刘琳[1]2014年在《我国中西部部分地区猪主要繁殖障碍病流行病学调查》文中进行了进一步梳理猪瘟（CSF）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）、猪伪狂犬病（PR）、猪圆环病毒2型（PCV2）目前危害我国规模化猪场的猪繁殖障碍疫病的主要病因。繁殖障碍疫病的感染引起母猪的流产和仔猪的死亡等，并通过水平传播感染健康猪群，从而对疫病的净化带来一定困难，造成极大的经济损失。本研究重点从血清学和病原学方面进行研究，从而为我国猪主要繁殖障碍疫病的预防和控制提供理论依据。本研究主要包括以下几方面内容：1.利用IDEXX公司的猪瘟、猪繁殖与呼吸综合症、猪伪狂犬病gB抗体检测试剂盒和哈尔滨维科生物技术开发公司的猪圆环病毒2型抗体检测试剂盒对我国中西部部分地区共计7个省市的规模化猪场的13516份猪血清进行抗体检测，结果表明四种繁殖障碍性疫病抗体水平合格率或阳性率分别为70.61%、84.46%、89.70%、85.98%，达到国家规定的标准，对猪群有较好的保护。2.病原学鉴定：通过RT-PCR方法对2012年2月至2014年4月采集的98份临床疑似猪繁殖障碍疫病的病料进行了CSFV、PRRSV、PRV、PCV2检测，共鉴定出3份CSFV阳性病料，19份PRRSV阳性病料，9份PRV阳性病料，40份PCV2阳性病料。这些病例主要表现为病毒体温高，大部分病例为呼吸道症状或繁殖障碍症状。本研究表明，我国中西部部分地区存在该四种疫病的感染，特别是PRRSV和PCV2的感染率较高分别为19.39%和40.82%，是目前导致猪繁殖障碍的主要病原。但尚无法判定PRRSV和PCV2是近年来猪繁殖障碍病的主凶。对我国中西部部分地区猪主要繁殖障碍病的血清学和病原学的调查结果，将为我国中西部地区猪繁殖障碍疫病的疫苗的研发、疾控部门的疫病防控策略的调整提供数据基础。
胡玲玲[2]2018年在《规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究》文中研究指明猪瘟(CSF)和猪伪狂犬病(PR)是感染猪的两种重要疫病,农业部于2008年将猪瘟列为一类动物疫病,伪狂犬病列为二类动物疫病,目前这两种疫病在我国一些规模化猪场普遍存在,直接或间接地影响着我国养猪业的持续健康发展。近年来,随着我国CSF和PR诊断技术和综合防控措施研究的不断突破与创新,以及CSF和PR的净化技术的成熟,规模化猪场CSF和PR的净化已被列入《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020)》。为进一步探索研究完善规模化猪场CSF和PR科学可行的净化方案,本研究对已建立的规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案在规模化猪场中的应用效果进行监测净化研究,并在以净化为目的条件下对规模化猪场CSF和PR展开了流行病学调查以及病原的分离鉴定工作。以期为后期规模化猪场CSF和PR的流行、变异、防控及净化提供一定的参考。1、规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病血清学调查研究为了更好的实施CSF和PR净化方案,试验对贵州省实施方案前的某规模化猪场采集的1 430份血液样品进行CSF和PR抗体ELISA检测,结果显示,在所检测的样品中,PRV gB抗体阳性率87.2%(1 247/1 430);其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的PRV gB抗体阳性率均在85%以上。PRV gE抗体阳性率4.48%(46/1 430);保育猪群中检出PRV gE抗体阳性率最高,为5.26%(12/228),育肥猪群中检测阳性率最低,为4.14%(11/266)。猪瘟抗体阳性率为84.27%(1205/1 430);其中种猪、后备猪、保育猪和育肥猪的猪瘟抗体蛋白阳性率均在80%以上。该研究结果为后期规模化CSF和PR的净化提供本底调查,并为贵州规模化CSF和PR的流行状况提供参考依据。2、规模化猪场CSFV和PRV病原学调查研究为了掌握规模化猪场CSFV和PRV的感染状况及相应病原特征,试验对贵州省实施方案前的某规模化猪场采集的1 430份扁桃体及血液样品进行CSF和PR的mPCR和单一PCR/RT-PCR检测,并对PCR/RT-PCR检测阳性的部分样本进行CSFV和PRV的分离鉴定。结果显示,猪伪狂犬病病原核酸阳性率为1.96%(28/1 430);实验成功分离得到1株猪伪狂犬病病毒,命名为Guizhou-T1株。该毒株接种Vero细胞盲传至第3代时开始产生CPE,盲传至第5代出现稳定的CPE,其TCID_(50)为10~(-10.11)/100μL;电镜下可见呈椭圆形、有囊膜、直径为120~180 nm病毒粒子,核内见呈晶格状排列的病毒包涵体;病毒悬液过滤后接种引起家兔奇痒、麻痹死亡。猪瘟病原核酸阳性率2.59%(37/1 430),其中保育猪群野毒阳性率最高,为3.07%(7/228);分离鉴定了一株猪瘟病毒,命名GZA株。该毒株接种PK-15细胞后连传7代RT-PCR均能扩增出CSFV E2基因阳性条带。间接免疫荧光试验表明CSFV确在PK-15细胞中得以增殖;病毒粒子在电镜下呈椭圆形或圆形,直径30~80 nm。研究结果初步摸清了规模化猪场PRV和CSFV病原学特点,为后期规模化猪场开展CSF和PR的净化提供了本底调查。3、规模化猪场CSFV和PRV分子流行病学调查研究为了解贵州省某规模化猪场CSFV和PRV的分子流行病学状况,本试验对该规模化猪场中的已检测CSF和PR部分阳性样品进行CSFV E2及PRV gE全基因进行的克隆、测序及序列分析。结果显示,4株PRV贵州流行株gE基因核苷酸同源性为99.6%~99.9%,氨基酸同源性为99.1%~99.8%,Guizhou-T1~T4株在gE48和gE496位有天冬氨酸(Asp D)的插入;遗传进化树显示:gE基因序列与2011年后所报道的变异毒株序列同属一个分支。并且Guizhou-T1株与GZ-Z1株和Guizhou-DY株同源性分别为97.5%和99.3%;与Guizhou DY株之间有8个氨基酸突变位点,与GZ-Z1株之间有26个氨基酸突变位点。实验获得的CSFV GZA株和GZB株E2基因与参考毒株的CSFV E2基因的核苷酸同源性为82.8%~83.4%,氨基酸同源性为88.7%~90.6%,经遗传进化树分析得出CSFV贵州分离株E2基因与参考毒株之间差异较大。该研究结果为贵州规模化猪场CSF和PR的遗传变异状况提供参考依据。4、规模化猪场猪瘟和伪狂犬病净化效果研究为研究规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病净化方案的应用效果,本试验分4次采集该方案实施猪场的1 776份扁桃体和1 776血液样品份,采用已建立的CSFV RT-PCR检测技术((GB/T 16551-2008))、PRV gE/gB-ELISA检测方法(GB/T18641-2002)和本实验室已建立的鉴别猪瘟和猪伪狂犬病野毒和疫苗毒mPCR方法,对贵州省某规模化种猪场CSF和PR开展了净化研究。对贵州省某规模化种猪场CSF和PR分4个阶段开展了净化研究。结果显示,实施净化方案后所检测PRV gB抗体阳性率从83.98%(367/437)上升到98.17%(429/437);PRV gE抗体阳性率从5.72%(25/437)下降到0.23%(1/437);猪伪狂犬病病原阳性率从2.75%(12/437)下降到0;猪瘟抗体阳性率从85.81%(375/437)上升到98.63%(431/437);猪瘟病原阳性率从2.06%(9/437)下降到0,表明采用该净化方案对猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化达到了预期的效果。该研究为规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病的净化思路提供一定的参考依据。
王红雷[3]2008年在《山东省母猪繁殖障碍类疾病的病因调查和综合防治措施研究》文中提出繁殖障碍性疾病是母猪生产中的主要疾病,主要表现为妊娠母猪流产、早产、产死胎、弱仔、畸形胎、木乃伊胎或长期不发情以及屡配不孕等。此类疾病传染性很强,母猪一旦感染,传播迅速,造成繁殖障碍。同时也可造成育肥猪大面积感染,导致巨大的经济损失。山东省是一个养猪大省,但近几年母猪繁殖障碍类疾病严重制约了养殖规模和经济效益。母猪繁殖障碍病的蔓延,使很多中小型猪场破产;大型猪场治疗成本增加而疾病净化难度增大。根据省畜牧兽医总站对山东省各县市畜牧兽医防疫部门的血清学普查统计结果,表明当前山东省母猪繁殖障碍病疫区主要分布于鲁中、鲁西和鲁南地区,主要流行疾病为猪伪狂犬病(PR)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和繁殖障碍型猪瘟。针对以上情况,我们做了以下3项研究:1.为了进一步鉴定山东省母猪繁殖障碍病的病原体,我们对鲁中、鲁南和鲁西地区6个大型猪场进行了为期2年的病例统计和病料采集。对89份病料采取细菌学培养、ELISA检测和RT-PCR检测,结果表明猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征是流行最严重的2种疾病,繁殖障碍型猪瘟仅占9例;猪繁殖与呼吸综合征与猪伪狂犬病分别占77.5%(69/89)和72%(64/89)。研究表明,猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征在发病猪场多为混合感染,混合感染率占52%,导致病情进一步加重。2.为提高母猪繁殖障碍性疾病诊断速度、精确度和特异性,我们通过建立多重PCR诊断方法,对猪瘟、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征和猪细小病毒病4种病毒进行了引物设计、PCR扩增,特异性片段定位,结果表明多重PCR方法在诊断此类疾病时,特异性较好且诊断速度快;临床病料检测进一步证实了多重PCR检测方法的准确性和特异性。3.基于目前山东省母猪繁殖障碍病流行特点,如何控制好繁殖母猪PR和PRRS疾病的流行,有利于山东省养猪业的健康发展,我们选择了山东省母猪繁殖障碍病疫区6个猪场中伪狂犬病流行最严重的台儿庄某大型种猪场作为研究对象。通过对700头种猪普免伪狂犬病弱毒活疫苗和抗体检测观察疫苗免疫效果,并检测淘汰野毒阳性公猪,并强化疫苗免疫,净化猪场伪狂犬病。结果表明,普免猪伪狂犬病gE基因缺失活疫苗对怀孕母猪安全可靠,明显提高母猪受胎率和仔猪成活率;公猪的生殖性能得以提高,普免后伪狂犬病平均抗体随母猪胎次升高而升高。通过疫苗免疫来控制和净化猪伪狂犬病,为猪繁殖障碍病的综合防治提供了理论依据;本试验的控制措施将为其他繁殖障碍病综合防治提供借鉴作用。总之,疫苗强制免疫,结合猪场综合防治措施,可以为山东母猪繁殖障碍病的控制提供有效保证。
熊加明[4]2017年在《近年来江西部分地区猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病流行病学调查》文中提出猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)和猪伪狂犬病(PR)是严重危害养猪业的叁大重要疾病,给养猪业造成了巨大的经济损失。为了解江西部分地区猪瘟(CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪伪狂犬病(PR)的发病及疫苗免疫情况,本研究对上述叁种病进行了病原学调查和血清学调查,从而为江西地区猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病的防制提供参考。主要内容如下:1江西部分地区CSF、PRRS和PR的病原学调查应用PCR和RT-PCR方法,对2014-2016年江西各地区猪场送检的病料,分别检测CSFV、PRRSV/HP-PRRSV和PRV,并结合2012-2016年叁种病的检测结果进行分析。结果显示:CSFV阳性率为54.9%,各年份阳性率从32.2%-73.1%不等,CSFV感染季节性不明显,四季阳性率从46.7%-63.4%不等;PRRSV阳性率为52.7%,各年份阳性率分布在36.1%-70.2%之间,PRRSV在秋季感染率较低;HP-PRRSV阳性率为33.2%,2013-2016年阳性率逐年上升,季节性不明显,各季节阳性率分布在26.9%-37.6%之间,秋季感染率最低为26.9%,其他季节感染率相近;PRV阳性率为32.5%,各年份阳性率差异不明显,从31%-37.6%不等,PRV感染季节性明显,春季与其他季节感染率差异明显。叁种病均以混合感染为主,双重感染率和叁重感染率分别为38%、8%,双重感染主要为“CSF+PRRS”。2江西部分地区猪群CSF、PRRS及PR的血清学调查应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,对江西部分地区送检的血清,分别进行CSF、PRRS和PRV-gB/gE抗体的检测。2014年1月-2016年12月间,共检测CSF抗体8826份,PRRS抗体8138份,PRV-gB抗体5819份,PRV-gE抗体6786份。结果显示:CSF、PRRS、PRV-gB和PRV-gE抗体的群体阳性率分别为72.6%、81.4%、91.7%和31.9%。CSF和PRV-gB抗体阳性率逐年上升,PRRS和PRV-gE抗体阳性率逐年下降。猪群CSF、PRV-gB/gE抗体阳性率冬季最低,PRRS抗体阳性率秋季最低。CSF抗体各阶段猪群阳性率分布在47.6%-85.1%,阳性率由高到低依次为:公猪85.1%、母猪84.3%、哺乳仔猪66.6%、育肥猪55.1%、保育猪最低为47.6%。PRRS抗体各阶段猪群阳性率范围为72.5%-88.8%,阳性率从高到低依次为:育肥猪88.8%、母猪84%、公猪81.1%、哺乳仔猪73.6%、保育猪72.5%。PRV-gB抗体各阶段阳性率从69.1%-98.5%不等,哺乳仔猪阳性率最高为98.5%,其次分别为:母猪97.8%、公猪94.6%、保育猪89.5%和育肥猪69.1%。PRV-gE抗体各阶段猪群阳性率范围为24.5%-40.3%,由高到低依次为:哺乳仔猪40.3%、保育猪34.7%、育肥猪31.1%、母猪29.9%、公猪25.5%。大规模化猪场猪群CSF、PRRS、PRV-gB抗体阳性率较中小规模化猪场高,PRV-gE抗体阳性率较低。
闫红军[5]2013年在《陕西省某规模化猪场4种病毒病疫苗免疫抗体检测与分析》文中研究表明长期的实践证明疫苗免疫接种是有效预防和控制动物疫病的最有效的手段，通过疫苗的免疫接种不但可以使动物对某种病原产生抵抗力，而且为疫病的最终控制或消灭打下基础。我国对动物疫病采取的是以疫苗免疫接种为主的综合防控措施，而对疫苗免疫效果的评价主要是检测免疫抗体的水平，只有抗体水平达到一定的滴度才能起到防止相应病原感染的目的。猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病是当前对规模化猪场危害严重的病毒性传染病，其中猪瘟和猪蓝耳病是我国强制免疫的重大疫病，猪圆环病毒病和猪伪狂犬病也是规模化猪场常规进行疫苗免疫接种的疫病。对疫苗免疫抗体水平的检测是规模化养猪场疫病监测的一项重要内容和常规工作，是制定猪场疫病防控方案的重要依据。本研究针对陕西省某规模化养猪场疫病防控中疫苗免疫接种的实际情况，分别采集了哺乳仔猪、保育猪、后备猪、基础母猪和种公猪的624份血清样品，对猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病、猪伪狂犬病等4种重要病毒病的疫苗免疫抗体水平进行了检测和评价，以期为该场这4种疫病的防控提供基础资料。获得了以下结果：1.对陕西省某规模化猪场猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病和猪伪狂犬病免疫抗体检测的结果表明：（1）猪瘟疫苗免疫抗体阳性率在72.62%～92.31%之间，平均阳性率为76.60%，其中，哺乳仔猪为72.62%，保育猪为76.92%，后备猪为75.00%，基础母猪为81.54%，公猪为92.31%；（2）猪蓝耳病疫苗免疫抗体阳性率在72.92%～88.17%之间，平均为83.33%，其中，哺乳仔猪为83.93%，保育猪为88.17%，后备猪为72.92%，基础母猪为87.69%，公猪为84.62%；（3）猪圆环病毒2型疫苗免疫抗体阳性率在81.66%～95.24%之间，平均为86.70%，其中，哺乳仔猪为95.24%，保育猪为81.66%，后备猪为83.33%，基础母猪为85.38%，公猪为92.31%；（4）猪伪狂犬病gE基因缺失苗免疫抗体阳性率在94.64%～100.00%之间，平均为98.24%，其中，哺乳仔猪为94.64%，保育猪为98.82%，后备猪为100.00%，基础母猪为100.00%，公猪为100.00%。2.疫苗免疫抗体检测结果说明，该规模化猪场猪瘟、猪蓝耳病、猪圆环病毒病和猪伪狂犬病疫苗免疫抗体阳性合格率均达到了国家规定的70%以上的要求，但哺乳仔猪的猪瘟免疫抗体阳性率和后备猪的猪蓝耳病免疫抗体阳性率偏低，还有待进一步提高。
蒋增海[6]2004年在《猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒的分离、鉴定》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种新的、高度传染性疾病，临床上以母猪发热、厌食、早产、流产、木乃伊胎、死胎、弱仔等繁殖障碍及各种年龄猪的呼吸症状和仔猪的高死亡率为特征。该病最早于1987年报道于美国南部，现已遍及世界各地，给全球养猪业造成巨大的经济损失。猪伪狂犬病是由疱疹病毒科α疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒(PRV，亦称猪疱疹病毒Ⅰ型)引起的一种急性传染病，在临床上，主要引起母猪流产、死胎和产木乃伊胎等繁殖障碍，初生仔猪呕吐、拉稀、呼吸困难、体温升高，15日龄内的仔猪死亡率几乎高达100％。近年来，全国各地很多猪场都出现了以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸困难为特征的传染病。为了弄清病因，解决生产实际，特此开展了猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒的分离和鉴定工作。 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒分离、鉴定 利用MARC-145细胞，从湖北、湖南、江西、河南、浙江等地发病仔猪和流产胎儿的肺脏中分离到疑似PRRSV多株，并对其中一株病毒进行了全面的鉴定。该病毒在MARC-145细胞上增殖滴度为10~(-4.39)/0.1ml，对氯仿敏感，56℃，1h完全灭活，不耐酸碱，不能被5’-碘脱氧尿核苷(IUDR)所抑制。在电镜下，病毒粒子呈球形，有囊膜，大小约为50～65nm。能被美洲型PRRSV阳性血清所中和，而不能被抗猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒等的阳性血清中和。为了进一步从分子生物学进行鉴定，设计了特异性引物对病毒的囊膜蛋白基因(ORF6)进行了RT-PER扩增，扩增到大小约为500bp的片段，与预期大小相当，而阴性对照则不能扩增出相应大小的片段。根据以上结果，证实所分离的病毒为猪繁殖与呼吸综合征病毒，并且属于美洲型，命名为PRRSV卧株。 2 猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5和ORF7基因的克隆及序列分析 根据GenBank上PRRSV VR-2332株的核苷酸序列，设计两对分别包含ORF5和ORF7基因完整编码区的引物。以本实验室分离的PRRSV HA株为模板，通过RT-PCR扩增出ORF5和ORF7全基因。克隆到pMD18-T载体上，获得重组质粒pMD-ORF5和pMD-ORF7，双脱氧末端终止法测序。结果显示PRRSV HA株ORF5基因大小为603bp，ORF7基因的大小为372bp。使用Blast软件分析发现PRRSV HA株ORF5基因和ORF7基因与美洲型代表株VR-2332株、中国分离的Bj-4株、欧洲型代表株LV株的核苷酸同源性分别是98％、99％、70％，99％、99％、93％。由该毒株的ORF5基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列与上述3个毒株的同源性分别猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病毒分离、鉴定是94%、94%、57%。这一结果也进一步证实了所分离的毒株为美洲型。3猪伪狂犬病病毒的分离及初步的鉴定 从湖北宜城市某猪场流产胎儿的内脏组织中分离到一株PRV，并进行了初步的鉴定。该病毒在BHK一21、IBRS一2、PK一15、MARC一145等细胞上均可以引起典型的细胞病变。在PK一巧细胞传代后，测得其TCI Dso为10-6’“9/0 .lml。该分离病毒可以被PRV标准阳性血清中和;以PRV标准阳性血清为一抗，进行间接免疫荧光检测，在荧光显微镜下可以观测到特异性的荧光反应。进一步利用特异性引物以所分离病毒的DNA为模板，扩增PRV gD基因，扩增到大小21 7bp的片段，与PRV鄂A株为模板扩增的gD基因片段大小一致。通过这些实验证实所分离的病毒为PRv，命名为PRv Yc株。用TcID50为10一“9/0 .lml的PRv Yc株病毒液，经腹腔接种昆明小鼠3只，每只0.2ml，3一5天后，所有小鼠死亡，而对照组2只的小鼠没有任何反应。说明所分离病毒对小鼠的毒力较强。
黄增燕[7]2013年在《华东地区某养猪场主要疫病免疫水平监测分析》文中研究说明本研究主要应用IDEXX酶联免疫分析试剂盒，分别对华东某养猪场送检的219份血清进行猪瘟病毒抗原及抗体、猪繁殖与呼吸综合征（蓝耳病）病毒抗体、猪伪狂犬病gpI及gB抗体检测，就其结果分析该猪场免疫水平。1）叁种传染病抗原和抗体的检测结果上述3种传染病抗原抗体检测结果得知猪瘟抗体水平的总阳性率是74.43%；猪瘟野毒感染的总阳性率是2.28%；猪伪狂犬抗体水平的总阳性率是70.78%；猪伪狂犬野毒感染的总阳性率是0.91%；猪蓝耳病病毒抗体水平的总阳性率是84.93%。结果表明，猪蓝耳病疫苗免疫效果最佳，猪瘟疫苗免疫效果次之，猪伪狂犬病疫苗免疫水平较低。2）不同年龄段健康猪的叁种传染病抗原和抗体的检测结果15周健康猪，猪蓝耳病抗体阳性率为96.67%，猪瘟抗体阳性率为58.33%，猪伪狂犬病抗体阳性率为41.67%，并且存在猪伪狂犬野毒感染，其阳性率为1.67%。33周健康猪，猪蓝耳病抗体阳性率为91.67%，猪伪狂犬抗体阳性率为86.67%，猪瘟抗体阳性率为83.33%，且结果显示有猪瘟野毒感染现象，其阳性率为1.67%。哺乳母猪，猪瘟抗体阳性率为85.88%，其野毒感染阳性率为4.71%；猪伪狂犬病抗体阳性率为80.00%，且无野毒感染；而猪蓝耳病抗体阳性率最低为74.12%。结果显示，哺乳母猪的猪蓝耳病抗体水平最低，而猪瘟和猪伪狂犬病抗体免疫水平都是15周猪的阳性率最低且未到达70%。上述表明猪场各群体的叁种抗体免疫水平参差不齐，波动范围较大，且不同年龄段的猪只都不同程度地存在猪瘟和猪伪狂犬野毒感染的情况，这种抗体水平波动应该与免疫程序有一定的关系，说明免疫程序需要调整。鉴于15周猪的抗体水平普遍偏低且有野毒感染的情况，我们认为抓住15周猪免疫是整个群体防疫的关键之一。从2013年1月开始在15周猪群改变免疫程序，即在8周龄时加一次免疫，再采集15周猪60份血清进行上述检测，其结果为：猪瘟抗体水平的阳性率是95%；猪瘟野毒感染的阳性率是0%；猪伪狂犬抗体水平的阳性率是90%；猪伪狂犬野毒感染的阳性率是0%，但有1头可疑；猪蓝耳病抗体水平的总阳性率是93.33%。
唐勇[8]2004年在《猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定》文中提出伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由α疱疹病毒科的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种烈性传染病。猪是该病毒的天然宿主和贮存者。该病给我国养猪业造成了巨大的经济损失。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在欧美等发达国家，伪狂犬病的根除计划多采用gE或gG基因标记疫苗和相应的gE或gG鉴别诊断方法来进行。gG糖蛋白是PrV的一种分泌蛋白，gE糖蛋白在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但两者都不是PrV增殖所必需的蛋白，因此可作为缺失的候选基因。目前我国已研制成功gE和gG基因标记疫苗。为了建立适合我国国情的gE和gG鉴别诊断方法，开展了以下研究。 1．PrV gG基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达 依据伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus PRV)Rice株序列，合成针对gG基因的特异性引物，从PRV鄂A株中扩增出gG基因，并将其克隆到pBluescriptⅡ SK+质粒中并测序，用SacⅠ和HindⅢ酶切，将gG基因融合到pET—28a质粒中T_7启动子下游，构建成原核表达质粒pET—28a-gG_1，结果并未获得表达。再用NotⅠ切除gG基因后小半部分片段，构建成原核表达质粒pET—28a-gG_2，使其在E.coli BL21(DE3)中以IPTG诱导表达，经SDS—PAGE分析，表达特异带为47kD，斑点杂交证实表达产物具有抗原性。表达产物主要以可溶性蛋白的形式存在于细菌裂解液的上清之中，上清经饱和硫酸铵溶液沉淀，透析，PEG20000浓缩，ELISA分析表明，经初步纯化的表达产物可与抗PRV猪血清发生特异性免疫反应。 2．gG-LAT和gG-ELISA的建立 以PRV gG基因表达提纯产物为抗原分别致敏乳胶和包被酶标板，摸索最佳的致敏和包被条件，建立了gG-LAT和gG-ELISA。方阵滴定确定gG-LAT最佳致敏温度为37℃，最佳致敏时间为30分钟，抗原最佳致敏浓度为1.3mg／ml。以gG-LAT检测各类血清340份，结果表明gG-LAT的特异性及敏感性分别为100％(43／43)和91.4％(96／105)，检测192份部分接种TK-／gG-／Laz+弱毒苗的猪血清，gG-LAT检出阳性率为36.5％(70／192)。 方阵滴定确定gG-ELISA的抗原最佳包被量为1.1μg／孔，血清1：40稀释时P／N值最大，为10.5(1.16／1.1)。故确定1.1μg／孔为抗原最佳包被量，1：40为最佳血清稀释浓度。以gG-ELISA分别检测两PRV清洁猪场gG基因缺失疫苗免疫的猪血清50份与PRV全病毒灭活苗免疫的猪血清50份，结果在gG缺失疫苗免疫猪血清中检出阳性2份，其它为阴性；在PRV全病毒灭活苗免疫猪血清中检出阳性49份，阴性1份。此结果显示，gG-ELISA诊断敏感性为98％(49／50)，诊断特异性为96％(48／50)。以5块不同批次的包被抗原的酶标板检测5份血清，结果显示阳性血清猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定的变异系数均小于10%，表明该方法重复性好。以gG一EuSA检测69份样本并与PRv病理诊断及PRV-PcR诊断结果比较。结果显示gG一EuSA与PRV病理诊断符合率为84.0%(58/69)。gG一ELISA与pRv-pCR诊断符合率为94.2%(65/69)，以gG一EuSA检测842份血清，检出阳性242份，阳性率为28.74%。以上结果表明本研究建立的gG一LAT和gG一ELISA特异性强、敏感性高，可用于区分gG基因缺失疫苗活苗免疫猪与自然感染野毒的血清学阳性猪。3.PrVgE基因的主要抗原表位区在大肠杆菌中的表达 将伪狂犬病病毒(PRv)Ea株gE基因主要抗原表位区段融合到原核表达载体pET28b的”启动子下游，构建成原核表达质粒，经IpTG诱导，SDs一pAGE和westernblot印迹分析，证实gE基因主要抗原表位区在大肠杆菌中获得了表达，表达产物具有抗原性，分子量为38kD，位于包涵体中。4.gE.1‘AT和gE一EUsA的建立 乒基因主要抗原表位区表达的包涵体蛋白经变性、复性处理后，复性产物致敏乳胶，并对抗原致敏浓度、致敏时间、致敏温度进行优化，建立了gE乳胶凝集试验 (薛.LAI，)。该方法不仅能显着区分gE基因缺失疫苗免疫猪血清和野毒感染猪血清，而且具有简便、快速等优点。检测360份猪血清，阳性率为57.77%(208/360)，比国外阻断gE一ELISA的58.05%(209/360)略低，阳性符合率为94.86%(203/214)，总符合率为%.94%(349/360)，两种检测方法结果差异不显着(P>0.05)。 将经纯化、变性、复性等处理后的gE蛋白作为抗原建立伪狂犬病的gE一EL工SA鉴别诊断方法。方阵滴定确定7.5 pg/孔为抗原最佳包被量，1:40为最佳血清稀释浓度。以该方法检测115份己知背景猪血清，结果表明，该方法诊断特异性为94.5%，诊断敏感性为%.7%。以5块不同批次包被抗原的酶标板检测5份血清，结果显示阳性血清的变异系数均小于10%，表明该方法重复性好。对比国外阻断gE一ELISA同时检测356份猪血清，两者阳性符合率为87.44%(195/223)，总符合率为92.13% (328/356)。以上结果表明该gE一LAT和gE一ELISA特异、敏感且重复性好，可用于猪伪狂犬病的鉴别诊断。5.猪繁殖与呼吸综合征基因组序列的测定 猪繁殖与呼吸综合征是另一种危害我国养猪业的传染病，它主要以母猪发热、厌食、流产、早产、死胎、弱仔等繁殖障碍及各年龄猪的呼吸道症状为主要特征，
宋春莲[9]2016年在《PRV和PCV2混合感染仔猪致病特点及猪伪狂犬病防控技术研究》文中提出猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)都能使猪发病和产生免疫抑制,二者混合感染引起发病猪病情加重及猪场重大经济损失,但二者混合感染导致机体损伤及致病的机理还不清楚。深入研究猪圆环病毒2型胁迫下猪伪狂犬病防控机制,能为种猪场猪伪狂犬病净化提供理论支持。本试验通过人工单独和混合感染PRV和PCV2,通过分离病毒、荧光定量PCR以及血液生理生化指标和血清感染抗体的测定,研究PRV和PCV2混合感染的致病机制；并对云南省72家规模猪场进行了猪伪狂犬病净化综合防控技术的研究。1.PRV和PCV2混合感染仔猪的临床病理学研究PRV和PCV2都是猪的重要传染病。PRV可以引起猪的繁殖障碍及呼吸道疾病；PCV2引起猪的断奶后多系统消耗综合征、繁殖障碍、皮炎与肾病综合征及呼吸道病综合征等多种疾病。本实验通过人工单独感染PRV、单独感染PCV2、混合感染PRV和PCV2,对感染仔猪后出现的临床症状、病理变化进行观察。结果表明：混合感染PRV和PCV2的仔猪出现的病理症状比单独感染病毒产生的症状严重。PRV单独感染仔猪表现为特有的“发热-神经症状-奇痒-呕吐(腹泻)”症状；PCV2单独感染仔猪表现为“发热-呼吸困难-消瘦-贫血”等多系统功能衰竭综合症；而PRV和PCV2混合感染仔猪表现为“发热-消瘦-神经衰竭-呕吐-死亡”等特征性临床症状；单独感染PRV或PCV2组的仔猪没有出现死亡,而混合感染PRV和PCV2组的仔猪在感染后第14d全部死亡。显微观察可见,攻毒后第3d-35d,感染仔猪的心、肝、脾、肺、肾、淋巴结和小脑均出现明显的显微病理变化。混合感染仔猪的组织病理变化要比单感染PRV或PCV2的病变严重,单感染PRV比单独感染PCV2仔猪的显微病理变化严重,对照组无病理变化。2.人工感染PRV和PCV2仔猪组织器官病毒载量消长规律研究通过实时荧光定量PCR方法,对单独感染PRV或PCV2组,混合感染PRV和PCV2组,在攻毒后第3、7、14、21、35d,随机取2头仔猪宰杀,取心、肝、脾、肺、肾、腹股沟淋巴结、小脑7个组织器官；采集感染仔猪的血液、肛门拭子,鼻拭子进行病毒载量测定,分析样品中的带毒情况及排毒变化规律。结果：7个组织器官混合感染组的组织病毒载量比单独感染PRV组或PCV2组高,PRV的载量比PCV2高；病毒载量由高到低依次为肺脏、腹股沟淋巴结、肝脏、脾脏、肾脏、小脑、心脏。其中混合感染组PRV病毒载量在第14d最高,单独感染PRV组的病毒载量在第7天最高；单独感染PCV2组的病毒载量在第14天最高；结合感染猪的病理变化分析表明,病毒载量越高仔猪表现临床症状越明显,组织器官损伤越严重。混合感染组的病毒载量最高,发病最严重并出现仔猪死亡,组织器官严重损伤。对感染组仔猪的血液、肛门拭子、鼻拭子中的载毒量测定发现,混合感染组和PRV单独感染组的载毒量在感染后第7d-14d处于较高水平；而PRV单独感染组在感染中后期持续排毒；PCV2单独感染组的血液中病毒载量最高、出现病毒的时间最早,但是感染后期排毒水平较低,可见PCV2感染是在感染早中期对外排毒严重,感染后期对外排毒减少。3.PRV和PCV2混合感染对仔猪免疫抑制影响的研究采集感染病毒仔猪血液,应用ELISA方法检测血清中IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ四种细胞因子、补体C3、C4、IgG的含量和红细胞、血红蛋白、白细胞、淋巴细胞、中性细胞及血小板的数量。结果：与单独感染PRV或PCV2组比较,混合感染PRV和PCV2组的IL-4、IL-10和IFN-γ效价在感染后第3-14d呈上升趋势,并都高于2个单独感染组；IL-6在第0-3d快速下降,低于单独感染PRV组；表明在感染早期混合感染组仔猪的体液和细胞免疫都参与了抗病毒的反应。混合感染组的C3效价在第0-3d上升,第7,21d下降,并明显低于2个单独感染组； C4效价呈上升趋势,但明显低于2个单独感染组的C4效价。混合感染组的免疫球蛋白IgG含量在0-14d均低于2个单独感染组,说明混合感染组的仔猪在感染前期,其免疫系统就已受到抑制。混合感染组的红细胞、血红蛋白、中性粒细胞数量均高于单独感染PCV2组和PRV组；感染仔猪的血清抗体检测结果发现,混合感染PRV和PCV2组中,抗PRV的抗体显着低于单独感染PRV组,抗PCV2抗体与单独感染PCV2的抗PCV2抗体无差异性。以上结果表明,混合感染造成的免疫抑制比单独感染组的严重。4.PRV和PCV2混合感染猪伪狂犬病防控技术研究及示范近年来云南省猪伪狂犬病居高不下,为优化猪伪狂犬病的防控技术,本试验选择规模适中的3个PRV、PCV2感染阳性的种猪场,设计了叁种净化方案,即A场：检测净化PRV、PCV2感染抗体阳性猪,免疫猪伪狂犬基因缺失疫苗；B场：检测净化猪伪狂犬感染抗体阳性猪,免疫PRV基因缺失疫苗；C场：检测净化PRV和PCV2感染抗体阳性猪,同时免疫PRV基因缺失和PCV2疫苗,并分析这叁种防控方法的猪场净化绩效。结果表明,叁种净化方法均能控制猪场猪伪狂犬病,C场净化2种病毒,同时接种2种疫苗情况下净化效果最好。在此基础上,研究制订了猪伪狂犬病净化技术规程,2012-2015年在云南省72家规模猪场和1个示范县进行示范,并用ELISA方法检测感染抗体7516份和免疫抗体8696份。结果显示：2012年、2013年、2014年、2015年猪伪狂犬病野毒感染率分别是24.42%、5.47%、2.78%、2.69%；其中种公猪感染率分别为18.25%、12.36%、8.33%、3.15%；种母猪的感染率分别为24.73%、4.80%、2.48%、2.65%；免疫抗体阳性率分别为69.03%、81.86%、85.99%、86.40%,有14户野毒感染率0%。结果表明,经过4年净化,猪场猪伪狂犬病毒的野毒感染率呈逐年降低趋势,免疫抗体阳性率逐年升高,说明猪伪狂犬病净化技术规程在云南省大部分地区具有实用性和操作性,可以推广应用。
杨峰[10]2018年在《猪常见四种病毒和四种细菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用》文中研究说明猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型以及猪伪狂犬病病毒在临床诊断过程中因具有比较相似的临床症状而较难确诊,同时金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门菌、大肠埃希菌四种致病菌时刻危胁着动物健康和公共卫生安全,而且其在病毒感染中常常继发感染,四种病毒和四种细菌中2~3种混合感染的病例较为常见,因此建立一种特异、灵敏、快速及量化的检测方法,用于临床诊断和检测疾病,同时为疾病的防控和净化提供帮助都是有必要的。本研究通过对以上四种病毒和四种细菌的NCBI中登录的相应基因保守序列设计特异性的引物与TaqMan探针,建立一种可以检测以上四种病毒和四种细菌的TaqMan多重荧光定量PCR方法,并初步应用于临床实践。本研究为猪群常见疾病的诊断和实验室研究提供一种良好的荧光定量PCR方法,为疾病的防控与净化提供了一定的技术基础。本研究取得如下结果:1.通过对猪瘟病毒的E2基因、猪繁殖与呼吸综合征病毒的ORF7基因、猪圆环病毒2型的ORF1基因和猪伪狂犬病病毒的gE基因分别设计四对特异性引物和四条探针,建立能够同时检测四种病毒的多重TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行了试验。结果显示,所建立方法的标准曲线具有良好的线性关系;不同病毒之间无交叉反应且仅有阳性模板有扩增信号,特异性强;TaqMan多重实时荧光定量PCR方法检测的拷贝数最低分别为CSFV 3.28×10~2 copies/μL,PRRSV 3.76×10~2 copies/μL,PCV2 4.74×10~2 copies/μL,PRV 2.87×10~1 copies/μL,灵敏度最低比常规PCR高出10倍;重复试验变异系数系数在5%以下,重复性良好。使用建立方法检测了67份临床病料,结果比常规PCR多检出1份阳性和1份混合样。2.通过对金黄色葡萄球菌的nuc基因,链球菌ef-tu基因,沙门菌的ivnA基因以及大肠埃希菌的23S rRNA基因分别设计四对特异性引物和四条探针,建立能够同时检测四种细菌的多重TaqMan荧光定量PCR方法,并对其特异性、灵敏性及重复性进行试验。结果显示,所建立方法的标准曲线具有良好的线性关系;不同细菌之间无交叉反应且仅有阳性模板有扩增信号,特异性强;TaqMan多重实时荧光定量PCR方法检测的拷贝数最低分别为链球菌1.08×10~2 copies/μL,金黄色葡萄球菌9.59×10~1 copies/μL,沙门菌8.55×10~1 copies/μL,大肠埃希菌5.82×10~2 copies/μL,,灵敏度最低比常规PCR高10倍;重复试验变异系数系数在3%以下,重复性良好。使用所建立的方法检测人工感染病料,均能够特异性地检测出四种病原菌。
参考文献：
[1]. 我国中西部部分地区猪主要繁殖障碍病流行病学调查[D]. 刘琳. 河南农业大学. 2014
[2]. 规模化猪场猪瘟和猪伪狂犬病流行病学调查及净化的研究[D]. 胡玲玲. 贵州大学. 2018
[3]. 山东省母猪繁殖障碍类疾病的病因调查和综合防治措施研究[D]. 王红雷. 山东农业大学. 2008
[4]. 近年来江西部分地区猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和猪伪狂犬病流行病学调查[D]. 熊加明. 江西农业大学. 2017
[5]. 陕西省某规模化猪场4种病毒病疫苗免疫抗体检测与分析[D]. 闫红军. 西北农林科技大学. 2013
[6]. 猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪伪狂犬病病毒的分离、鉴定[D]. 蒋增海. 华中农业大学. 2004
[7]. 华东地区某养猪场主要疫病免疫水平监测分析[D]. 黄增燕. 上海交通大学. 2013
[8]. 猪伪狂犬病鉴别诊断研究与猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组序列的测定[D]. 唐勇. 华中农业大学. 2004
[9]. PRV和PCV2混合感染仔猪致病特点及猪伪狂犬病防控技术研究[D]. 宋春莲. 扬州大学. 2016
[10]. 猪常见四种病毒和四种细菌TaqMan多重荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用[D]. 杨峰. 西北农林科技大学. 2018
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