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JEV来源sRNA的鉴定与功能分析

2020-12-08阅读(353)

JEV来源sRNA的鉴定与功能分析

论文摘要

乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）属于黄病毒科黄病毒属病毒,它能入侵中枢神经系统,造成神经炎症反应,导致人和动物发病甚至死亡,是一种危害严重的人兽共患病病原。sRNA（Small RNA）是一类长度上为约18-30nt的调控性RNA分子,主要包括微小RNA（miRNA）、干扰小RNA（siRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、Piwi蛋白互作RNA（piRNA）等。sRNA几乎普遍存在于所有生命体中,并在细胞增殖、分化和凋亡、癌症以及病毒感染中起重要作用。但目前对乙型脑炎病毒sRNA的研究报道较少,病毒编码sRNA的功能及其在病毒与宿主相互联系中所起的作用尚不清楚,因此研究JEV来源的sRNA对深入理解其致病机制具有重要意义。本研究具体内容如下:通过RT-PCR和IFA鉴定,利用BHK-21和C6/36细胞从上海市嘉定区猪场蚊媒样品中成功分离出1株JEV,命名为JD-15株。该毒株源自中华按蚊,用JD-15株分别感染BHK-21和C6/36细胞,72h后所有细胞均发生明显病变,其病毒滴度为1.96×106PFU/0.1mL。用分离株JD-15脑内接种3周龄乳鼠,结果测得半数致死量(LD50)为4.2×101 PFU/0.1mL,表明该毒株具有较强的神经毒力。对JD-15株的E基因进行克隆测序及进化分析,结果显示,该株JEV属于基因Ⅲ型,与减毒活疫苗株SA-14-14-2的E基因核苷酸序列的同源性为98.1%,氨基酸序列的同源性为97.5%。用JEV感染鼠脑,提取总RNA进行深度测序,得到约31,543,891条小RNA序列,其中超过55000条序列可以匹配到乙脑病毒基因组,它们的长度多在19-24nt之间。为从测序结果中找到可能由JEV编码的sRNA,参考文献并利用RNAfold进行前体结构预测,由此筛选出四条候选的sRNA。为鉴定JEV编码的sRNA,我们用加尾法qRT-PCR检测感染5MOI JEV的BHK-21,PIEC和A549细胞的sRNA表达水平,结果发现有一条sRNA易检测到,而另外三条表达水平较低,因此将表达量较高的sRNA命名为JEV-32。随后建立了一种茎环法反转录的qRT-PCR方法,并用Northern blot试验一起进一步验证JEV-32在上述细胞中的表达。此外,我们研究了JEV-32的进化保守性,发现该分子高度保守,不限于特定的乙脑分离株,而是普遍存在于乙型脑炎病毒中。为探究JEV-32的分子合成途径,将Drosha、DCR1和Ago2的siRNA和对照分别转染到A549细胞,转染24h后用0.01MOI JEV感染,感染后48h用茎环qRT-PCR检测JEV-32的表达量,结果显示Drosha、DCR1和Ago2均参与了JEV-32的生物合成。为探究JEV-32对乙型脑炎病毒复制的影响,向BHK-21细胞转染其类似物或对照及抑制物或对照,随后用JEV感染进行试验,结果表明JEV-32在病毒RNA复制中起促进作用。本研究通过深度测序筛选了来源于JEV的小RNA,对其进行鉴定和功能分析,发现JEV编码的miRNA样小RNA——JEV-32对病毒复制具有正向调控作用,这为研究小RNA在病毒感染过程中发挥的作用及其对宿主影响的机制提供了科学基础。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第一章 引言
  •   1.1 乙型脑炎概述
  •   1.2 乙型脑炎病毒概述
  •     1.2.1 乙型脑炎病毒的形态结构及理化特性
  •     1.2.2 乙型脑炎病毒基因组结构
  •     1.2.3 乙型脑炎病毒的复制周期
  •     1.2.4 乙型脑炎病毒编码蛋白的功能
  •     1.2.5 乙型脑炎病毒的细胞嗜性
  •   1.3 病毒SRNA的研究概况
  •     1.3.1 sRNA的分类和特征
  •     1.3.2 病毒sRNA的生物合成
  •     1.3.3 病毒sRNA的作用机制
  •     1.3.4 sRNA的生物学功能
  •     1.3.5 sRNA的检测方法
  •     1.3.6 sRNA靶基因预测
  •   1.4 本文研究目的及意义
  • 第二章 蚊媒JEV的分离鉴定与序列分析
  •   2.1 实验材料
  •     2.1.1 实验动物和细胞
  •     2.1.2 主要试剂
  •     2.1.3 主要仪器
  •     2.1.4 试剂的配置
  •   2.2 实验方法
  •     2.2.1 蚊虫样本的处理
  •     2.2.2 病毒的分离培养
  •     2.2.3 RT-PCR鉴定
  •     2.2.4 测序鉴定
  •     2.2.5 间接免疫荧光鉴定
  •     2.2.6 病毒滴度测定
  •     2.2.7 小鼠致病性试验
  •     2.2.8 序列分析
  •   2.3 结果
  •     2.3.1 蚊虫样本的统计
  •     2.3.2 细胞病变的观察
  •     2.3.3 RT-PCR鉴定
  •     2.3.4 间接免疫荧光鉴定
  •     2.3.5 病毒滴度测定与小鼠致病性试验
  •     2.3.6 序列分析
  •   2.4 讨论
  • 第三章 JEV sRNA的高通量测序、生物信息学分析及定量检测
  •   3.1 材料
  •     3.1.1 实验动物和细胞
  •     3.1.2 主要试剂
  •     3.1.3 主要仪器
  •     3.1.4 试剂的配置
  •   3.2 方法
  •     3.2.1 高通量测序样品的制备
  •     3.2.2 Solexa高通量测序
  •     3.2.3 测序结果的生物信息学分析
  •     3.2.4 JEV sRNA的定量检测
  •     3.2.5 JEV sRNA的保守性分析
  •   3.3 结果
  •     3.3.1 毒株的特性
  •     3.3.2 Total RNA的质量分析
  •     3.3.3 测序结果的生物信息学分析
  •     3.3.4 JEV s RNA的定量检测
  •     3.3.5 JEV s RNA的保守性分析
  •   3.4 讨论
  • 第四章JEV s RNA的鉴定及功能分析
  •   4.1 材料
  •     4.1.1 主要试剂
  •     4.1.2 主要仪器
  •     4.1.3 试剂的配置
  •   4.2 方法
  •     4.2.1 引物和探针的设计与合成
  •     4.2.2 RNA oligo的设计与合成
  •     4.2.3 茎环法q RT-PCR鉴定
  •     4.2.4 Northern blot鉴定
  •     4.2.5 转染
  •   4.3 结果
  •     4.3.1 茎环法q RT-PCR鉴定
  •     4.3.2 Northern blot鉴定
  •     4.3.3 JEV-32 的分子合成途径
  •     4.3.4 JEV-32 促进乙脑病毒的复制
  •     4.3.5 JEV-32 的靶基因预测
  •   4.4 讨论
  • 第五章 全文结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 刘茜倩

    导师: 马志永

    关键词: 乙型脑炎病毒,分离鉴定,病毒复制

    来源: 中国农业科学院

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学

    单位: 中国农业科学院

    分类号: S852.65

    总页数: 72

    文件大小: 4812K

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