其中包括3株肺腺癌细胞(A549、GLC-82和H358)及1株大细胞肺癌细胞(H460),通过荧光定量PCR(QRT-PCR)、免疫印迹(Western blot)及细胞滴片免疫组化法检测四种细胞株中PBK/TOPK和p53的表达。同时采用细胞滴片免疫组化法检测Ki-67蛋白的表达,采用IPP图像分析软件定量检测蛋白表达的阳性单位(PU值)。对PBK/TOPK表达较高的两株细胞株进行siRNA干扰,采用QRT-PCR和Western blot验证其干扰效率,再分别检测Ki-67及p53的表达,探讨PBK/TOPK下调是否会影响Ki-67及p53的表达。5.统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。两样本均数间的比较采用独立样本t检验。多样本均数间的比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间多重比较采用LSD,若方差不齐,组间的多重比较采用Dunnett's T3检验。采用Spearman秩相关进行相关分析。术后总体生存率的比较采用Pearsonx2检验,利用Kaplan-Meier法log rank检验进行单因素生存分析,多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型。结果：1. PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达及其预后意义分析免疫组化定量分析表明PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变、非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的表达差异具有非常的显着性(P=0.000),其中淋巴结转移灶中PBK/TOPK表达的PU值高于原发灶、肺良性病变及正常肺组织。PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的表达与组织学类型、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关(P值分别为0.027、0.000、0.000、0.000),而与其它临床病理特征无明显相关(P>0.05)。免疫组化半定量分析结果显示PBK/TOPK在正常肺组织、肺良性病变及非小细胞肺癌原发灶及淋巴结转移灶中的高表达率分别为：0%、0%、44.8%、75%,组内比较差异具有非常的显着性(P=0.000)。Kaplan-Meier单因素生存分析结果表明PBK/TOPK蛋白的表达、淋巴结转移、TNM分期及远处转移与非小细胞肺癌患者的预后有关(P值均为0.000)。Cox比例风险回归模型分析表明PBK/TOPK的表达、淋巴结转移及TNM分期是影响非小细胞肺癌患者预后评价的因素(P值分别为0.000、0.009、0.022)。2. PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中表达的相关性及其预后意义分析在279例非小细胞肺癌原发灶组织中PBK/TOPK、Ki-67与p53的高表达率分别为44.8%、64.9%、49.1%。PBK/TOPK与Ki-67及p53的表达均具有正相关性(r=0.249,P=0.000；r=0.153,P=0.000)。在本研究中PBK/TOPK、Ki-67及p53蛋白高表达患者的5年生存率分别为：12.4%、18.2%、21.2%。单因素生存分析结果表明PBK/TOPK蛋白、Ki-67蛋白及p53蛋白的表达均与非小细胞肺癌患者的预后有关(P值分别为0.000、0.000、0.003)。PBK低/Ki-67低患者的术后中位生存期明显高于PBK低/Ki-67高及PBK高/Ki-67高患者(P=0.029；P=0.000)；PBK低/p53低患者的术后中位生存期明显高于PBK高/p53低及PBK高/p53高患者(P=0.001；P=0.000)。Cox比例风险回归模型的多因素分析表明PBK/TOPK、Ki-67及p53的表达均可作为影响非小细胞肺癌患者预后评估的因素(P值分别为0.000、0.015、0.034)。3. PBK/TOPK下调对非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活能力的影响经siRNA干扰后,GLC-82及A549细胞中的PBK/TOPKmRNA表达水平下调分别约83.6%、69.9%。划痕实验及Transwell实验结果表明PBK/TOPK下调可明显抑制细胞的迁移。其中,在A549与GLC-82细胞的划痕实验中,干扰组细胞的迁移距离显着低于对照组(P值分别为0.006、0.000)。在A549与GLC-82细胞的Transwell实验中,干扰组的细胞迁移数量也明显低于对照组(P值均为0.000)。MTT实验结果表明PBK/TOPK下调可抑制细胞的增殖。在A549与GLC-82细胞中,干扰组细胞的增殖能力明显低于对照组,干扰48小时后差异较为明显(P值均为0.000)。台盼蓝染色结果表明PBK/TOPK下调可降低细胞的存活能力。在A549与GLC-82细胞中,干扰组与对照组相比,PBK/TOPK下调后细胞的存活率均明显降低(P值分别为0.002、0.005)。4. PBK/TOPK在非小细胞肺癌细胞中的表达与Ki-67及p53的关系经QRT-PCR检测发现PBK/TOPK mRNA在A549、GLC-82、H358及H460四株肺癌细胞中均有表达,其中在H358及GLC-82细胞中表达较高,在A549及H460细胞中表达较低。Western blot及细胞滴片免疫组化检测结果均表明PBK/TOPK蛋白在H358及GLC-82细胞中表达较高,在A549及H460细胞中表达较低。PBK/TOPK蛋白在四种细胞中表达的PU值比较,差异具有显着性(P=0.000)。经QRT-PCR检测发现突变型p53mRNA在A549、GLC-82、H358及H460四种肺癌细胞中均有表达,其中在H358、H460及A549细胞中表达较高,在GLC-82细胞中表达较低；Western blot及细胞免疫组化检测结果表明p53蛋白在H358、H460及A549细胞中表达较高,在GLC-82细胞中表达较低。p53蛋白在四种细胞中表达的PU值比较,差异具有非常的显着性(P=0.000)。细胞滴片免疫组化检测Ki-67蛋白在四种肺癌细胞中的表达,结果表明Ki-67在四种细胞中均呈高表达,PU值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。将高表达PBK/TOPK的A549及GLC-82细胞分别经siRNA干扰,PBK/TOPK表达明显下调,A549和GLC-82细胞中PBK/TOPK mRNA下调分别为69.9%、83.6%,检测突变型p53mRNA的表达,发现PBK/TOPK下调可促使其下调,其中在A549和GLC-82细胞中p53mRNA表达下调分别为74.5%、68.5%,p53蛋白表达水平也下调。细胞滴片免疫组化检测表明PBK/TOPK下调后A549和GLC-82细胞中Ki-67蛋白表达水平也出现了明显下调,与对照组相比,PU值明显减小(P值均为0.000)。结论：1. PBK/TOPK的表达与非小细胞肺癌的形成及转移有关；PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的表达与组织学类型、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关,其表达可作为影响非小细胞肺癌患者预后评估的要素。2. PBK/TOPK与Ki-67及p53在非小细胞肺癌中的表达均呈正相关性,PBK高/Ki-67高及PBK高/p53高的患者预后较差。3.Ki-67及p53的高表达与非小细胞肺癌患者预后不良相关,均可作为影响非小细胞肺癌患者预后评估的要素。4. PBK/TOPK具有促进非小细胞肺癌细胞迁移、增殖及存活的能力。5. PBK/TOPK在非小细胞肺癌中的作用机制与Ki-67及p53密切相关。PBK/TOPK的表达可调控p53, PBK/TOPK表达下调可使突变型p53mRNA及蛋白表达下调。此外,PBK/TOPK表达下调可抑制Ki-67蛋白的表达。
李咏梅[3]2015年在《HIF-1α对低氧环境中脑胶质瘤细胞的作用及相关机制研究》文中进行了进一步梳理迄今为止,脑胶质瘤的治疗仍无未获得突破性进展,究其原因主要与脑胶质瘤本身所具有的恶性特质有关,包括侵袭性强、易转移复发,放疗耐受及化疗抵抗等方面,已经证实这些恶性特质与其所生长的低氧微环境密切相关。大量的研究发现低氧通过HIF-1α (hypoxia inducible factor-1α,低氧诱导因子1α)的作用促进与血管生成、转移、糖酵解及耐药相关等基因的表达,从而赋予脑胶质瘤细胞更强的恶性生物学行为。HIF-1α是肿瘤低氧环境下最重要的转录因子,它和HIF-1β形成HIF-1转录复合体后与许多基因启动子内部的HRE结合,引发下游基因的转录,涉及能量代谢、血管生成、细胞分化、细胞增殖和调亡、浸润转移及治疗抵抗。现有研究发现HIF-1α在肿瘤细胞的增殖和凋亡中发挥双向调控的作用,一方面可促进凋亡前体蛋白包括BNIP3、Bax、Bak等的转录,增强抑癌蛋白p53的稳定性从而促进细胞凋亡,另一方面可通过上调抗凋亡因子Bcl-2等因子的作用抑制肿瘤细胞的凋亡,参与发挥低氧诱导的凋亡及对放化疗的抵抗。介于HIF-1α在脑胶质瘤细胞凋亡和增殖中的重要地位,一些研究利用HIF-1α基因沉默的方法对低氧下脑胶质瘤细胞生物学行为的影响开展了相关研究,结果发现HIF-1α沉默可在一定程度上增强脑胶质瘤细胞对放化疗促凋亡作用,从而推断HIF-1α是低氧下脑胶质瘤产生凋亡逃避及放化疗抵抗的主要原因。另外的研究则发现HIF-1α沉默并未明显减弱脑胶质瘤细胞的凋亡抵抗特性,提示低氧下的凋亡逃避可能是多种基因共同参与下的综合作用。综合相关研究发现不同细胞类型HIF-1α在凋亡逃避中所起的作用有所不同,并且可能与肿瘤细胞所处的具体低氧环境差异有关。突变的p53已失去抑癌作用,而在恶性程度更高的肿瘤组织中,同时存在突变的p53蛋白的集聚和HIF-1 α的高表达,二者之间有何交互作用,突变的p53的集聚是否仅作为肿瘤恶性程度的标志还是对低氧下的肿瘤细胞的凋亡逃避发挥作用,目前仍尚未完全明晰。最近有研究证实胶质瘤等实体瘤内存在梯度低氧现象,并认为梯度低氧导致了肿瘤内的不均质性,表现为远隔血管区域的细胞恶性程度更高,低氧程度也更为严重,距离血管较近区域的细胞恶性程度则较低。对于肿瘤细胞耐受低氧的极限,不同来源的肿瘤细胞有所不同,严重低氧可能会促进细胞死亡,也部分细胞则可能会从极限低氧环境中存活。由于受普通培养箱最低氧浓度限制,对于脑胶质细胞究竟能耐受何种程度的低氧,以及在极度低氧下的细胞生存状态及相关的分子机制如何尚缺乏深入的研究?肿瘤细胞的低氧微环境中往往伴有能量物质的缺乏,由此推测低氧微环境中伴随随葡萄糖的缺乏,但对于低氧伴随葡萄糖缺乏的复杂环境下脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的调控尚缺乏系统深入的研究。并且对于HIF-1α不同低氧微环境下脑胶质瘤细胞具体作用及相关机制尚不明确。本研究利用最低氧浓度设置到0.1%的低氧控制器设定不同低氧浓度模拟肿瘤梯度低氧状态,同时结合葡萄糖剥夺的条件模拟脑胶质瘤体内生理状态下的低氧环境,系统研究不同低氧环境下脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的差异,以推测不同低氧环境下凋亡抵抗作用的强弱,为筛选不同低氧环境下的治疗靶标提供依据。同时通过不同低氧环境下HIF-1α和mt-p53的表达变化规律的研究,推测二者在其中的可能作用。利用所构建慢病毒介导shRNA干扰HIF-1α的T98G细胞株,研究HIF-1α沉默对不同低氧环境下脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响,再次验证HIF-1α在脑胶质瘤细胞低氧保护中的作用。更重要的是,通过研究HIF-1α沉默对无糖逆境中脑胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响,分析HIF-1α干扰及葡萄糖剥夺之间的交互作用,为寻找一种极限低氧环境下的更为有效治疗靶标提供依据及思路。第一部分梯度低氧及葡萄糖剥夺对人脑胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响目的：1.探讨梯度低氧对脑胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响,寻找低氧诱导T98G细胞凋亡的基线水平。1.探讨葡萄糖剥夺对人脑胶质瘤细胞凋亡和增殖的影响,研究低氧对葡萄糖剥夺诱导脑胶质瘤细胞凋亡中的作用。方法：1.T98G细胞分别在不同葡萄糖条件下进行梯度低氧(3%O2,0.5O2%,0.1O2%)培养,相应时间段显微镜下观察细胞存活情况。2.培养24h,48h,72h后行Hoechst33342染色荧光显微镜观察细胞凋亡情况,行AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡,分析凋亡率。3.按实验分组处理24h、48h、72h、96h及120h后用MTT法检测细胞增殖情况,利用酶标仪在492nm波长下测定各孔吸光值(A值),计算增殖抑制率并绘制细胞生长曲线。结果：1.荧光显微镜观察细胞凋亡(Hoechst染色)：各梯度低氧组细胞均生长良好,胞核完整,无明显细胞凋亡。常氧无糖组及各梯度低氧无糖组48h、72h均有明显细胞凋亡,Hoechst33342染色荧光显微镜下可见凋亡小体。48小时凋亡最为明显的是常氧无糖组,凋亡较3%02无糖组0.5%02无糖组及0.1%02无糖组明显,72h凋亡最为明显的是0.1%低氧无糖组。常氧无糖组及各低氧无糖组均出现细胞形态改变：细胞体积变小,呈细长树枝状,突起明显延长。2.2 AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡：常氧常糖及各低氧常糖在72h内均无明显细胞凋亡(P>0.05);而各无糖组(常氧无糖及各低氧无糖组)均有明显细胞凋亡(P<0.01),且随时间延长,细胞凋亡率递增(P<0.01),3%、0.5%低氧无糖组细胞凋亡率明显低于常氧无糖组(P<0.01)。0.1%低氧无糖组24h及48h细胞凋亡率比常氧无糖组低,但72h时高于常氧无糖组(P<0.01)。3.MTT结果：单纯低氧可促进T98G细胞增殖,各低氧常糖组细胞生长良好,呈明显增殖趋势,与常氧状态相比,3%O2及0.5%O2可明显促进细胞增殖(P<0.05),0.1%低氧组增殖速度减慢。常氧无糖、3%、0.5%和0.1%低氧无糖下增殖明显抑制,曲线走势差异明显(P<0.01),72h,3%、0.5%低氧无糖组细胞抑制程度比常氧无糖组轻,而0.1%低氧无糖组细胞增殖抑制最为显着。结论：1.适度低氧促进脑胶质瘤细胞存活及增殖,且当氧浓度低至0.1%,72小时以内仍无明显凋亡,但较常氧下增殖减慢,提示极限低氧在短期内不能作为独立因素诱导胶质瘤细胞发生凋亡,脑胶质瘤细胞具有较强的耐低氧的能力。2.葡萄糖剥夺无论在常氧或者是低氧下均可诱导脑胶质瘤细胞发生凋亡,提示葡萄糖剥夺可独立因素诱导脑胶质瘤细胞快速发生凋亡,脑胶质瘤对葡萄糖剥夺耐受较差。3.0.5%及以上浓度的适度低氧对无糖逆境中脑胶质瘤细胞有一定的抑凋亡和促增殖作用。极度低氧浓度(0.1%)仅在短期内对无糖逆境中胶质瘤细胞具有抑凋亡作用,但随着时间的延长,这种抗无糖逆境抑制凋亡的能力将消失。第二部分：不同低氧及葡萄糖条件对脑胶质瘤细胞HIF-1α及mt-p53表达的调控及与凋亡的相关性研究目的：1.探讨不同低氧及葡萄糖条件下的脑胶质瘤T98G细胞中HIF-1α及mt-p53的表达差异。2.分析不同低氧及葡萄糖条件下的脑胶质瘤细胞增殖和凋亡与HIF-1α及mt-p53表达间的可能关系3.推测HIF-1α及mt-p53在凋亡抵抗中的可能作用。方法：1.将T98G细胞置于不同的氧浓度(21%02、0.5%02、0.1%02)及葡萄糖(常糖及无糖)条件下培养24h、48h、72h,于相应时间段提取总RNA,行real-time PCR检测不同氧浓度条件及葡萄糖条件下的HIF-1α的表达差异。2.将T98G细胞置于不同的氧浓度(21%02、0.5%02、0.1%02)及葡萄糖(常糖及无糖)条件下培养24h、48h、72h,于相应时间段提取总蛋白,行Western Blot检测各组相应时间段HIF-1α及突变的P53蛋白水平的表达变化。3.分析不同条件对HIF-1α及mt-p53的调控与胶质瘤细胞凋亡和增殖变化的相关性,推测二者在脑胶质瘤细胞不同氧浓度及葡萄糖条件下凋亡和增殖中的可能关系。结果：1. Real-time PCR结果显示：常氧常糖组HIF-1α mRNA叁个时间段的表达无明显变化。常氧无糖组的HIF-1α mRNA在24h表达短暂上调(P<0.01)随后明显降低。0.5%低氧无糖组及0.1%低氧无糖组的HIF-1α mRNA水平呈逐渐降低的趋势。0.1%低氧常糖组在72h则明显下调(P<0.01)。而0.5%低氧常糖组HIF-1α mRNA表达水平24h降低,48h后逐渐上调,72h明显上调。2. Western-blot结果示：常氧常糖组HIF-1α 72h内保持较低表达水平,常氧无糖组24h表达量与常氧常糖组比较有明显升高(P<0.05),72h降低至较低水平。0.1%低氧常糖组及0.5%低氧常糖组HIF-1α表达量均于48h上调(P<0.05),72h仍维持在较高水平(P<0.05)。0.1%低氧无糖组及0.5%低氧无糖组,24h HIF-1α表达量上调,48h达最高,72h仍明显高于常氧常糖组(P<0.05)。3.不同培养条件下mt-p53表达水平：常氧常糖下,mt-p53蛋白在T98G细胞中有明显表达,72h内未见明显变化。常氧无糖组mt-p53蛋白表达24h下调,72h降至最低水平。0.1%低氧常糖组及0.5%的低氧常糖24h、48h及72h表达量上调,明显高于常氧常糖组(P<0.05)。0.1%低氧无糖组及0.5%低氧无糖于48h开始下调,72h降至较低水平。4.常氧无糖组HIF-1α蛋白表达量在72h无明显上调,而细胞凋亡仍持续增加,而0.1%低氧常糖组及0.5%低氧常糖组72h HIF-1α表达量明显上调,凋亡减少,0.5%低氧无糖组72hHIF-1α表达量明显上调,细胞凋亡少于常氧无糖组,经变量转化后Spearman相关分析结果为：细胞凋亡率变化与HIF-1α表达变化呈负相关(r=-0.707,p<0.05)。常氧无糖组及0.1%低氧常糖组及0.5%低氧常糖组,0.1%低氧无糖组及0.5%低氧无糖组mt-p53蛋白的表达水平的变化与T98G细胞凋亡率的变化呈负相关(r=-0.933,p<0.01),即mt-p53蛋白水平降低,细胞凋亡越增高,蛋白表达水平增高,细胞凋亡率降低。低氧常糖组,48h及72h mt-p53蛋白的表达变化同与HIF-1α的蛋白表达变化呈正相关(r=1,p<0.01)。结论：1.极限低氧对HIF-1α的诱导发生在蛋白水平,而葡萄糖剥夺对HI-F1α诱导发生在mRNA水平。2.低氧对T98G细胞抑制凋亡的作用可能与HIF-1α蛋白表达上调有关,并且mt-1953在其中起协同作用,低氧对T98G无糖逆境的保护作用可能缘于HIF-1α及mt-1953蛋白表达的上调。3.葡萄糖剥夺对HIF-1α蛋白表达的上调为短期的应激反应。4.低氧可诱导mt-1953蛋白上调,而葡萄糖剥夺则诱导mt-p53下调。HIF-1α及mt-p53在低氧下均同时上调可能对脑胶质瘤细胞耐极限低氧中有协同作用。第叁部分稳定表达HIF-1α基因沉默的人脑胶质瘤细胞系的建立及验证目的：建立慢病毒介导的稳定HIF-1α干扰的人脑胶质瘤细胞系,并验证其在mRNA水平及蛋白水平的敲降效率。方法：1.慢病毒载体HIF-1α-sh9及HIF-1α-sh10及阴性对照scrambled shRNA(ctr)经测序鉴定、纯化,分别与PCMVΔ 8.1.PMD2-G经PEI共转染293T细胞,包装形成慢病毒颗粒。2.慢病毒感染T98G细胞系并经puromyxin抗性筛选。3.提取总RNA及总蛋白,行real-time PCR及Western Blot检测,验证HIF-1 α mRNA及蛋白水平的干扰效果,筛选出最有效的慢病毒载体,建立慢病毒介导的稳定表达HIF-1α基因沉默的人脑胶质瘤T98G细胞系。结果：1.已构建的重组慢病毒HIF-1α-shRNA载体9号(sh9)、10号(sh10)及阴性对照测序(ctr)测序结果正确,sh9、sh10及ctr成功包装成慢病毒颗粒后均可高效感染T98G细胞,经嘌呤霉素puromyxin筛选后无明显细胞死亡。2.0.5%低氧下24h两种质粒对HIF-1α mRNA水平的干扰效率均>90%,sh9、sh10分别为97.5%,96.25%。二者在0.5%低氧下,HIF-1α蛋白水平的敲降效率sh9、sh10分别为90.85%,76.59%。结论：两种重组慢病毒HIF-1α-shRNA载体可高效并稳定干扰T98G细胞内的HIF-1α的表达。第四部分慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1a对低氧下脑胶质瘤细胞凋亡及mt-p53表达的影响目的：1.研究shRNA干扰靶向抑制HIF-1α表达对脑胶质瘤细胞T98G细胞系在梯度低氧中增殖和凋亡的作用2. shRNA干扰靶向抑制HIF-1α表达对脑胶质瘤细胞T98G细胞系P53表达的影响,寻找HIF-1α及mt-p53之间可能的交互作用以及子低氧下对胶质瘤细胞凋亡和增殖的相关性。方法：1.将已构建成功的HIF-1α-shRNA T98G细胞株与阴性对照的T98G细胞株分别置于0.5%、0.1%及21%的氧浓度条件下培养24h、48h、72h、96h、120h,在相应时间点进行MTT检测,分析其增殖抑制率,绘制生长曲线。2.于21%、0.5%、0.1%的氧浓度条件下培养24h、48h、72h,在相应时间点行AnexinV FITC/PI双染,流式细胞仪检测分析其凋亡率3.同时行real time-PCR检测不同氧浓度条件下HIF-1α-shRNA-T98G细胞株及阴性对照T98G细胞株(ctr-T98G)不同时间段HIF-1α mRNA表达水平的差异。4. Western-Blot方法检测两者不同时间点HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表达,分析HIF-1α干扰对mt-p53表达的影响及二者的相关性,分析HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表达与T98G细胞凋亡和增殖的关系,探讨可能的分子途径。结果：1.MTT结果示：与对照细胞相比,无论是常氧或是0.1%低氧及0.5%低氧下,HIF-1 α基因沉默的T98G细胞增殖速度均有所减慢(P<0.05),并随时间的延长更加明显。2.流式细胞仪检测：常氧下,HIF-1α基因沉默的T98G细胞凋亡率较ctr组在各时间段无明显差异(P>0.05)。0.1%低氧、0.5%低氧下,HIF-1α基因沉默的T98G细胞凋亡率在低氧处理48h较ctr组明显增加,72h更加显着(P<0.05)。3.T98G细胞中HIF-1α基因在常氧及低氧下mRNA水平及蛋白水平均被有效沉默。在常氧下24h,48h及72h, HIF-1α mRNA水平较对照组下调分别达：96.9%,93.4%,91.5%,二者表达量均有显着性差异(P<0.01)；HIF-1α蛋白水平的显著下调达：69%,54%,43%。0.5%低氧下,24h,48h及72h,HIF-1α mRNA水平较对照组下调分别达93.5%,92.6%,88.36%：HIF-1α蛋白水平的下调达：67.8%,71.1%%,80.5%。0.1%低氧下,24h,48h及72h,HIF-1α mRNA水平较对照组下调分别达：97.5%,94.19%,90.3%,二者差异显着(P<0.01)。HIF-1α蛋白水平的下调达50.1%,60.9%,63.4%。Sh组各时间段较相对应的ctr组mt-p53蛋白均有不同程度的下调。4.在0.1%低氧及0.5%低氧下HIF-1α蛋白表达水平与T98G细胞凋亡率均呈负相关(r=-0.861, p=0.039; r=-0.625, p=0.037),与常氧下细胞凋亡率之间无明显相关。0.1%氧浓度下及0.5%氧浓度下,HIF-1α表达与mt-p53表达呈高度正相关,分别为：r=0.921, p=0.009, r=0.914, p=0.011。而常氧下,二者的表达则无相关性。结论：1. HIF-1α基因沉默可使人脑胶质瘤细胞T98G增殖速度明显减慢,但细胞仍可缓慢增殖。2. HIF-1α基因沉默使低氧下的人脑胶质瘤细胞T98G凋亡增多,随时间延长凋亡增加明显,凋亡率在20%以内。3. HIF-1α基因沉默可下调mt-p53蛋白的表达,二者在低氧下呈正相关。0.1%低氧及0.5%低氧下HIF-1α蛋白表达水平与T98G细胞凋亡率呈负相关。五部分慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1α表达对无糖逆境中脑胶质瘤细胞凋亡及mt-p53表达的影响目的：1.研究慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1a后,脑胶质瘤T98G细胞系在常氧无糖及低氧无糖中细胞凋亡和增殖差异,验证HIF-1α对低氧保护无糖逆境中脑胶质瘤细胞的作用。2.研究慢病毒介导RNA干扰抑制HIF-1a对T98G细胞在常氧无糖及低氧无糖下mt-p53表达的影响,分析HIF-1a在葡萄糖缺乏下与mt-p53的可能关系。方法：1.将已构建成功的HIF-1α基因敲降的T98G细胞(shRNA-HIF1α-T98G)细胞株与阴性对照(ctr-T98G)细胞株分别置于常氧常糖,常氧无糖,0.5%的低氧无糖下培养24h、48h、72h、96h、120h,在相应时间点进行MTT检测,分析其增殖抑制率,绘制生长曲线。2.于培养24h、48h、72h,在相应时间点行AnexinV FITC/PI双染,流式细胞仪检测分析其凋亡率。3.同时行Western Blot方法检测不同培养条件下shRNA-HIF1α-T98G细胞株及ctr-T98G细胞株不同时间段HIF-1α及mt-p53蛋白水平的表达水平。4.分析HIF-1α干扰对mt-p53的影响,探讨HIF-1α及p53在脑胶质瘤细胞低氧抗无糖逆境中的可能作用。结果：1. shRNA-HIF-1α-T98G及ctr-T98G各时间段在常氧无糖下随时间延长增殖明显抑制,二者间无显着性差异(p>0.05)。两者在低氧无糖下的细胞增殖也随时间延长明显抑制,shRNA-HIF-1α-T98G细胞增殖抑制程度明显高于ctr-T98G细胞,二者间有显着性差异(p<0.05),且高于常氧无糖下的ctr-T98G细胞。2. HIF-1α基因敲降的T98G细胞(shRNA-HIF1α-T98G)及与对照组细胞(ctr-T98G)各时间段在常氧无糖下均发生显着凋亡,并随时间延长,凋亡率明显增加,但二者间无明显差异(P>0.05)。各时间段,ctr-T98G在0.5%低氧无糖下的细胞凋亡率比常氧无糖低(P<0.05)；但shRNA-HIF1α-T98G细胞凋亡率明显高于常氧无糖下ctr-T98G(P<0.05)。3.低氧无糖下,HIF1α基因敲降后,T98G细胞凋亡率明显高于常氧无糖下,说明低氧抗无糖逆境的作用随着HIF1α的敲降而丧失,同时mt-p53的表达随之下调,提示在低氧无糖下mt-p53的表达受HIF1α的调控。而常氧无糖下,HIF1α基因敲降并未引起T98G细胞的凋亡率及mt-p53的表达的明显变化。结论：HIF-1α参与脑胶质瘤细胞低氧抗无糖逆境作用,HIF-1α表达上调减少了无糖逆境诱发的细胞凋亡,并调控mt-p53的表达,但mt-p53在低氧抗无糖逆境作用仍不明确。
林晓燕[4]2004年在《急性白血病中hMSH2 mRNA表达及P53蛋白表达的研究》文中研究指明目的：错配修复(mismatch repair，MMR)基因的功能主要是维持基因组稳定。DNA复制时会产生一些不配对的碱基对。MMR基因则负责修复这些错配碱基。当错配修复功能缺陷时细胞就会产生突变表型。人们在家族性非息肉性结肠癌的研究中认识了MMR基因突变，研究者发现人类MMR基因突变多集中在hMSH2。hMSH2是人类细胞中与E．Coli．MutS同源基因。近年来研究发现hMSH2在白血病中亦有一定突变率。这提示hMSH2缺陷可能是引起造血祖细胞恶性克隆增殖的原因之一。有关hMSH2表达缺失与急性白血病发生、发展的关系目前国内少见报道。在错配修复功能缺陷的细胞株中已发现p53基因突变率明显增高，研究者推测MMR基因缺陷会引发p53基因突变积累，从而促进恶性肿瘤的发展。野生型p53基因为肿瘤抑制基因，是人类恶性肿瘤中最常改变的基因之一。p53基因产物在修复DNA损伤时也起重要作用，目前已有很多研究证实急性白血病存在p53基因点突变。突变型P53蛋白可以通过免疫细胞化学法检测出。本文对急性非淋巴细胞白血病(ANLL)，急性淋巴细胞白血病(ALL)及对照组患者的骨髓单个核细胞的滴片进行寡核苷酸探针原位杂交法检测hMSH2基因转录出的mRNA，免疫细胞化学法检测突变型P53蛋白，以探讨hMSH2 mRNA及突变型p53蛋白的表达与急性白血病发病之间的关系。郑州大学2004届硕士毕业论文急性白血病中hMSHZ mRNA表达及p53蛋白表达的研究材料与方法:研究对象分为叁组:①初治ANLL患者37例，男性24例、女性13例，平均年龄37岁，其中M14例、M218例、M35例、呱7例、M53例。②初治ALL患者26例，男性巧例、女性n例，平均年龄28岁。③对照组25例，男性12例、女性13例，平均年龄35岁，均为骨髓象正常的非肿瘤患者。所有急性白血病患者的分型均依据1986年FAB制定的MIC分型标准制定划分。该实验采集白血病患者及对照者的骨髓 Zml，经淋巴细胞分离液分离单个核细胞制成滴片，用生物素化鼠抗地高新标记的原位杂交法检测hMSHZ转录出的mRNA在各组间的表达百分比，免疫细胞化学法检测突变型p53蛋白在各组间的表达百分比。所得结果用SPSS10.0统计软件包处理，采用方差分析检验，直线相关分析，取Q-0.05为显着性检验水准。结果:(1) ANLL组、ALL组、对照组骨髓细胞中hMSHZ的mRNA检测结果:对照组、ANLL组、ALL组hMSHZ的mRNA表达百分比依次降低，以(x士s)表示，分别为(64.22士8.51)%，(53.98士9.69)%，(32.88士11.46)%。叁组之间表达百分比差异均有统计学意义(尸<0.05)。(2) ANLL组、ALL组、对照组骨髓细胞中突变型P53蛋白检测结果:各组骨髓细胞中突变型P53蛋白表达百分比依次升高，以(x士s)表示，对照组、ANLL组、ALL组骨髓细胞的突变型p53蛋白表达百分比分别为(12.63士6.66)%、(21.50士7.72)%、(29.25士9.45)%。ALL组表达百分比高于对照组，差异有统计学意义(尸<0.05);ANLL组表达百分比高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。(3)ANLL、ALL患者不同年龄组之间hMsHZmRNA检测结果:以55岁为界线将ANLL、ALL分别划分为高龄组及低龄组，分别分析ANLL、ALL中年龄因素对hMSHZ表达的影响。结果显示ANLL高龄组与ANLL低龄组hMSHZ mRNA表达百分比以(x士s)表示分别为(46.97士7.21)%、(58.25士8.51)%。经t检验ANLL高龄组与ANLL低龄组有显着性差异 (尸<0.05)。ALL高龄组与ALL低龄组hMSHZ的mRNA表达百分比以(x士s)表示分别为(38.4士8.17)%、(31.88士n.83)%。应用t检验，结果显示ALL高龄组与ALL低龄组无显着性差异(P>0.05)。(4)ANLL、ALL患者不同年龄组之间突变型P53蛋白表达的差异:以55岁为界线将ANLL、ALL分别划分为高龄郑州大学2(X)4届硕士毕业论文急性白血病中hMsHZ mRNA表达及p53蛋白表达的研究组及低龄组，分别分析ANLL、ALL中年龄因素对突变型P53蛋白表达的影响。ANLL高龄组与ANLL低龄组突变型P53蛋白表达百分比以(x士s)表示分别为(18.75士8.16)%、(22.81士7.29)%，经r检验，ANLL低龄组与ANLL高龄组无显着性差异(尸>0.05)。ALL高龄组、ALL低龄组突变型P53蛋白表达百分比以(x士s)表示分别为(26.74士6.70)%、(30.07士9.76)%，经t检验ALL高龄组与ALL低龄组无显着性差异(P>0.05)。(5)hMSHZ的mRNA表达百分比与突变型P53蛋白表达阳性率的相关关系:ANLL组、ALL组、对照组中hMSHZ的mRNA表达百分比与突变型P53蛋白表达百分比呈负相关(:值为一0.45尹<0.05)。结论:(1) ALL、ANLL患者白血病细胞中hMSHZ的mRNA表达百分比降低，说明hMSHZ基因表达缺失可能参与了急性白血病的发生和发展。(2) hMsHZmRNA在高龄的ANLL中表达百分比低于低龄ANLL表达百分比，说明hMSHZ基因表达缺失可能在老龄ANLL患者的发病中更有重要意义。(3)突变型P53蛋白在ALL组、ANLL组中表达百分比均明显高于对照组，说明突变型P53蛋白参与了ALL、ANLL的发病过程。(4)突变型P53蛋白在高龄组的ALL及ANLL表达百分比与低龄组无明显差异，说明急性白血病中年龄因素与突变型P53蛋白增多无关。(5)hMsHZ的mRNA与突变型P53蛋白表达百分比呈现直线负相关，说明hMSHZ mRNA表达缺失与突变型P53蛋白的高表达共同促进了急性白
王旭[5]2017年在《TCDCA对免疫细胞中TGR5介导的凋亡相关信号转导通路的影响》文中进行了进一步梳理牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic Acid,TCDCA)作为胆汁酸(Bile Acid,BA)的主要活性成分之一,能够通过多种信号转导通路诱导细胞凋亡而发挥抗炎及免疫调节作用。本研究以NR8383大鼠肺泡巨噬细胞为研究对象,分别开展了TCDCA对NR8383细胞凋亡、NR8383细胞中PKC—JNK/P38—5 信号转导通路以及NR8383细胞分泌IL-1 β和TNF-α的影响,旨在分析TCDCA对免疫细胞凋亡的调节作用及其调控机制,探讨TCDCA调控免疫细胞凋亡对免疫细胞凋亡分泌细胞因子的影响,进而深入揭示TCDCA的抗炎免疫调节作用与其调控免疫细胞凋亡之间的关系。具体研究内容如下:(1)TCDCA对NR8383细胞凋亡的影响采用脂质体转染法将PCMV-TGR5真核表达载体转染至低表达TGR5受体的NR8383细胞中;采用qPCR法检测NR8383细胞中TGR5受体及相关凋亡蛋白caspase-3和caspase-8的基因表达量;采用Western Blot法检测NR8383细胞中TGR5受体蛋白表达量;采用流式细胞术检测TCDCA作用后NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞凋亡率;采用ELISA法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中caspase-3和caspase-8活性的影响。结果显示,TGR5受体能够在NR8383细胞中高效表达,成功构建了高表达TGR5受体的NR8383细胞(NR8383-TGR5细胞)。NR8383-TGR5细胞中TGR5的mRNA及蛋白表达量均极显着性高于NR8383细胞(P<0.01)。TCDCA作用后对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞凋亡率影响的研究结果显示,与NR8383组相比,TCDCA(10 μM)可显着性提高NR8383细胞的凋亡率(P<0.05),TCDCA(100 μM)可极显着性提高NR8383细胞的凋亡率(P<0.01)。与 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(10 uM,100 μM)可极显着性提高 NR8383-TGR5细胞的凋亡率(P<0.01)。TCDCA(10 μM,100 μM)作用后,NR8383-TGR5 细胞的凋亡率极显着性高于NR8383细胞(P<0.01)。TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中相关凋亡蛋白caspase-3和caspase-8表达量的影响研究结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(1 μM,10 uM,100 μM)均可极显着性提高 NR8383 细胞和 NR8383-TGR5细胞的 caspase-3 基因表达量(P<0.01)。且 TCDCA(10 μM)和 TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-3 mRNA表达量分别极显着性(P<0.01)和显着性(P<0.05)高于NR8383组。与NR8383组相比,TCDCA(100μM)可极显着提高 caspase-3 活性(P<0.01),与 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(10 μM,100 μM)可极显着性提高 caspase-3 活性(P<0.01),且 TCDCA(1 μM,10 μM,100μ M)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-3活性极显着性高于NR8383组(P<0.01)。与NR8383组相比,TCDCA(100 μM)可极显着性提高caspase-8的基因表达量(P<0.01),与 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(10 μM,100 μM)可极显着性提高caspase-8基因表达量(P<0.01),且TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-8基因表达量显着性高于NR8383组(P<0.05)。与NR8383组相比,TCDCA(100 μM)可极显着性提高caspase-8活性(P<0.01),与NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(1 μM)可显着性(P<0.05)而 TCDCA(100 μM)可极显着性提高 caspase-8 活性(P<0.01),且 TCDCA(1 μM)和 TCDCA(100 μM)作用后,NR8383-TGR5组的caspase-8活性分别显着性(P<0.05)和极显着性(P<0.01)高于 NR8383 组。(2)TCDCA对NR8383细胞中PKC—JNK/P38—p53信号转导通路的影响利用磷脂酶 C-β(Phospholipase C-β,PLC-β)特异性阻断剂 U73122 研究了 TCDCA 对其下游因子蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)表达及活性的影响。采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中PKC基因表达量的影响;采用Western Blot 法检测 TCDCA 对 NR8383 细胞及 NR8383-TGR5 细胞中 PKC 和 pPKC 蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100μM)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC mRNA表达量(P<0.01),且TCDCA作用后NR8383-TGR5组的PKC基因表达量极显着性高于NR8383组(P<0.01),而U73122能极显着性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC基因表达量(P<0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(100 μM)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC和pPKC蛋白表达量(P<0.01),而U73122能极显着性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的PKC和pPKC蛋白表达量(P<0.01)。利用PKC特异性阻断剂G6 6983研究了 TCDCA对其下游因子c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)和P38表达及活性的影响。采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中JNK和P38基因表达量的影响;采用Western Blot 法检测 TCDCA 对 NR8383 细胞及 NR8383-TGR5 细胞中 JNK、pJNK、P38、pP38蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100 μ M)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK mRNA表达量(P<0.01),而Go 6983能极显着性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK 基因表达量(P<0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(100 μM)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK和pJNK蛋白表达量(P<0.01),且NR8383-TCR5组的JNK和pJNK蛋白表达量极显着性低于NR8383组(P<0.01)。Go 6983能极显着性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的JNK和PJNK蛋白表达量(P<0.01)。TCDCA(100μM)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5 细胞的 P38 mRNA 表达量(P<0.01),且 NR8383-TGR5 组的 P38 mRNA表达量极显着性高于NR8383组(P<0.01),而Go 6983能极显着性降低NR8383细胞及 NR8383-TGR5 细胞的 P38 基因表达量(P<0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100μM)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的P38和pP38蛋白表达量(P<0.01),且NR8383-TGR5组的P38蛋白表达量极显着性低于NR8383组(P<0.01),而Go 6983能极显着性降低NR8383细胞的P38蛋白表达量(P<0.01)。分别利用JNK特异性阻断剂SP600125和P38特异性阻断剂SB203580,研究了TCDCA对其下游因子p53表达及活性的影响。采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中p53基因表达量的影响;采用Western Blot法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中p53和pp53蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,TCDCA(100 μ M)能极显着性提高NR8383细胞及 NR8383-TGR5 细胞的p53 mRNA 表达量(P<0.01),而 SP600125 和 SB203580 均能极显着性抑制NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的p53 mRNA表达量(P<0.01),且SP600125作用后NR8383-TGR5组的p53 mRNA表达量极显着性低于NR8383组(P<0.01)。与 NR8383 组及 NR8383-TGR5 组相比,TCDCA(100 μM)能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的p53和pp53蛋白表达量(P<0.01),而SP600125能极显着性降低NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的p53和pp53蛋白表达量(P<0.01),且 TCDCA(100 μM)或 SP600125 作用后 NR8383-TGR5 组的 pp53 蛋白表达量均极显着性高于NR8383组(P<0.01)。SB203580能极显着性降低NR8383细胞的P53和pp53蛋白表达量(P<0.01),并极显着性降低NR8383-TGR5细胞的p53蛋白表达量(P<0.01),且SB203580作用后NR8383-TGR5组的p53和pp53蛋白表达量分别显着性(P<0.05)和极显着性(P<0.01)高于NR8383组。(3)TCDCA对NR8383细胞分泌IL-1β和TNF-α的影响采用qPCR法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中白介素-1 β(Interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)基因表达量的影响;采用ELISA法检测TCDCA对NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中IL-1β和TNF-α蛋白表达量的影响。结果显示,与NR8383组及NR8383-TGR5 组相比,脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)能极显着性提高 NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的IL-1β基因和蛋白表达量(P<0.01)。与LPS对照组相比,100 μ M TCDCA能极显着性降低LPS诱导的IL-1 β的基因和蛋白表达量(P<0.01)。另外,SP600125 和 SB203580 作用后,与 NR8383 组和 NR8383-TGR5 组相比,IL-1β的基因及蛋白表达量极显著性降低(P<0.01)。与NR8383组及NR8383-TGR5组相比,LPS能极显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的TNF-α的基因和蛋白表达量(P<0.01)。与LPS对照组相比,100 μM TCDCA能极显着性降低LPS诱导的TNF-a的基因和蛋白表达量(P＜0.01)。另外,SP600125和SB203580作用后,与NR8383组和NR8383-TGR5组相比,TNF-α的基因及蛋白表达量极显著性降低(P<0.01)。通过本研究可主要得出以下结论:(1)TCDCA能显着性提高NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞的凋亡率,且10μM和100 μ M浓度的TCDCA作用后,NR8383-TGR5细胞的凋亡率显着性高于NR8383细胞的凋亡率;TCDCA能显着性增加NR8383细胞及NR8383-TGR5细胞中caspase-3和caspase-8的表达及活性,且NR8383-TGR5细胞中caspase-3和caspase-8的表达及活性均显着性高于NR8383细胞。因而提示,TCDCA提高NR8383细胞的凋亡率与其激活TGR5受体有关;(2)TCDCA能通过TGR5受体介导JNK、pJNK、P38、pP38、p53、pp53的表达量显着性升高,且在U73122、Go 6983、SP600125、SB203580作用后均能显着性降低其相应下游产物的表达量。由此表明,TCDCA诱导NR8383细胞凋亡与其激活TGR5受体介导的PKC—JNK/P38—p53信号转导通路有关;(3)TCDCA能显着性降低LPS诱导的NR8383细胞和NR8383-TGR5细胞中IL-1β和TNF-α的mRNA及蛋白表达量。此外,与NR8383组和NR8383-TGR5组相比,SP600125和SB203580作用后,IL-1β和TNF-α的基因及蛋白表达量极显著性降低。这一结果提示,TCDCA能够通过PKC—JNK/P38信号转导通路抑制NR8383细胞对IL-1β和TNF-α的分泌。综上所述,TCDCA提高NR8383细胞凋亡率,并抑制其分泌炎性细胞因子TNF-α和IL-1 β,与其激活TGR5受体介导的PKC—JNK/P38—p53细胞凋亡信号转导通路有关。
刘媛媛[6]2007年在《卵巢癌多药耐药差异表达基因的验证》文中研究说明卵巢癌是最常见的女性恶性肿瘤之一,它的5年存活率低。其重要原因之一是肿瘤细胞的多药耐药现象。为了探讨卵巢上皮癌铂类耐药机理,本课题组前期采用FDD-PCR方法筛选卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异表达基因。结果显示①S4:Homosapiens mitochondrion②a17:5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase③actin-related protein 3 homolog mRNA④s16:rihosomal protein L35a mRNA⑤s20:replication protein A2 mRNA⑥s23:basictranscription factor 3(BTF3)mRNA⑦a5:thymosin,beta10(TMSB10)mRNA⑧a13:esterase D/formylglutathione hydrolase(ESD)⑨a26:mitochondrion基因片段为各种耐药细胞系共存且与亲本敏感细胞间有表达差异的基因。本实验进一步验证上述差异表达基因及P73、WWOX基因在卵巢癌耐药和敏感细胞(组织)的表达,并探讨其与卵巢癌多药耐药和卵巢癌临床病理之间的关系。最后采用RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究。1、卵巢上皮癌铂类耐药细胞和敏感细胞系中差异基因的表达:同时运用RT-PCR和Northern blot方法检测上述9条差异表达基因在卵巢癌耐药和敏感细胞中的表达,结果Northern杂交仅仅得到的四条基因片段(a17、a32、s23、s16)的mRNA表达信息,没有检测到其余5条基因的表达情况。其中a17和a32仅仅在卵巢癌耐药细胞中表达,而S16、S23基因在卵巢癌某些敏感和耐药细胞中表达,两种方法验证的结果一致,暗示这些基因与肿瘤多药耐药有联系。根据他们的生物学特性,我们推测a17基因使药物代谢灭活增加导致了肿瘤的耐药;S16是通过导致细胞毒性损坏从而参与了多药耐药的发生。而因为没有关于a32和s23的生物学信息作为参考,我们尚不能推测其通过哪方面参与了多药耐药的发生。2、卵巢癌多药耐药差异表达基因在卵巢肿瘤组织中的表达及其临床意义:采用RT-PCR方法对卵巢肿瘤及对照组织中的上述基因表达进行了检测,旨在探讨这些差异表达基因的表达上调或下凋是否与临床多药耐药现象相吻合以及其临床意义。结果显示,S4、S16、S20、S23、a5、a26、a13、a32基因片段的高表达与卵巢癌化疗铂类耐药之间可能存在着某些联系。通过他们的生物学特征我们推测a13、a17通过参与药物代谢过程、a26通过抑制肿瘤细胞凋亡和改变线粒体膜渗透性、s16通过参与细胞毒性损坏、s20通过参与DNA损伤修复从而导致了多药耐药。而a5、a17、s4、a32、s23的功能尚未明确。且S4、S23、a5、a13、a32的高表达与卵巢癌的高转移和进展有关,其中我们推测a5高表达导致了肌动蛋白骨架的断裂导致了肿瘤细胞的转移。a17、a26、s16、s20与卵巢癌的临床病理特征无关,考虑这几种基因可以成为卵巢癌耐药的指标,却与进展无关。3、P73基因在卵巢肿瘤组织和卵巢上皮癌耐药细胞系中的表达及其临床意义:采用RT-PCR和northern blot方法检测P73基因在卵巢肿瘤组织中和铂类药物敏感和耐药的卵巢上皮癌细胞系中的表达变化,旨在探讨其与多药耐药的相关性和临床意义。结果显示P73的表达与卵巢癌的临床分期、组织学类型、病情进展程度及患者预后无关。P73基因在卵巢癌耐药细胞株中的表达为高,考虑是否同时存在着P53的突变,P53的突变异构体使P73的功能失活才导致的耐药。WWOX基因在卵巢肿瘤组织和卵巢上皮癌耐药细胞系中的表达及其临床意义:采用RT-PCR和northern blot方法检测WWOX基因在卵巢肿瘤组织中和铂类药物敏感和耐药的卵巢上皮癌细胞系中的表达变化,旨在探讨其与多药耐药的相关性和临床意义。RT-PCR结果显示WWOX基因在卵巢癌敏感细胞系A2780中表达丰度均高于耐药细胞系,认为WWOX不介导多药耐药。而WWOX在敏感细胞系SKOV3中不表达,但是相对应的耐药细胞表达却明显增高,这个结论却与之前的推论背道而驰。我们考虑与这两种细胞耐药性不同有关。Northern杂交的结果反应出WWOX基因在两种卵巢癌敏感细胞中表达丰度均大于耐药细胞株,暗示WWOX基因不诱导产生卵巢癌的多药耐药。WWOX在卵巢肿瘤及对照组织中的检测的结果显示WWOX在卵巢癌铂类耐药组织中的表达阳性率和表达量明显高于敏感组织,但是无统计学意义。本实验结果尚不支持WWOX作为一个抑癌基因的看法,但是提示WWOX基因的表达与卵巢癌的发生和进展有一定的关系,与国外部分观点符合。5、RNA干扰阻断WWOX基因表达的体外实验研究:本章采用针对WWOX基因的特异性小分子干扰RNA,转染进卵巢癌耐顺铂细胞株SKOV3/SB,从基因角度探索逆转卵巢癌细胞多药耐药的途径,以期恢复卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。进一步探讨WWOX是否作为抑癌基因,并且也将为WWOX基因参与肿瘤的基因诊断及治疗提供新的思路。转染了WWOX的干扰片段后,SKOV3-SB的耐药下降,说明了WWOX很可能参与了耐药。功能实验结果提示WWOX通过增强肿瘤细胞自身修复,抵御化疗药物的损伤的作用及发挥类似药物输出泵的作用参与了耐药的发生。RNAi结果与前一章结果相反,考虑与实验误差有关,因为瞬时转染虽然可以抑制基因的表达,但对于干扰的长期有效性尚无实验结论,需要在后续实验中通过长效表达载体实验中做进一步验证。从结果来看,虽然本实验结果验证了与卵巢癌多药耐药有关的一些基因,并且也推测了他们参与多药耐药的途径,但是这仅仅作为一种假设。我们还要进一步系统研究这些耐药相关因子在耐药发生过程中所起的作用,以期在未来建立对耐药性状具有准确预测能力的计算机耐药模型,对于临床上耐药卵巢癌患者的个体化治疗方案的制订和实施,从根本上解决耐药问题,是非常必要的。
孙伟[7]2010年在《凋亡相关基因及其交互作用与食管鳞癌生物学特性的临床研究》文中提出目的：1)通过研究食管鳞癌不同组织部位膜转运蛋白-166(TMEM166)在转录水平的表达与食管鳞癌不同组织部位细胞早期凋亡率,探讨TMEM166与食管鳞癌不同组织部位细胞早期凋亡率的关系；2)通过研究食管鳞癌不同组织部位中程序化细胞死亡蛋白5(PDCD5)在转录和翻译水平的表达及其相关性,探讨PDCD5与食管鳞癌病理特征的关系；3)研究食管鳞癌不同组织部位中TMEM166、PDCD5、Tip60、MDM2mRNA与p53蛋白的表达,探讨TMEM166、PDCD5、Tip60、MDM2mRNA与p53蛋白与食管鳞癌病理特征的相关性及其在食管鳞癌不同部位组织中的交互作用。方法：1)标本收集：选用新疆医科大学附属肿瘤医院2008年5月～2009年4月手术切除的85例术前未进行抗肿瘤治疗的食管鳞状细胞癌新鲜手术标本,分别留取癌组织、癌旁组织、远癌组织标本；2)按照性别、民族、年龄、临床分期匹配(2009年第七版UICC国际食管癌分期),选择Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期各12例共36例食管鳞癌、远癌组织手术标本,应用流式细胞术、RT-PCR、免疫组化的方法,分别对食管鳞癌组织、远癌组织细胞的早期凋亡率、TMEM166mRNA、TMEM166蛋白表达进行检测；RT-PCR、Western-blot检测食管鳞癌组织不同部位PDCD5mRNA、PDCD5蛋白的表达,分析PDCD5mRNA、PDCD5蛋白的相关性及与食管鳞癌的病理特征的关系；3)85例食管鳞癌及远癌组织RT-PCR检测TMEM166、PDCD5、Tip60、MDM2mRNA表达,免疫组化检测p53蛋白表达,分析上述基因表达与食管鳞癌的病理学特点及上述基因间的交互作用；4)统计学方法：用SPSS13.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,均数比较采用方差分析(ANOVA)、SNK检验(Student-Newman-Keuls)、χ2检验、Pearson积差相关分析；分类资料采用t检验、R×C列联表确切概率法、Spearman等级相关分析。检验水准α=0.05。结果：1)食管鳞癌组织TMEM166 mRNA表达(1.1214±0.2262)低于远癌组织(1.4645±0.3396)(P=0.014)；TMEM166基因表达随病变分期增加呈下降趋势(rs=-0.357,P=0.033)；2)食管鳞癌组织细胞早期凋亡率(2.1563±0.4740)高于远癌组织(1.6313±0.3121)(P<0.001),食管鳞癌组织细胞早期凋亡率与食管鳞癌临床分期负相关(rs=-0.584,P<0.001),与TMEM166基因表达正相关(r=0.310,P=0.036)；3)与远癌组织相比,食管鳞癌组织中TMEM166蛋白亚细胞定位发生改变；4)食管鳞癌组织中PDCD5蛋白表达(0.4387±0.1632)低于远癌组织(0.5659±0.2272),随临床分期增加,其表达量有进一步下调的趋势(rs=-0.678,P<0.001；rs=-0.619,P<0.001)；PDCD5mRNA的表达与蛋白表达高度相关(r=0.715,0.781)；PDCD5mRNA及蛋白表达水平与食管鳞癌的肿瘤侵润深度、淋巴结分期、分化程度的相关性不均衡；5)食管鳞癌组织细胞中,TMEM166mRNA、PDCD5mRNA表达受抑制,MDM2mRNA、p53在食管鳞癌组织中存在过表达；6)Tip60在食管鳞癌、远癌组织的表达未发现统计学差异(0.7359±0.2489 vs 0.7204±0.1512,P=0.012)；7)食管鳞癌肿瘤侵润深度与PDCD5 mRNA负相关(rs=-0.220,P=0.043),与p53蛋白、Tip60mRNA正相关(rs=0.443,0.523；P<0.001)。淋巴结分期与TMEM166、PDCD5mRNA负相关(rs=-0.593,-0.416；P=0.008,0.013)：与Tip60、MDM2 mRNA正相关(rs=0.273,0.182；P=0.038,0.009)。肿瘤细胞G分级与TMEM166mRNA负相关(rs=-0.423,P=0.029)；与MDM2 mRNA、P53蛋白正相关(rs=0.442,0.299；P=0.027,0.045)；8)食管鳞癌组织中TMEM166 mRNA与PDCD5 mRNA正相关(rs=0.516,P<0.001),与Tip60 mRNA、MDM2 mRNA、p53蛋白负相关(rs=-0.236,-0.453,-0.426；P=0.015,<0.001,<0.001);PDCD5 mRNA与Tip60、MDM2mRNA及p53蛋白负相关(rs=-0.417,-0.631,-0.589；P<0.001)；Tip60mRNA与MDM2mRNA、p53蛋白正相关(rs=0.388,0.321；P<0.001,0.001)；MDM2 mRNA与p53蛋白正相关(rs=0.440,P<0.001)；9)食管鳞癌远癌组织中TMEM166 mRNA与PDCD5 mRNA正相关(rs=0.305,P=0.002)；PDCD5 mRNA与MDM2mRNA、p53蛋白负相关(rs=-0.315,-0.210；P=0.001,0.031)；MDM2 mRNA与p53蛋白正相关(rs=0.221,P=0.023)。结论：1)食管鳞癌组织细胞早期凋亡率增高,TMEM166 mRNA在食管鳞癌的表达受抑制；TMEM166亚细胞定位的改变可能导致TMEMmRNA表达量的下降和该基因功能的变化；2)PDCD5与食管鳞状细胞癌的发生有关,PDCD5mRNA的表达与蛋白表达高度相关；3)食管鳞癌组织细胞中,TMEM166、PDCD5mRNA表达受抑制,MDM2mRNA、p53蛋白存在过表达,与食管鳞癌生物学特点有关；4)Tip60mRNA在食管鳞癌不同组织部位的表达无差异；5)Tip60在食管鳞癌细胞中活性可能与促凋亡基因PDCD5、TMEM166及癌基因MDM2的双重调节有关。
林晓燕, 孙玲, 邹宏志, 乐晓萍, 郭学军[8]2005年在《急性淋巴细胞白血病中hMSH2mRNA及突变型P53蛋白的表达》文中进行了进一步梳理为了探讨hMSH2mRNA及突变型P53蛋白表达与急性淋巴细胞白血病发病的关系,采用寡核苷酸探针原位杂交技术及免疫细胞化学技术检测急性淋巴细胞白血病(ALL)患者骨髓单个核细胞的滴片hMSH2mRNA和突变型P53蛋白的表达。结果显示:ALL组hMSH2mRNA表达百分比低于对照组,分别为(32.88±11.46)%和(64.22±8.51)%,两组比较有显着性差异(P<0.05);ALL组突变型P53蛋白表达百分比高于对照组,分别为(29.25±9.45)%和(12.63±6.66)%,两组比较有显着性差异(P<0.05);ALL组、对照组中hMSH2的mRNA表达百分比与突变型P53蛋白表达百分比呈负相关(r值为-0.45,P<0.05)。结论:hMSH2基因表达缺失及P53蛋白突变可能参与ALL的发生和发展;hMSH2mRNA表达缺失与突变型P53蛋白的高表达共同促进了ALL的发生。
代重山[9]2017年在《黏菌素诱导细胞凋亡和自噬分子机制及靶向调控研究》文中研究说明多黏菌素(包括多黏菌素B及黏菌素)是临床治疗多重耐药革兰氏阴性细菌感染的最为重要抗生素之一。多黏菌素肾毒性及神经毒性是其临床使用过程中主要毒副作用及剂量限制性因素,但其分子毒性机制尚不清楚。本文通过建立小鼠及体外细胞模型系统研究了黏菌素诱导细胞凋亡及自噬的分子机制,并进一步探究了靶向调控细胞凋亡及自噬信号通路对黏菌素肾毒性及神经毒性的影响。主要发现如下:(1)使用小鼠及体外细胞模型(HEK293及N2a细胞系)研究证实,黏菌素可通过剂量依赖性诱导氧化应激介导的线粒体功能失调,激活线粒体、死亡受体及内质网凋亡通路;同时激活NF-κB、MAPKs、p53、Nrf2/ARE、Akt等信号通路。其中,ERK、JNK信号通路的激活在黏菌素诱导的细胞凋亡中发挥保护性作用,P53的激活及Akt信号通路的抑制发挥促凋亡的作用。(2)黏菌素暴露可上调组织及细胞内Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ比率,伴随明显的自噬-溶酶体及自噬体结构,表明黏菌素处理激活细胞自噬,通过使用GFP-LC3质粒转染后进一步证实。进一步使用N2a细胞模型研究证实,自噬抑制剂氯喹(CQ)依赖于ROS介导的氧化应激损伤及casapse激活,加剧黏菌素诱导的细胞凋亡。雷帕霉素,可特异性的抑制mTOR/p70s6k信号通路,上调Akt/CREB、Nrf2/ARE等信号通路信号通路及ULK1依赖性的细胞自噬及其降解过程,改善黏菌素诱导的氧化应激损伤、线粒体功能失调及caspase激活介导的细胞凋亡;小鼠原代神经元及动物模型进一步验证了自噬的保护性作用。(3)姜黄素及黄芩素补充能够提高动物体内及细胞抗氧化、抗炎能力,上调Nrf2/HO-1信号通路及ULK1介导的细胞自噬,下调黏菌素受体蛋白Megalin表达、p53蛋白表达,显着改善黏菌素对组织/细胞造成的的氧化应激损伤、caspase依赖性凋亡及NF-κB信号通路介导的炎症反应,从而改善黏菌素诱导的神经毒性及肾毒性。(4)体外及动物模型研究发现,抗生素药物米诺环素能够通过清除细胞内ROS,抑制氧化应激、caspase激活及细胞凋亡,有效降低黏菌素诱导的神经毒性及肾毒性,具有重要的临床应用价值。综上所述,黏菌素诱导的神经毒性及肾毒性涉及外源性及内源性细胞凋亡通、ULK1介导的细胞自噬及NF-κB介导的炎症反应。药理性激活Akt/CREB、Nrf2/HO-1及自噬可通过抑制氧化损伤及细胞凋亡能够有效降低黏菌素肾毒性及神经毒性。本研究为新一代多黏菌素脂肽类抗生素的开发、多黏菌素联合用药、减毒策略提供了重要的理论参考依据。
蒋静[10]2007年在《抑癌基因P53突变及多药耐药基因表达在上皮性卵巢癌多药耐药机制中的研究》文中指出目的:检测抑癌基因P53(突变型)、GST-π、MDR1在卵巢癌中的表达,并将测定结果结合卵巢癌临床参数如临床分期、病理类型、化疗耐药、化疗史等进行比较,了解P53、GST-π、MDR1在卵巢癌中的表达及其生物学行为、预后的关系;在体外细胞水平从细胞凋亡角度探讨卵巢癌多药耐药的发生机制,进一步阐明卵巢癌中细胞凋亡相关基因P53的突变与耐药基因的关系,探讨卵巢癌耐药的机理,为指导临床选择合适的治疗方案、判断预后以及寻找有效的逆转肿瘤耐药的方法提供理论依据。方法:1.采用RT-PCR法及SP免疫组化法检测60例不同性质卵巢组织中耐药基因MDR1、GST-π、P53mRNA及其蛋白P-gP、GST-π、P53的表达水平。2.采用MTT法检测不同浓度DDP对COC1及COC1/DDP细胞的抑制作用。流式细胞仪检测不同浓度DDP作用COC1及COC1/DDP细胞后的凋亡变化。3.RT-PCR半定量法测定不同浓度DDP作用于COC1及COC1/DDP细胞24h后P53、GST-π、MDR1mRNA含量的变化。结果:1.上皮性卵巢癌,良性上皮性肿瘤,正常卵巢组织中叁种指标的表达情况:MDR1蛋白依次为9/22、0/20、0/18,GST-л蛋白为16/22、0/20、0/18,p53蛋白为14/22、0/20、0/18;MDR1mRNA依次为12/22、0/20、0/18,GST-πmRNA为17/22、3/20、0/18,p53mRNA为16/22、0/20、0/18,叁个指标在上皮性卵巢癌中的表达率显着增高;化疗耐药与MDR1和GST-π相关; P53表达与肿瘤分期和组织分化程度相关;MDR1表达与组织分化程度相关; p53与MDR1表达具有一定相关性。2.不同浓度DDP处理COC1及COC1/DDP细胞后,均有抑制细胞生长及促凋亡作用,且呈时间和剂量依耐性。DDP浓度在2.5～10μg/mL内,敏感细胞株凋亡率明显高于耐药细胞株,差异具有显着性意义(P<0.05)。3.COC1细胞中GST-π、P53mRNA呈弱表达,不同浓度DDP作用24h后,P53、GST-л表达明显减弱,且呈浓度依耐性,MDR1未见表达;COC1/DDP细胞中P53、MDR1mRNA表达较COC1细胞增强,GST-πmRNA变化不明显,不同浓度DDP作用后叁者变化无显着性差异。结论:1. P53、GST-π、MDR1在正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤及卵巢癌中表达逐渐增强,提示叁者均参与卵巢癌的形成,并与耐药有关。卵巢癌化疗耐药与耐药基因GST-π、MDR1过表达及细胞凋亡相关基因P53突变密切相关,突变的P53可能通过调控耐药基因GST-π、MDR1而间接发挥其耐药作用。2. P53蛋白表达与卵巢上皮性肿瘤的良恶性、肿瘤细胞的分化程度、患者的临床分期有关,与恶性肿瘤的病理类型无关。P53蛋白表达可作为卵巢癌预后与耐药的一个指标。3.GST-π、MDR1基因表达与卵巢癌化疗具有一定的相关性,在卵巢癌化疗耐药组GST-π、MDR1基因表达增高。因此在判断临床用药时检测多药耐药相关基因的表达,可得到一定的耐药信息,有助于临床化疗方案的制定。p53的表达与MDR1阳性率存在一定的相关性,卵巢癌耐药可能与细胞凋亡相关。4.不同浓度DDP可抑制COC1、COC1/DDP细胞增殖,并且具有时间-剂量依耐性。DDP对COC1细胞作用更明显。5.诱导细胞凋亡是顺铂作用机制之一,顺铂可诱导卵巢癌COC1、COC1/DDP细胞凋亡,获得性耐药与肿瘤细胞凋亡有关。6. COC1/DDP细胞中P53、MDR1表达较COC1细胞增强,不同浓度DDP作用COC1细胞后,P53表达明显减弱,呈浓度依耐性,而作用COC1/DDP细胞后,P53变化无显着性。卵巢癌顺铂耐药的产生可能与凋亡途径的失活有关。卵巢癌中多药耐药现象常见,检测多药耐药相关基因MDR1、GST-π的表达对临床预测化疗药物的敏感性有较大的应用价值。凋亡相关基因P53(突变型)在人卵巢癌多药耐药细胞中高表达,是导致细胞凋亡受抑制和对药物敏感性降低的重要原因。
参考文献：
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[8]. 急性淋巴细胞白血病中hMSH2mRNA及突变型P53蛋白的表达[J]. 林晓燕, 孙玲, 邹宏志, 乐晓萍, 郭学军. 中国实验血液学杂志. 2005
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[10]. 抑癌基因P53突变及多药耐药基因表达在上皮性卵巢癌多药耐药机制中的研究[D]. 蒋静. 重庆医科大学. 2007