基于O型口蹄疫病毒样颗粒的竞争ELISA方法的建立及应用

论文摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是造成畜牧业经济严重损失的传染病之一,FMD的爆发不仅严重降低了畜群的生产力,还影响易感动物及其产品的进出口贸易。目前,已开发多种ELISA方法广泛用于检测畜群口蹄疫病毒抗体。但是,基于不同形式和抗原类型的ELISA方法存在抗原制备困难,病毒扩散风险高、假阳性高、敏感性较低及操作复杂等不同的缺点。本实验室前期研究证实,O型FMD病毒样颗粒（VLPs）类似天然的口蹄疫病毒、能诱导机体免疫性保护、易于制备且不受生物安全设施的限制、安全性高。因此,本研究以O型FMD VLPs作为诊断抗原,建立竞争ELISA方法检测O型口蹄疫病毒抗体,以期为FMD检疫和防控提供技术手段。本研究经原核表达、纯化及组装制备O型FMD VLPs,将所得目的蛋白分别进行SDS-PAGE、DLS、TEM及Western blot试验鉴定,并测定其蛋白浓度;以试验所得O型FMD VLPs为抗原免疫家兔制备高免血清,并通过饱和硫酸铵沉淀法、Protein A亲和层析法及过碘酸钠法,对高免血清中的IgG进行纯化和标记,得到HRP-IgG后进行SDS-PAGE和Western blot试验鉴定及ELISA方法测定其效价;以O型FMD VLPs作为诊断抗原建立竞争ELISA方法,试验通过棋盘交叉滴定法、方阵滴定法及绘制ROC曲线等方法确定了竞争ELISA方法最佳试验条件及判断标准,组装试剂盒并进行交叉反应试验,特异性试验、敏感性试验、符合率试验、批内和批间重复性试验及37℃加速保存试验。试验结果如下:原核表达、纯化及组装成功获得O型FMD VLPs,其粒径大小基本聚集在20 nm50 nm之间,与天然FMDV颗粒大小相似,其可与O型FMDV阳性血清发生特异性反应,测定其浓度为836.7μg/mL;以O型FMD VLPs为抗原免疫家兔,成功制备高免血清。纯化和标记高免血清中的IgG,成功获得HRP-IgG,测定HRP-IgG抗体滴度大于1:640 000,且HRP-IgG可与O型FMD VLPs特异性结合;竞争ELISA方法的最佳试验条件及判断标准如下:抗原包被浓度为0.5μg/mL,血清稀释度为1:4,酶标抗体稀释度为1:18 000,抗原包被条件为4℃过夜或37℃2.5 h,封闭液为1%BSA,封闭液作用条件为37℃30 min,血清和酶标抗体作用条件为37℃30 min,底物作用条件为37℃10 min,临界值设定为PI=50%,即PI<50%判为阴性血清,当PI≧50%判为阳性血清。通过不同试验证实该检测方法无交叉反应,敏感性为96%,特异性为100%,批内和批间重复试验变异系数均小于15%,与LPB-ELISA试剂盒、VDpro?ELISA试剂盒及PrioCHEK?ELISA试剂盒的符合率分别是97%、99%及97%;37℃加速保存试验显示试剂盒能在37℃条件下保存至少7天。本研究成功建立用于O型口蹄疫病毒抗体检测的竞争ELISA方法并组装试剂盒,并证实该检测方法具有敏感、特异、简单及稳定等优点,可为FMD防控提供更好的检测技术,并具有良好的应用前景。

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摘要

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第一章绪论

1.1 口蹄疫概述

1.1.1 口蹄疫病毒的结构

1.1.2 口蹄疫病毒的血清型

1.1.3 口蹄疫的危害

1.2 口蹄疫的诊断方法

1.3 病毒样颗粒

1.4 本研究的目的和意义

第二章 O型 FMD VLPs原核表达、纯化及高免血清的制备

2.1 材料

2.1.1 主要试剂、菌种、试验动物

2.1.2 主要仪器

2.2 方法

2.2.1 O型 FMD VLPs原核表达及纯化

2.2.2 O型 FMD VLPs的鉴定

2.2.3 O型 FMD VLPs的浓度测定

2.2.4 O型 FMD VLPs高免血清的制备

2.2.5 高免血清中IgG纯化及标记

2.3 结果与分析

2.3.1 O型 FMD VLPs表达及纯化鉴定结果

2.3.2 O型 FMD VLPs的浓度测定结果

2.3.3 O型 FMD VLPs高免血清的制备结果

2.3.4 IgG标记结果

2.3.5 HRP-IgG抗体滴度测定结果

2.4 讨论

第三章竞争ELISA方法的建立

3.1 材料

3.1.1 血清

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器

3.2 方法

3.2.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定

3.2.2 酶标抗体最佳稀释度的确定

3.2.3 抗原包被的最佳温度与时间的确定

3.2.4 封闭液的筛选

3.2.5 封闭液作用的最佳温度与时间的确定

3.2.6 血清和酶标抗体共同作用的最佳温度与时间的确定

3.2.7 底物TMB作用的最佳温度与时间的确定

3.2.8 判断标准的确定

3.3 结果与分析

3.3.1 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定结果

3.3.2 酶标抗体最佳稀释度确定结果

3.3.3 抗原最佳包被温度和时间的确定结果

3.3.4 最佳封闭液的确定结果

3.3.5 封闭液作用的最佳温度和时间的确定结果

3.3.6 血清与酶标抗体共同作用的最佳温度和时间的确定结果

3.3.7 底物作用的最佳温度和时间的确定结果

3.3.8 判断标准的确定结果

3.4 讨论

第四章试剂盒参数的优化

4.1 材料

4.1.1 血清

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器

4.2 方法

4.2.1 竞争ELISA方法步骤

4.2.2 交叉反应试验

4.2.3 特异性和敏感性试验

4.2.4 符合率试验

4.2.5 批内和批间重复试验

4.2.6 试剂盒的37℃加速保存试验

4.3 结果与分析

4.3.1 交叉反应试验结果

4.3.2 特异性和敏感性试验结果

4.3.3 符合率试验结果

4.3.4 批内和批间重复试验结果

4.3.5 试剂盒的37℃加速保存试验结果

4.4 讨论

第五章结论

参考文献

致谢

个人简历

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 杨志元

导师: 冉旭华

关键词: 口蹄疫,型口蹄疫,病毒样颗粒,高免血清,竞争

来源: 黑龙江八一农垦大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 黑龙江八一农垦大学

基金: 国家重点研发计划(2016YFD0500700,2017YFD0500900,2017YFD0501100),国家自然科学基金项目(31672592),中央级科研院所基本科研业务费专项(1610312016002,1610312018003),黑龙江八一农垦大学研究生创新科研项目(YJSCX2017-Y43)

分类号: S852.65

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