叶飞娟[1]2004年在《构建鳜鱼多位点基因打靶载体的研究》文中研究说明随机插入的转基因方法严重阻碍了外源基因在转基因动物体内的有效整合和稳定遗传及表达，基因打靶技术可以解决这个问题。但基因打靶效率太低，本研究的目的就是在建立的体外多位点基因打靶技术的基础上，构建鳜鱼多位点基因打靶载体，为开展多位点基因打靶技术的动物体内实验提供关键材料。 先以SP1416-T质粒为模板设计2对引物(HRDS11／HRDS12和HRDS21／HRDS22)分别扩增同源引导序列HRDS1和HRDS2，将扩增产物克隆到pMD18-T质粒。并依次将HRDS1、HRDS2克隆到已构建的pCTKNeo通用打靶载体中，构建成鳜鱼专用打靶载体pCTKNeo-HRDS1／2。然后以pCDNA3-hIFN1质粒为模板设计引物(IF1／IF2)扩增hIFN基因，将hIFN基因的扩增产物克隆到pCTKNeo-HRDS1／2载体上，经PCR、酶切、测序鉴定，最后构建成适用于鳜鱼的干扰素基因多位点打靶载体，即pCTKNeo-HRDS1／2-hIFN。
唐冬生, 严霞, 李芳, 张细权, 蒋泓[2]2005年在《以重复序列为靶位点的鳜鱼多位点基因打靶载体的构建》文中进行了进一步梳理以鳜鱼(Sinipercachuatsi)为研究对象,以其重复的rRNA基因间的间隔序列为靶位点构建多位点基因打靶载体,为建立体内多位点基因打靶技术获得关键材料。先构建含TK和Neo基因的通用打靶载体pCTKNeo。采用LATaq高保真酶扩增获得左、右同源重组引导臂HRDS1、HRDS2,经T质粒克隆后,分别插入到pCTKNeo载体Neo基因的上下游,构建成鳜鱼专用的多位点打靶载体pCTKNeoHRDS1/2。同样将干扰素基因hIFN插入到pCTKNeoHRDS1/2载体的Neo基因与HDRS2之间。每次克隆均经PCR、酶切和测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向,最终构建成多位点基因打靶载体pCTKNeoHRDS1/2hIFN。目前的基因打靶技术存在打靶效率低、安全性等问题,以重复序列为靶位点的多位点基因打靶技术将部分解决这些问题。
参考文献：
[1]. 构建鳜鱼多位点基因打靶载体的研究[D]. 叶飞娟. 湖南农业大学. 2004
[2]. 以重复序列为靶位点的鳜鱼多位点基因打靶载体的构建[J]. 唐冬生, 严霞, 李芳, 张细权, 蒋泓. 中国水产科学. 2005