易喻[1]2004年在《蚓激酶分子修饰的研究》文中研究表明蚓激酶(Earthworm fibrinolytic enzymes，EFE)是一组具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白酶，可以作为治疗血栓类疾病的药物。本实验以赤子爱胜蚓(Eisenia faetida)为原料，经分离纯化得到较高纯度的蚓激酶(EFE)，并用大分子结合修饰法及肽链有限水解修饰法对蚓激酶进行化学修饰，并对修饰反应的部分条件进行了优化及对修饰前后蚓激酶的部分酶学性质进行了比较。 经过自溶、(NH_4)_2SO_4分步盐析、DEAE-纤维素离子交换层析、超滤等纯化过程，蚓激酶纯化倍数达6.67倍，比活力为2.29×10~4u／mg，酶活力回收率为17.0％。 通过实验优化了部分修饰条件。实验表明，聚乙二醇修饰蚓激酶的较佳条件：在37℃下，pH9.2，0.1M的硼酸缓冲液中，每1.0mg的蚓激酶加25.5mgPEG_1，水浴保温1h，修饰率为63.2％，酶比活为1.30×10~4u／mg而残留酶活为56.6％。右旋糖苷修饰蚓激酶的较佳条件：在室温下，pH8.4、0.1M的硼酸缓冲液中，将酶液与活化的右旋糖苷以1.0：152.7(W／W)的比例反应18h，则酶的修饰率为58.5％时，修饰后的酶比活为6.28×10~3u／mg，酶活回收率为27.4％。固定化胰蛋白酶水解修饰蚓激酶的较佳条件：在45℃下，固定化胰蛋白酶与被修饰叫激酶以350mg:1.Omg的比例加入一定体积的磷酸缓冲液(0.lmol/L，pH7.4)中，水浴保温lh，修饰率为72.1%，酶比活为l.46X1了川mg，酶活回收率为63.6%。 另外，对修饰前后的部分酶学性质进行比较。结果表明，修饰后的PEG一EFE和DEX一EFE对底物(酪蛋白)的亲合力都增加了、抗胰蛋白酶的水解能力、热稳定性也提高了，抗原性也大大的降低了，其中PEG一EFE与抗血清的结合能力大约是天然酶的25 .0%左右，修饰酶DEX一EFE的抗原抗体的结合能力大约是天然酶的犯.5%。而被固定化胰蛋白水解后的叫激酶其对酪蛋白的亲和力降低了，热稳定性也略有下降，与抗血清的结合能力大约是天然酶的42.0%左右。x
应国清, 易喻, 石陆娥, 王普, 胡妙申[2]2005年在《单甲氧基聚乙二醇修饰蚓激酶的制备及性质研究》文中研究说明采用以叁聚氯氰活化的单甲氧基聚乙二醇(mPEG-5000),对从赤子爱胜蚓体内提取的抗血栓酶——蚓激酶进行了化学修饰,以期降低其抗原性及增加它的稳定性。实验表明,在37℃下,15.0mL,pH9.2,0.1mol?L?1的硼酸缓冲液中,按每1.0mg的蚓激酶加入25.5mg活化的mPEG,水浴保温1h,经透析、超滤浓缩、冻干得mPEG修饰酶,测得蚓激酶的修饰率为63.2%,酶活回收率为56.6%。在此基础上,对修饰蚓激酶的性质进行了研究。结果显示,修饰后的蚓激酶对底物的亲和力有所增加(天然酶表观米氏常数Km值为0.267mg.mL?1,修饰酶Km'值为0.115mg.mL?1);修饰蚓激酶的抗胰蛋白酶水解能力、热稳定性均优于天然酶;同时修饰酶的抗原性有了较大程度的降低,与抗血清的结合能力大约是天然酶的25.0%左右。
孔航天[3]2008年在《蚓激酶基因在原核和毕赤酵母中的表达》文中提出血栓性疾病严重威胁人类的生命和健康,目前临床上用于治疗血栓性疾病的药物有种种缺陷。因此,新型溶栓药物的研制与开发成为当务之急。从传统中药——“地龙”(蚯蚓)中提取的蚓激酶,具有溶解血栓和防止血栓形成的双重药理作用,是一种理想的溶栓药物。因此,本课题试图利用DNA重组技术实现蚓激酶的异源表达,为基因工程药物的开发提供必要的理论和实验基础。首先我们尝试在大肠杆菌表达系统中表达蚓激酶,构建了高效表达载体pPelB-EPA,并转化到E.coli Rosetta进行表达,通过SDS- PAGE和Western blot验证,成功表达出目的蛋白,分子量为31KD,与预测相符。但由于蚓激酶是以包涵体形式表达,不具有纤溶活性。因此我们又尝试在毕赤酵母表达系统中表达蚓激酶,将分泌型重组表达载体pPIC9K -EPA用BglII线性化后,电转化导入毕赤酵母细胞,用MM和MD平板筛选出Muts和Mut+两种转化子表型,加甲醇诱导表达,经过SDS-PAGE和Western blot验证,Muts型转化子表达出目的蛋白,分子量为35KD,与预测相符。而Mut+型转化子未能表达目的蛋白。
王佃亮[4]2006年在《一种新型海洋纤溶酶的研究》文中进行了进一步梳理血栓性疾病是西方富裕国家人类死亡的首要原因。它主要危害心、脑、肺的血管系统,造成成年人死亡或残疾。在美国,每年大约有60万人发生肺栓塞,其中约20万人死亡;每年约有100万人发生急性心肌梗塞,其中20多万人需要住院进行治疗。在我国,每年大约有200万人死于栓塞性心脑血管疾病,每年需要进行溶栓治疗的病人超过300万。并且,这类疾病的发病率也有逐年上升趋势。血栓性疾病的主要治疗手段是溶栓,迄今溶栓剂已发展了叁代,但都有一定的副作用。有鉴于此,我们从海洋无脊椎动物单环刺螠中寻找和分离了一种新型纤溶酶。现将主要研究结果分述如下:1.单环刺螠纤溶酶在单环刺螠的血液及内脏组织中含量丰富,其大量制备工艺为:体腔液及内脏混合物经匀浆、PBS抽提、(NH_4)_2SO_4分级盐析、超滤、Q.Sepharose Fast Flow和Sephadex G-75、Sephacry S-100层析分离,最终获得纯酶。经过优化的本工艺可以高效率地提取这种新型海洋纤溶酶,并达到了电泳纯,在SDS-PAGE电泳图谱上显示一条带。2.经SDS-PAGE和Native-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,单环刺螠纤溶酶分子量约为10,380 Da。与已经发现的陆地生物来源的纤溶酶以及海洋生物来源的纤溶酶相比,分子量相对较小。而苯酚-硫酸法测定糖含量表明,单环刺螠纤溶酶含糖量极低,所以可能不是糖蛋白。3.与蚓激酶类似,单环刺螠纤溶酶既可直接水解纤维蛋白,又具有激酶活性,通过激活纤溶酶原并使之转化为纤溶酶,从而间接地水解纤维蛋白。因而该酶具有很高的纤维蛋白亲合性和酶活力。以尿激酶为对照,测得酶的比活力为5256 U/mg。4.单环刺螠纤溶酶体外抗凝实验结果表明,不同浓度的酶均具有显着的抗凝作用,并且酶浓度越高,抗凝效果也越好。在酶浓度相同的情况下,单环刺螠纤溶酶的抗凝效果要优于蚓激酶。而且,单环刺螠纤溶酶作用相对温和,对细胞损
杜芳[5]2013年在《单环刺螠纤溶酶Ⅲ的基因克隆及表达》文中研究指明血栓类疾病严重威胁着人类的健康，特别是发达国家和多数发展中国家的中老年人。心脑血栓疾病不但发病率高、死亡率高、致残率高，而且具有突发性。应用溶栓药物进行血栓治疗是当前治疗血栓类疾病的主要手段。经过多年的努力探索，从尿激酶的发现到瑞替普酶的开发和蚓激酶的使用，血栓类药物的研究取得了很大进展，但仍然存在着半衰期短、特异性差等缺点，因此探索更为理想的溶栓药物一直是世界的发展目标。本实验室经过多年的实验研究，从单环刺螠体内发现并分离出了4种新型的纤溶酶，分别命名为为单环刺螠纤溶酶Ⅰ（UFEI）、单环刺螠纤溶酶Ⅱ（UFEⅡ）、单环刺螠纤溶酶Ⅲ（UFEⅢ）及单环刺螠纤溶酶Ⅳ（UFEⅣ）。经溶栓实验及药物安全性的评价发现，4种纤溶酶体外溶栓效果均强于蚓激酶，并且具有较高的生物安全性，其中UFEⅢ因分子量小、溶栓活性高等特点，所以具有较大的开发价值。但传统的分离手段重复性差、得率低，故期望通过克隆单环刺螠纤溶酶Ⅲ的基因，构建能产生重组单环刺螠纤溶酶Ⅲ的基因工程菌株。本研究的主要内容有：1.对单环刺螠纤溶酶Ⅲ进行蛋白质N端测序得到该酶的N-末端氨基酸序列，根据氨基酸序列设计简并引物，经3’-RACEPCR获得该组分蛋白质的部分编码序列，进一步通过5’-RACE获得单环刺螠纤溶酶Ⅲ基因的全长cDNA编码序列（共863bp），其中ORF为786bp。UFEⅢ全长cDNA经BLASTx比对，结果表明该基因编码产物与丝氨酸蛋白酶家族具有较高的同源性，通过PROSITE的ScanProsite软件分析发现，该蛋白质含有一个trypsindomain，在NCBI的CDD数据库中分析结果显示该酶是一种胰蛋白酶样的丝氨酸蛋白酶。2.构建了原核重组表达载体pET32a-UFEⅢ、pGEX-6P-1-UFEⅢ及pET28a-UFEⅢ转入大肠杆菌Rosetta2(DE3)中，进行IPTG诱导，得到了重组表达的蛋白，表达后的发酵上清进行亲和层析纯化，包涵体进行复性研究，最后均获得可溶形式的目的蛋白，但未检测到活性。3.构建了真核分泌性表达载体pINA1317-UFEⅢ，转入酵母Y.lipolyticaPo1h中进行表达，经过大量阳性转化子的筛选，得到两株具有较高纤溶酶活性的菌株，经SDS-PAGE检测后，分子量为30kD，大于预期的分子量，分析原因是产生了糖基化的修饰。用空载上清稀释阳性菌株上清后，纤维蛋白平板测酶活，发现随着目的蛋白浓度的降低，活性也在逐渐降低，进一步证明了重组发酵液中目的蛋白的表达。本研究首次得到了重组表达的单环刺螠纤溶酶，为后续的蛋白结构研究及药物开发打下基础，但还需进一步对原核表达条件进行探索。
张成瑶[6]2007年在《蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达》文中认为蚓激酶(Lumbrokinase,LK)是从蚯蚓体内提取的一种具有纤溶活性的蛋白水解酶,它能直接降解血中纤维蛋白原及激活纤溶酶原为纤溶酶。蚓激酶能降低血液粘稠度、溶栓、减少血小板聚集、改善微循环,具有良好的体内外溶栓抗凝作用。作为溶栓药物,蚓激酶先后在韩国和中国上市,在心脑血管疾病治疗中显示出明显的疗效。毕赤酵母是目前应用最为广泛和成功的外源蛋白表达系统,其培养条件简单易行、容易形成大规模生产;表达产物经过二硫键形成、正确折迭、糖基化及信号处理等修饰,使其特性接近天然产物。鉴于上述原因,毕赤酵母表达系统成为开发蛋白类基因工程药物的首选。本实验目的是获得能够表达蚓激酶的基因工程酵母菌株。通过PCR扩增目的基因,将其连接到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K,得到目的基因表达载体。载体经线性化后,电击转入毕赤酵母GS115中,经过组氨酸营养缺陷平板筛选及G418筛选,得到一系列转化子。经PCR验证,目的基因已经转入酵母体内。Northern dot blotting检测目的基因已在酵母体内转录。将得到的转化子在甲醇营养限制平板筛选,得到的转化子鉴定为甲醇利用缓慢型Muts。经诱导后的发酵液可以溶解血纤维蛋白平板。本实验为基因工程生产蚓激酶的中上游工作提供良好的理论支持,为下一步大规模发酵打下基础。
刘殿峰[7]2006年在《蚓激酶基因在牛乳腺中的表达及其转基因兔的建立》文中研究说明为了建立乳腺生物反应器,获得蚓激酶在牛乳腺中表达,本研究采用分子生物学与转基因技术,构建了蚓激酶乳腺特异性表达载体及逆转录病毒载体,在牛乳腺组织中进行了蚓激酶的表达研究,然后利用逆转录病毒转染家兔精原干细胞,旨在建立蚓激酶转基因家兔,为最终获得其转基因奶牛乳腺生物反应器奠定基础。首先构建了以山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5′区调控序列(BCP)为启动子、蚓激酶基因(lumbrokinase,LK)为目的基因的乳腺特异性表达载体pBLK,然后将BCP与LK表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒(MoMLV)、含有标记基因NeoR的逆转录病毒载体pLNCL中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK。将上述两个载体转染泌乳期奶牛乳腺小叶,蚓激酶基因在乳腺组织实现了有效表达;进而在脂质体介导下将pLN-BCP-LK质粒转染包装细胞PA317,获得可持续产生病毒颗粒的细胞克隆;利用重组逆转录病毒转染妊娠期奶牛乳腺,在泌乳期采集乳汁检测蚓激酶表达,结果显示,蚓激酶在乳腺中实现了稳定表达。在上述试验基础上,将重组逆转录病毒制成转染液,单侧注射3月龄雄性家兔睾丸曲细精管。待其发育成熟后,利用该家兔进行繁殖,对获得的子代兔进行目的基因的PCR及Southern blotting检测,结果显示:PCR及Southernblotting检测结果一致,本试验获得的转基因家兔阳性率为6.25%。
周兴[8]2007年在《蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建》文中研究说明蚓激酶(lumbrokinase,LK)作为一种新型的溶栓药物,正在广泛应用于心脑血管疾病的预防和治疗。目前临床应用的LK均是从蚯蚓体内直接提取,其制备工艺繁杂,产量较低,因而通过基因工程手段生产大量高纯度的LK已成为一种极有前景的途径。本试验在之前工作基础上构建了含有蚓激酶基因的重组逆转录病毒载体,然后以牛体做为生物反应器,在牛奶中瞬时表达蚓激酶,以期验证载体构建的合理性,为最终获得转基因奶牛等乳腺生物反应器提供一定的理论和实验依据。首先将含有山羊β-酪蛋白基因(β-casein)5’区调控序列(BCP)、蚓激酶基因(lumbrokinase)以及牛生长激素基因polyA(BGHpolyA)序列的表达盒克隆到骨架为Moloney小鼠白血病病毒(缺失基因组)、含有标记基因Neo~R的逆转录病毒载体pLNCL中,构建了蚓激酶重组逆转录病毒载体pLN-BCP-LK~R。以生理盐水为溶剂,将质粒转染泌乳期奶牛乳腺小叶,收集不同时段奶样,采用纤维蛋白平板溶圈法(Fibrin Agarose Plate Assay,FAPA)检测其纤溶活性,结果显示,BCP作为乳腺特异性启动子能指导目的基因即蚓激酶基因在奶牛乳腺组织实现有效瞬时表达,并且根据FAPA法检测结果表明奶牛乳腺组织在注射重组质粒转染3h后,奶样即出现明显纤溶,6～16h纤溶活性达到最高,持续时间40～60h,有的甚至可达78h,以尿激酶标准品制作标准曲线计算出最高表达量约为40000UK/L牛奶。将表达目的蛋白的奶样经SDS-PAGE凝胶电泳检测,结果显示:表达的蚓激酶分子量约为40kDa。表明牛奶中有蚓激酶的瞬时表达,分子量比理论计算值稍大,可能是其经糖基化等修饰的结果。由于现在没有获得针对蚓激酶的特异性抗体,所以未能进行Western blot检测。
占剑峰[9]2013年在《磷脂酶A1的发酵制备、分离纯化及催化特性的研究》文中指出酶法脱胶是油脂精炼过程中的一种生化脱胶技术，相比传统脱胶方法，具有高效、绿色环保等优点。目前市场上使用的磷脂酶存在反应条件要求严格，不能回收利用等问题，限制了磷脂酶在工业生产中的应用。本研究以实验室保存的Bacillus cereus sp. AF-1为出发菌株，以提高发酵液磷脂酶活力为目的，优化发酵工艺得到较高酶活力的粗酶液，通过分离纯化得到磷脂酶并对其性质进行分析评价；采用化学修饰、固定化等方法来提高磷脂酶的稳定性和重复使用性，以期为磷脂酶的开发利用探索新的途径。主要研究内容与结果如下：1.采用NaOH滴定法测定磷脂酶活力，通过单因素实验和响应面实验优化，确定磷脂酶活力测定的最优条件为：底物质量浓度4g/100mL、反应终点pH值9.0、酶液稀释倍数100倍、反应pH值5.1、反应温度53℃、反应时间8min。结果表明NaOH滴定法是一种准确、快捷的测定磷脂酶活力的方法。2.以Bacillus cereus sp. AF-1为出发菌株，采用发酵法得到粗酶液，通过对培养基组成和发酵工艺条件的优化，并从摇瓶水平扩大到15L发酵罐水平，得到的最佳培养基为：葡萄糖浓度为2%，蛋白胨浓度为3%，无机盐的组成为：Na_2HPO_4·12H_2O1.5%，KH_2PO_4·2H_2O0.3%，MgSO_4·7H_2O0.06%，CaCl_20.01%；15L发酵罐最佳发酵条件为：发酵时间为30h、发酵温度为35℃、发酵液pH为7.5、接种量为10%、通气量为0.3m3/h。此条件下得到的粗酶液酶活力为41.57U/mL。3.粗酶液通过硫酸铵沉淀及透析、DEAE-52离子交换层析、葡聚糖凝胶G-75凝胶层析等方法进行分离纯化，得到的磷脂酶类型为PLA1，其分子量为20kD，酶活力为1195.24U/mg，磷脂酶A1的Km和Vmax分别为11.11mg/mL和1.302mmol/L mg；最佳作用温度和pH值分别为35℃和7.5；4℃下贮藏5周，磷脂酶的酶活力没有变化，贮藏8周，能保持90%以上的酶活力。4.采用化学修饰剂CC-mPEG对磷脂酶进行修饰，当修饰率为14%，酶活力回收率为88.75%时，得到的修饰酶MPLA1分子量约为25kD，MPLA1的热稳定性、pH稳定性、对底物的亲和力以及催化效率都得到了提高。酶在337nm处最大荧光强度的降低和圆二色谱β-折迭的降低和回转的升高，从MPLA1结构上进一步说明了修饰酶比PLA1具有更好的稳定性。5.采用聚乙烯醇-海藻酸钠为载体，以固定化酶的活力，酶活力回收率和稳定性等参数为主要评价指标，对磷脂酶进行固定化，确定最佳工艺条件为：载体聚乙烯醇和海藻酸钠的浓度分别为10%和2%，交联剂硼酸和氯化钙的浓度分别为4%和2%，固定化时间为30min，酶的添加量为10mg/100g，固定化酶(IPLA1)的粒径为4mm；相比游离酶，IPLA1的最佳作用温度和pH值以及热稳定性和pH稳定性较游离酶得到提高；IPLA1重复使用8次，剩余酶活力仍然超过50%；在4℃下贮藏9周，IPLA1能保持90%以上的酶活力。6.粗酶、纯化后的磷脂酶（PLA1）、修饰酶（MPLA1）和固定化酶（IPLA1）用于菜籽毛油脱胶，以毛油中磷含量为依据，对四种酶的脱胶效果进行比较，研究结果表明：粗酶能将毛油中磷含量降低到10mg/kg以下，但酶的使用量和作用时间均高于其他叁种酶；当添加量为480U/kg，处理3h时，PLA1和IPLA1将毛油中磷的含量降低到10mg/kg以下，MPLA1将毛油中磷的含量降低到5mg/kg以下。PLA1经化学修饰和固定化后得到的MPLA1和IPLA1具有较好的脱胶效果。
田鹏[10]2009年在《蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测》文中研究说明蚯蚓纤溶酶(Earthworm Fibrinolytic Enzymes,EFE),又称蚓激酶,属于多组分的蛋白水解酶类,它们广泛分布于多种蚯蚓的消化道内腔及体液中,可能与摄取食物的吸收和利用有关。蚓激酶可以直接水解纤维蛋白,因此,它们既具有溶解现有血栓、也同时具有阻止血栓继续形成的功效;此外,有部分种类的蚓激酶还可以将纤溶酶原激活并转化为纤溶酶、或刺激人血管内皮细胞释放组织纤溶酶原激活剂(t-PA),从而能够间接溶解血栓。与其它溶栓剂所不同的是,蚓激酶的毒副作用比较小,而且还可以口服给药,因此,作为一种新型的溶栓药剂,无疑具有十分广阔的应用前景。目前,在临床上应用的蚓激酶均源自人工饲喂的蚯蚓,然而,依靠人工从蚯蚓中提取蚓激酶仍然存在很多问题,比如蚯蚓饲养和繁殖周期长,生产工艺复杂和生产质量不稳定等,这些不利因素都在很大程度上制约了蚓激酶的规模化生产、利用及普及。在转基因植物中表达蚓激酶单一组分,开辟了利用植物生物反应器生产蚓激酶的新领域,可为今后蚓激酶药物降低生产成本和在临床上的更广泛应用奠定坚实基础。本研究选用苜蓿和丹参这两种常见的植物作为表达蚓激酶单一组分的宿主植物,这是因为:1)苜蓿是世界上最重要的豆科牧草之一,具有品质优、产量高、适应性强、易于贮存以及加工等许多的优点,此外,其作为生物反应器生产的重组类蛋白药物可直接口服,而且无毒无害,便于今后的规模化生产和推广;2)丹参作为一味历史悠久的中药,其本身具有扩张冠状动脉、降低胆固醇和血脂、抑制凝血和激活纤溶系统等多种作用,在临床治疗心脑血管疾病方面应用广泛且疗效十分显着。若实现蚓激酶在丹参中的表达,可通过二者的协同作用,进一步增强丹参在防治心血管疾病方面的疗效,改善丹参的药用品质。在苜蓿生物反应器构建过程中,利用本课题组先前建立的比较成熟的苜蓿组织培养再生体系,通过农杆菌介导方法,成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到保定苜蓿中,先后获得转CST1基因的卡那霉素抗性再生苗130株和转CST2-1基因的卡那霉素抗性再生苗92株。对这些转基因植株进行PCR和PCR Southern检测,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到苜蓿基因组中。通过ELISA,对外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现多数卡那霉素抗性植株在405nm处的吸光值都大于非转基因苗(阴性对照),但与蚓激酶肠溶胶囊溶剂相比,其数值偏低,这表明蚓激酶基因在转基因苜蓿细胞中是有表达的,但表达效率非常低。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因苜蓿叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因苜蓿中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。在丹参生物反应器构建过程中,首先通过对丹参的转化和培养条件进行了优化,使丹参再生幼苗的褐化和玻璃化现象大大减轻,更加完善了丹参的组织培养遗传转化再生体系。通过农杆菌介导方法,同样成功地将蚓激酶CST1和CST2-1基因分别导入到丹参中,分别获得卡那霉素抗性再生苗25株和33株。对这些再生植株进行PCR和PCR Southern检测和分析,结果证实多数卡那霉素抗性植株分别含有上述蚓激酶编码组分。从PCR检测为阳性的转CST2-1基因再生植株中,任意选取两株进行基因组DNA Southern Blot检测,结果证实目的基因CST2-1确实已整合到丹参基因组中。同样利用ELISA法对蚓激酶外源蛋白表达情况进行了检测与分析,结果发现外源蛋白表达普遍微弱,在一定程度上稍微高于转基因苜蓿的结果类似。外源转基因遗传稳定检测结果发现,经多3～5次无性继代培养后的转基因丹参叶片在含有卡那霉素的培养基上仍能正常分化出健康的愈伤组织,这表明外源的蚓激酶基因在转基因丹参中通过无性繁殖可以稳定遗传给后代。
参考文献：
[1]. 蚓激酶分子修饰的研究[D]. 易喻. 浙江工业大学. 2004
[2]. 单甲氧基聚乙二醇修饰蚓激酶的制备及性质研究[J]. 应国清, 易喻, 石陆娥, 王普, 胡妙申. 高校化学工程学报. 2005
[3]. 蚓激酶基因在原核和毕赤酵母中的表达[D]. 孔航天. 吉林大学. 2008
[4]. 一种新型海洋纤溶酶的研究[D]. 王佃亮. 中国海洋大学. 2006
[5]. 单环刺螠纤溶酶Ⅲ的基因克隆及表达[D]. 杜芳. 中国海洋大学. 2013
[6]. 蚓激酶基因在毕赤酵母中的表达[D]. 张成瑶. 天津大学. 2007
[7]. 蚓激酶基因在牛乳腺中的表达及其转基因兔的建立[D]. 刘殿峰. 吉林大学. 2006
[8]. 蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建[D]. 周兴. 石河子大学. 2007
[9]. 磷脂酶A1的发酵制备、分离纯化及催化特性的研究[D]. 占剑峰. 合肥工业大学. 2013
[10]. 蚓激酶转基因苜蓿（Medicago sativa）及丹参（Salvia miltiorrhizae）的构建及检测[D]. 田鹏. 中国农业科学院. 2009
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