低底物亲和力论文_魏喜换

导读:本文包含了低底物亲和力论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:亲和力,聚糖,甘露,理性,论文,低底物。

低底物亲和力论文文献综述

魏喜换^[1]（2014）在《基于理性设计的β-甘露聚糖酶底物亲和力的定向改造》一文中研究指出β-甘露聚糖酶（endo-β-1,4-D-mannanase, EC3.2.1.78）广泛存在于各种生物体尤其是微生物中，能从甘露聚糖的主链内部随机水解β-1,4-D-甘露糖苷键产生低聚甘露糖。它在食品、制药、饲料、造纸、纺织和生物能源等领域彰显广阔的应用前景。采用同源建模和分子对接模拟等方法预测宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）GH5家族β-甘露聚糖酶（AuMan5A）与甘露二糖对接复合物的空间结构，使用PyMol软件统计到38个距离甘露二糖8以内的氨基酸位点。通过多序列比对排除21个保守氨基酸位点，参考氨基酸性质及其所处空间位置从AuMan5A的17个非保守氨基酸中选取5个芳香族氨基酸Trp54、Tyr111、Tyr115、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸，将它们分别替换为性质相似的或在其它β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸，形成一系列拟突变酶。采用分子力学泊松-波尔兹曼表面积（MM-PBSA）法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能，其中拟突变酶AuMan5AY111F和AuMan5AY115F与配体分子的结合自由能分别为-56.8kcal/mol和-75.0kcal/mol，低于AuMan5A及其它拟突变酶。选择结合自由能升高至-20.8kcal/mol的拟突变酶AuMan5AY243A作为阴性对照。基于理性设计结果采用大引物PCR技术分别扩增突变酶基因Y111F、Y115F和Y243A，并构建重组表达质粒pPIC9K-Y111F、pPIC9K-Y115F和pPIC9K-Y243A。将它们和pPIC9K-Auman5A用SacⅠ线性化后电击转化至毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达后测得重组原酶WT、重组突变酶Y111F和Y115F对角豆胶的最高酶活性分别可达44.8U/mL、53.0U/mL和50.4U/mL。重组突变酶Y243A则未表现出任何酶活性，说明Tyr243对AuMan5A活性的维持至关重要。经(NH4)2SO4盐析、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、超滤及SephadexG-75凝胶过滤层析纯化，WT、Y111F和Y115F对角豆胶的比酶活分别为209.5U/mg、293.0U/mg、284.1U/mg，纯化倍数分别为1.9、2.2、1.8，回收率分别为48.4％、52.6％、56.8％。SDS-PAGE电泳分析可知，纯化后的重组酶为单一条带，表观分子量约为49.5kDa。WT、Y111F和Y115F对瓜尔豆胶的Km值分别为(4.49±0.07) mg/mL、(2.95±0.22)mg/mL、(2.39±0.33) mg/mL。与WT相比，Y111F和Y115F对瓜尔豆胶的Km值分别降低了34.3%和46.8%，催化效率分别增加了0.5倍和0.7倍，其它性质几乎不变。结构分析表明突变酶Y111F和Y115F通过降低复杂底物结合的空间位阻来提高其亲和力。采用大引物PCR技术构建双突变酶基因Y111F/Y115F，并成功实现其在毕赤酵母GS115中的异源表达，测得重组双突变酶Y111F/Y115F的活性为45.7U/mL。用同样的方法纯化该酶，最终其对角豆胶的比酶活为327.5U/mg，纯化倍数为2.4，回收率为58.5％。该酶对瓜尔豆胶的Km值为(2.89±0.24) mg/mL，与WT相比，其Km值降低了35.6%，催化效率提高了1.5倍，而其它酶学性质几乎不变。运用本研究获得的重组酶水解瓜尔豆胶，初步优化的水解条件为：瓜尔豆胶（水溶液）浓度20g/L，Y111F/Y115F添加量60U/g瓜尔豆胶，50℃酶解6h，在此条件下瓜尔豆胶的水解率可达18.7%。本论文的理性设计并结合定点突变技术用于提高宇佐美曲霉β-甘露聚糖酶底物亲和力的实验方案和结果，迄今为止未见有国内外文献报道。(本文来源于《江南大学》期刊2014-04-01）

魏喜换,王春娟,赵梅,李剑芳,邬敏辰^[2]（2014）在《基于理性设计的β-甘露聚糖酶底物亲和力的定向改造》一文中研究指出以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50%的β-甘露聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点,依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置,选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸,将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸,形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind),其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7kJ/mol,较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC,构建出突变酶基因(Auman5AY111F).分别将Auman5AY111F和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的Km值由突变前的3.9mg/mL降低为2.5mg/mL;而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计,并通过定点突变证实之,这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.(本文来源于《浙江大学学报(农业与生命科学版)》期刊2014年01期）

低底物亲和力论文开题报告

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

以宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)YL-01-78的5家族β-甘露聚糖酶(AuMan5A)为研究对象,对其底物亲和力的定向改造进行理性设计及定点突变以获取米氏常数Km值较低的突变酶AuMan5AY111F.首先采用同源建模和分子对接模拟等方法预测AuMan5A与甘露二糖对接复合物的空间结构;在此结构上使用PyMol软件统计到距甘露二糖8以内的38个氨基酸位点.其次对不同来源的、与AuMan5A一级结构序列全同率大于50%的β-甘露聚糖酶进行多序列比对;排除21个保守氨基酸位点,依据17个非保守位点上的氨基酸性质及其所处空间位置,选择AuMan5A中的Tyr111、Phe206和Tyr243作为拟突变氨基酸,将它们分别替换为性质相似的或在其他β-甘露聚糖酶序列中出现频率高的氨基酸,形成一系列拟突变酶.最后采用MM-PBSA法计算AuMan5A及其拟突变酶与甘露二糖的结合自由能(ΔGbind),其中AuMan5AY111F的ΔGbind为-237.7kJ/mol,较其他酶的ΔGbind均低.基于该理性设计采用大引物PCR技术将AuMan5A基因(Auman5A)中编码Tyr111的密码子TAC突变为编码Phe111的TTC,构建出突变酶基因(Auman5AY111F).分别将Auman5AY111F和Auman5A在毕赤酵母GS115中进行表达,并对重组表达产物reAuMan5AY111F和reAuMan5A进行分离纯化和动力学常数测定.结果表明:reAuMan5AY111F对瓜尔豆胶的Km值由突变前的3.9mg/mL降低为2.5mg/mL;而突变前后酶的Vmax值变化不大.该研究运用多种生物信息学软件对提高AuMan5A底物亲和力进行了理性设计,并通过定点突变证实之,这为β-甘露聚糖酶乃至其他各种酶底物亲和力的定向改造提供了新的技术策略.

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。