王丽丽[1]2006年在《蚕豆细胞核仁动态结构与rDNA分布关系的研究》文中进行了进一步梳理核仁是真核生物间期细胞核中最明显的结构和功能区域,是核糖体装配和rRNA合成的场所。核仁的超微结构由纤维中心(FC)、致密纤维组分(DFC)和颗粒组分(GC)叁种基本结构区域组成。真核细胞核仁中rDNA的分布和构型是长期以来未能解决的问题,本文以蚕豆细胞为实验材料,利用常规电子显微镜方法和细胞化学DNA特异染色方法—NAMA-Ur法,对核仁周期中核仁结构的变化与rDNA分布的关系进行了研究。这个问题的阐明对于进一步了解核仁的结构与功能的关系,及核仁中rRNA基因的转录位点和高效转录机制具有重要意义。研究结论如下:一、在细胞周期中,核仁从有丝分裂末期开始出现,G1期早期核仁很小,形状不规则,S期和G2期核仁体积变大,形状规则,多为圆球形,在有丝分裂前期核仁变形变小,逐渐消失。二、在整个核仁周期中,核仁的FC和DFC结构组分发生变化。G1期核仁内出现FC和DFC结构,数量很少,多为异质性FC存在;S期核仁内FC和DFC结构不明显,S期的较晚时期,FC和DFC逐渐清晰,分散地分布;G2期FC和DFC结构变得很清晰,数量增多,FC变大,多以同质性FC存在,分散地分布;前期的晚期FC和DFC变小,数目变少,呈区域性分布,随着核仁的解体,FC和DFC逐渐消失。叁、S期细胞核仁中有核仁液泡结构,核仁相随染色质与核仁联系紧密,使核仁边缘不平整呈毛绒状。四、核仁中的rDNA构型发生改变,存在集缩与解集缩之间的变化,呈连续不断运动的过程。G1期rDNA以集缩的团块状分布在FC区域;S期FC和DFC结构不明显,rDNA以解集缩的弥散状和集缩的团块状分布;G2期和前期rDNA以集缩的不规则团块状分布在FC的边缘和FC与DFC的交界处,多为环绕FC形式排布。
尚广彬[2]2009年在《大蒜细胞周期中核仁超微结构与rRNA转录及剪切位点的动态变化》文中进行了进一步梳理核仁是真核生物细胞核内重要的结构和功能区域,是细胞核内产生核糖体的机器。rRNA基因依赖RNA聚合酶I在核仁中转录合成rRNA前体,并剪切加工形成18S rRNA、5.8S rRNA和28S rRNA,进一步组装成核糖体大小亚单位。在电子显微镜观察下,核仁主要分为纤维中心(FC),致密纤维组分(DFC)和颗粒区(GC)叁个结构区域,其中圆形的FC和环绕在它周围的DFC组成相连、统一的结构单位。长期以来,研究者们对核仁中rRNA基因的精确位置及其转录位点、转录后形成rRNA前体的剪切位点等问题进行了深入的研究,但对核糖体前体形成过程中每一步骤具体发生在核仁中的准确位置仍不是很清楚,即使采用相同的方法结果也不同。不过以前对核仁结构和功能的研究大多只是对细胞间期中某个时期细胞的核仁进行静态研究,然而核仁是一个高度动态变化的结构,在细胞分裂前期解体,在细胞分裂末期又开始重建。即使在核仁相对稳定的细胞分裂间期,核仁的超微结构也是随着G1、S和G2时期的不同而变化,这可能是产生这些分歧的一个重要原因。本文采用高等植物大蒜作为实验材料,利用羟基脲同步化处理根端分生组织细胞,后用电镜技术结合NAMA-Ur特异染色技术、BrUTP短时脉冲标记技术、免疫标记和原位杂交技术对大蒜根端不同时相细胞核仁的超微结构与rRNA基因分布和转录及前体剪切位点进行了研究,主要结果如下:1.核仁超微结构在各个时期之间变化比较明显,核仁中FC和DFC的数量、大小、形状和分布随着核仁功能的需要,在细胞周期各时相之间高度动态变化。2. NAMA-Ur特异染色结果显示核仁中的rDNA以两种不同集缩程度存在:致密的染色质块和结构松散的云状DNA。而且rDNA在核仁中的结构形态和分布随时期的不同而变化:在分裂末期以染色质丝伸入早期核仁内部,早G1期只以染色质块的形态分布在FC内部或边缘;晚G1、S和G2期以致密的染色质块和松散的云状DNA分别分布在FC内和DFC,在细胞分裂的前期核仁中rDNA随着FC和DFC的聚缩而相互交织形成网络状;而且DFC区域的云状rDNA分布范围随着核仁所处时期的不同而急剧的变化。3.用BrUTP结合免疫胶体金技术,脉冲标记同步化后的根端细胞核仁中rRNA基因转录初始产物的合成位置,结果显示G1核仁中标记信号分布在靠近FC的DFC区域,随着细胞周期的进行,S、G2期和早前期核仁中整个DFC区域都有金颗粒的分布,但还是靠近FC的区域金颗粒密集。统计结果表明细胞周期不同时期核仁DFC中转录活动的水平不同。4.抗核仁纤维蛋白(fibrillarin)抗体免疫标记、U3 snoRNA探针原位杂交实验表明fibrillarin和U3 snoRNA均分布在大蒜细胞核仁DFC区域,GC区域也有部分金颗粒,而FC内金颗粒极少,其平均密度和对照实验核仁内的金颗粒密度相当。说明pre-rRNA前体早期剪切事件发生在核仁的DFC区域,而且不同时期核仁内pre-rRNA剪切活动的位置和强度也不相同;fibrillarin和U3 snoRNA的双标记实验也证明了rRNA前体的早期剪切事件主要发生在靠近FC的DFC区域,而且fibrillarin和U3 snoRNA在核仁中存在着活跃态和储存态两种不同形式。
刘喜明[3]2013年在《巨尾桉脱落树皮形成过程及机理的研究》文中研究说明传统脱落树皮发生理论认为：“由于树皮内新周皮的形成，新周皮外侧的落皮层被切断水分和养料供应而死亡，在风吹雨淋等外力作用下发生脱落”。但该理论尚存多处疑问。从传统脱落树皮发生理论可见，周皮的形成对落皮层脱落具有重要作用。离区和离层的形成及分离是研究植物器官脱落的核心内容，如果套用于脱落树皮的发生，则新周皮就相当于离区，新周皮最外层的几层木栓层就是离层。因此对脱落树皮形成过程的研究就是对树皮中离区形成过程的研究，也是对周皮形成过程的研究。为丰富和完善脱落树皮形成理论，揭示周皮内木栓层和木栓形成层的形成过程和机理，改善脱落树皮性状，促进其开发利用，有必要对脱落树皮形成过程及机理进行深入研究。本研究基于木材学中树皮脱落和周皮形成的基础理论，以脱落树皮形成过程中离区细胞微观和超微结构变化为主轴，分别针对脱落树皮形成过程的各个阶段：利用光学和电子显微镜，研究离区细胞微观和超微观结构特征，以掌握其发展变化细节；采用TUNEL法和DNA Ladder法研究离区细胞PCD发生，以确定其死亡本质；通过对离区细胞壁水解酶分布及活性变化动态的分析，明确其松弛和脱落机理；通过对离区活性氧水平和抗氧化酶活性变化动态的分析，探究其细胞变化机理。结果表明：（1）新鲜树皮由内向外依次由维管形成层、次生韧皮部和周皮组成，其中次生韧皮部由筛管、伴胞、含晶细胞、韧皮纤维、韧皮射线和韧皮薄壁细胞按一定规律排列组成；新鲜树皮的热水抽提物、1%NaOH抽提物、苯醇抽提物含量分别为11.89%、18.89%、1.85%，新鲜树皮的纤维素、半纤维素、木质素含量分别为45.90%、27.00%、11.49%；从FTIR光谱图判断，新鲜树皮含晶细胞中的大量晶体是一水草酸钙。（2）脱落树皮形成过程是动态的变化过程，根据离区细胞结构特征和发生顺序，将脱落树皮形成过程划分为细胞脱分化前、细胞脱分化期、木栓形成层形成期、木栓层形成期、径向伸展层形成期、离层细胞分离期六个阶段。各阶段离区细胞的主要特征是：○1细胞脱分化前，薄壁细胞具中央大液泡，细胞质少且边缘化，细胞核小，离区细胞处于不活跃的相对静止状态；○2细胞脱分化期，细胞质迅速增加，液泡化程度降低，细胞核变大并移向细胞中央，核仁清晰，核孔密集，离区细胞发生脱分化，逐渐恢复分裂能力；○3木栓形成层形成期，离区细胞的细胞质丰富，细胞核大而明显，核仁清晰，薄壁细胞进行无丝分裂，形成木栓形成层，同时可观察到细胞壁的形成过程；○4木栓层形成期，木栓形成层进行有丝分裂，向外分生木栓层，向内分生栓内层，木栓层细胞逐渐成熟并出现PCD特征；角隅细胞逐渐消融，并具有明显的PCD特征；○5径向伸展层形成期，木栓形成层细胞发生径向伸展，成为径向伸展层，其径向壁呈现先破裂解体再重构的现象，木栓层细胞普遍具有明显PCD特征，并形成开口朝向落皮层的U形加厚；○6离层细胞分离期，离层细胞开始分离脱落；径向伸展层内壁的层状加厚和不定形沉积物不断累积；第二径向伸展层形成，其细胞壁具有均匀的层状栓质化加厚；木栓层细胞的U形加厚明显增强，并具有明显的层状结构。（3）通过对离区细胞结构特征的研究发现：○1离区内的木栓形成层细胞是由脱分化后的薄壁组织细胞分裂而来；○2细胞脱分化期，发生脱分化的离区细胞内未见淀粉粒增多，与离体培养和愈伤组织形成的研究结果不同；○3在木栓形成层形成期，观察到无丝分裂时的初生壁形成方式；○4径向伸展层形成期，木栓形成层细胞径向壁发生先破裂解体再重构的现象，为细胞壁松弛理论的化学键断裂说提供了直观证据；○5未见细胞壁栓质化、离区细胞死亡、脱落树皮发生之间直接联系；○6树皮脱落与花、叶、果实脱落在离区平面、细胞结构和离层位置存在区别。（4）透射电镜下细胞超微结构特征表明，离区细胞形成和离层细胞分离中细胞死亡属于主动的程序化死亡，而不是被动的细胞坏死。对离区形成过程中TUNEL检测和DNA梯度检测结果表明：离区细胞在木栓层形成期就已经具备了明显的程序化死亡特征，随着离区细胞的发展，程序化死亡程度不断深化。TUNEL检测和DNA梯度检测的结论均与离区细胞程序化死亡的超微结构特征相吻合，为离区细胞死亡的PCD本质提供了充足的证据。（5）纤维素酶主要定位于初生壁上，在细胞脱分化和径向伸展层形成期，为细胞壁纤维素水解发挥了重要作用，但对离层细胞分离作用不大；果胶酶主要分布于细胞壁的胞间层和细胞角隅，在细胞脱分化、径向伸展层形成和离层细胞分离期，为细胞壁胞间层物质的降解发挥了重要作用。果胶酶在离层细胞分离期对胞间层物质的降解作用是导致离层细胞分离的根本原因。（6）通过对脱落树皮形成过程中细胞微观和超微观结构特征、活性氧水平变化动态的研究，并结合现有成果理论综合分析，结果表明活性氧对脱落树皮的发生具有重要作用：○1·OH可通过松弛细胞壁，促使离区细胞体积或长度增长，并在离层细胞分离期深化木栓层细胞程序化死亡的强度和速度；○2O_2－直接参与离区细胞程序化死亡的诱导，也可转化为H_2O_2以改变活性氧比例，从而调控离区细胞的分裂和分化；○3H_2O_2在脱落树皮形成过程中促进细胞脱分化的发生，在木栓层形成期和径向伸展层形成期参与细胞壁的生成和植物细胞衰老的启动，在离层细胞分离期诱导乙烯产生以加速离层细胞的分离。（7）通过对脱落树皮形成过程中细胞微观和超微观结构特征、活性氧水平变化动态、抗氧化酶活性变化动态的研究，并结合现有成果理论综合分析，结果表明各抗氧化酶对脱落树皮的发生具有重要作用：○1POD促进离区细胞脱分化，参与木栓层形成期和径向伸展层形成期的细胞壁构建，在离层细胞分离期加速呼吸氧化进程，促进离区细胞衰老；○2PAL参与了细胞壁物质的形成以及细胞内多酚类物质的积累；○3SOD通过催化细胞内O_2－为H_2O_2调节活性氧比例，以调控离区细胞分裂和分化；○4CAT通过催化H_2O_2为分子氧和水，调节活性氧的比例，从而参与离区细胞分裂增殖或分化生长的调控。（8）根据本研究结果，提出巨尾桉脱落树皮形成理论：巨尾桉新鲜树皮内每年形成一次离区（即新周皮），新周皮成熟后，木栓层细胞程序化死亡，同时最外层及其附近木栓层细胞的胞间层在果胶酶作用下发生降解，使得木栓层细胞从周皮分离，导致落皮层与树干失去连接，在风吹雨淋日晒等外力作用下，落皮层破裂并从树干脱落，成为脱落树皮。细胞壁水解酶、活性氧和抗氧化酶是离区形成和离层分离的重要调控因素。（9）脱落树皮由周皮和部分次生韧皮组织组成，这部分次生韧皮组织含有筛管、伴胞、韧皮纤维、韧皮射线和韧皮薄壁细胞；随树龄增加，脱落树皮外表面更加平整，内表面出现旋切纹理，厚度逐年增加，幅面面积迅速扩大；随树龄增加，纤维素、半纤维素和木质素含量逐渐提高，热水抽提物、1%NaOH抽提物、苯醇抽提物和灰分含量逐渐降低；脱落树皮的FTIR光谱图中主要含有纤维素、半纤维素、木质素和一水草酸钙的特征吸收峰。
施寒清[4]2004年在《植物细胞核仁动态结构的研究》文中指出核仁是真核生物细胞的rRNA合成加工和核糖体装配的场所。核仁的超微结构主要有叁种基本结构组分：FC、DFC和GC。核仁内rDNA的分布、转录定位、rRNA前体的加工及核糖体的装配和核仁的蛋白质组学等都是细胞研究中的重要问题和方面。关于rRNA基因的转录位点是在FC还是DFC，到目前为止还存在争议。本文通过采用常规电子显微镜方法和柠檬酸铽单链RNA特异性染色法，以洋葱为材料对核仁周期中核仁的形态结构变化规律和核仁中的单链RNA的分布进行了研究。由于新合成的RNA短链可能还没有形成二级结构，一些单链RNA的分布区，代表了新合成的RNA的分布区，这有利于转录位点争议的解决。本研究得出如下结论：从洋葱分生组织可以得出如下规律：在细胞周期中，核仁在有丝分裂末期开始出现，在G1期的较早阶段核仁很小，还没有形成FC和DFC结构，随着细胞的发育，核仁逐渐变大，FC和DFC结构开始明显，后来核仁开始合并，在G1期的中后期阶段一个细胞中一般为1—2个核仁；核仁的大小在G1期的中后期、S期和G2期无明显变化，在S期和G2期，DNA的加倍，可能对核仁的体积无明显影响。在S期、S与G2的过渡时期，核仁的边缘出现了毛边现象，在形态学上可见核仁与其周边染色质的联系增多。在G1期、G2期的典型阶段和前期的早期阶段则无此现象。核仁FC、DFC的变化及分布与细胞周期变化不是同步的。在G1期、 S期和G2期都存在较大的FC和较小的FC，一般具较大的FC的细胞，FC的数量较少；FC较小的细胞，核仁内FC的数量较多；但也有一些细胞的一个核仁
陈玲玲[5]2017年在《细胞周期中小鼠前胃癌（MFC）细胞核仁结构和功能位点的动态研究》文中提出核仁是真核生物细胞间期细胞核中最显着,同时也是最重要的结构,因为核仁内存在核糖体基因和核糖体生物发生因子。根据常规电镜制片观察,真核生物核仁的基本结构为:纤维中心(FC)、致密纤维组分(DFC)、颗粒组分(GC),其中DFC与FC紧密联系,常常以包围、半包围形式围绕FC存在,因此,又常常被看做一个整体,即FC/DFCs。对人类HeLa细胞和植物大蒜分生组织细胞的核仁结构研究表明,核仁内部结构,尤其是FC/DFCs在细胞周期中发生了剧烈的变化,但在普通动物细胞中,这种变化还未被研究。而且,对于导致FC/DFCs在细胞周期中发生剧烈变化的机制,一直都不太清楚。考虑到FC/DFCs的主要成分是DNA,所以我们从周期范围内追踪了rDNA以及rDNA复制关联的蛋白质PCNA,以解释这种变化。此外,长期以来,因为实验手段和实验对象的不同,核仁内核糖体亚基系列生成的功能位点——rDNA存在、转录和pre-rRNA剪切的位点,一直存在着分歧,加上以前的研究大多只是研究某一静态时期的核仁结构,忽略了核仁结构在细胞周期进程中的剧烈变化,这更可能促进分歧的加剧,所以从细胞周期角度来研究核仁的结构和功能位点的动态变化就显得很有必要。本研究用小鼠胃癌细胞系小鼠(前)胃癌细胞MFC为研究对象,利用TdR双阻断法结合抗PCNA抗体和抗nucleolin抗体的免疫荧光双标实验对MFC细胞周期的不同时段进行了详细划分,然后利用常规电镜制片、NAMA-Ur DNA特异染色、K4M低温包埋结合抗DNA/RNA杂合体抗体、抗nucleolin抗体的免疫电镜标记,对细胞周期不同时相的核仁结构和功能位点进行动态研究,主要结果如下:1.MFC细胞经过TdR双阻断后,于T0时刻被阻断在G1/S交界处,T0-T2为S期,T3-T6为G2期,T7为M期,T8-T14为G1期。2.对PCNA的免疫荧光标记表明,不溶性PCNA在S期前期出现,S期中期进入核仁,S期后期逐步离开核仁,G2期前期彻底消失,所以又将S期分为前、中、后叁个阶段,G2期分为前、后两个阶段。3.对MFC细胞的常规电镜制片表明核仁结构随着细胞周期时段的不同而明显不同:核仁在有丝分裂前期解体,分裂末期重新出现,又在间期进行了以FC/DFCs的不断融合和新生为主的多次改构重建,且在S期经历了短暂的本不该存在于除了龟类以外的羊膜脊椎动物的二元结构。4.通过NAMA-Ur DNA特异染色、常规电镜制片和PCNA免疫荧光标记技术对核仁研究结果的比较表明,DNA代谢以及参与代谢的蛋白一定程度上引导了核仁结构在细胞周期进程中的动态变化。5.对抗nucleolin抗体的免疫电镜标记结果首次表明nucleolin随着细胞周期时段的不同,在核仁内的分布位点不同。间期的G1期、S期早期和G2期晚期,nucleolin少量分布在FC的边缘,大量分布在DFC和GC,但是在S期中、晚期和G2期早期,nucleolin在FC内部也有少量分布。6.对抗DNA/RNA杂合体抗体和抗nucleolin抗体的免疫电镜标记共同表明,沉默的rDNA分布在FC内部,活跃转录的rDNA少量分布在FC的边缘,主要分布在DFC;rDNA转录位点存在于FC的边缘和DFC,其中DFC处的转录强度大于FC的边缘处;pre-rRNA剪切加工的位点则遍布GC,还可能存在于FC的边缘和DFC。
王爽[6]2006年在《洋葱细胞核仁结构与rDNA复制的动态关系》文中指出核仁是真核生物细胞中合成加工rRNA和生产核糖体的场所,它的超微结构主要是由叁种基本结构组分组成:纤维中心(FC),致密纤维组分(DFC)和颗粒组分(GC)。在细胞周期中,核仁是一种高度动态的结构,呈现规律性的消失与重建,其结构与功能都发生很大的变化。本文以洋葱为材料,通过常规电子显微镜和电子显微镜放射自显影的方法,对核仁结构在细胞周期中的变化规律和rDNA的复制问题进行了研究。实验结果如下:1.早G1期核仁出现,核仁数目相对较多且体积较小;S期和G2期细胞中核仁数目减少,体积相对变大;前期核仁变形变小,数目变多,最后核仁消失。2.S期核仁边缘呈毛绒状,核仁与其周边染色质联系紧密。3.核仁FC中的染色质在不同时期存在着集缩和解集缩状态的动态变化过程。G1期FC中有电子密度较高的大染色质块,染色质集缩程度高;S期FC中染色质块变小,染色质比G1期相对松散,集缩程度降低;G2期FC中染色质块很小且电子密度较低,染色质趋于解集缩状态;在前期核仁FC中染色质呈解集缩状态。4.核仁中FC和DFC结构在细胞周期的进程中存在着动态的变构过程。G1期DFC小且不明显,只有少数较大的FC分布;S期DFC范围增大,电子密度较高,DFC分布呈区域性,有的DFC区域内有FC分布,也有一些较大范围的DFC区域内没有FC分布,此时出现少数较小的FC;在G2期DFC范围进一步增大,电子密度高,呈区域性分布更加明显,在每个DFC区域内都有很多FC均匀分布在其中,并且小FC数量增多;前期核仁中DFC变小且模糊,已不呈区域分布,FC数量明显减少,最后FC和DFC结构消失。5.核仁中rDNA的复制位置主要分布在核仁边缘的颗粒区和核仁相随染色质部位。rDNA的复制时期最早起始于G1期的较晚时期,此时只有少数细胞核仁中的rDNA进行复制;S期是rDNA复制的主要时期,此时复制比较活跃;在G2期复制并没有立即停止,rDNA的复制一直延续到G2期结束。
王凤才[7]2006年在《HeLa细胞核仁rRNA基因转录和pre-rRNA剪切与超微结构动态关系研究》文中指出核仁是真核生物很显着的亚细胞结构之一。在细胞合成蛋白质中具有非常重要的作用-核仁制造了核糖体大小亚单位。核仁主要由FC (fibrillar center)和DFC (dense fibrillar component)以及GC (granular component)等超微结构组成,普遍存在于动物细胞,植物细胞和酵母细胞核中。每个细胞核中核仁的数量从一个到数个不等。核仁在有丝分裂前期解体并停止转录核糖rRNA,在有丝分裂末期恢复转录核糖体rRNA并重新形成核仁。虽然人们对于核仁的认识已经有很长的历史了,但是人们对于核仁结构和功能方面的认识仍然有很多不同的意见。其中意见分歧较为明显的是,关于G1(G0)和G2期核仁超微结构FC和DFC大小有分歧,关于核仁rDNA分布以及rRNA基因转录位点有不同的意见,关于核仁剪切位点的研究方面也存在分歧。在相关的研究中有时甚至所取用的材料相同方法也相同,但是结果却不同。对于核仁结构和功能在细胞间期中各个时期动态变化过程缺乏系统全面的了解可能是产生上述分歧的原因之一。本实验用HeLa细胞为实验材料,利用常规电镜、细胞化学方法、免疫电镜技术以及原位杂交技术对在G1期、S期和G2期①HeLa细胞核仁超微结构及其变化,②核仁rDNA在不同时期分布规律及其变化,③各个时期核仁rRNA基因转录位点及其变化,④pre-rRNA早期剪切位点及其变化进行了研究。结果显示,HeLa细胞间期核仁的结构和功能都经历了高度动态的复杂变化:1、通过对经过同步化培养的HeLa细胞做常规电镜观察显示,HeLa细胞核仁结构在细胞间期的各个时期是不同的。G1期细胞核中有数个小核仁,每个小核仁含有一个FC和DFC。随后有些小核仁互相融合形成大型核仁。在融合中的核仁内不同FC之间也发生了融合过程,形成了比较大型的FC和DFC。S期在大型FC周围的DFC发生改构现象,在FC和DFC之间形成一些腔隙,这些腔隙发展成为小型FC和DFC。我们把在G1期早期形成和出现的FC和DFC称为初级FC和初级DFC,把在S期从初级FC和初级DFC上形成的FC和DFC称为次级FC和次级DFC。G2期为数众多的小的次级FC和DFC与初级大型FC和DFC共同存在于核仁中。2、NAMA-Ur染色使核仁中rDNA的分布走向及其在不同细胞时期的变化得以显示。在初级FC中rDNA纤维密集分布,质地均一,互相之间搅扭缠绕在一起形成一个比较规范的球形体结构。DFC中rDNA纤维分布不均匀,成束的rDNA纤维放射状分布于球形体FC周围,核仁次级FC和次级DFC的衍生过程发生在靠近FC和DFC中的DNA组分中,DFC中的rDNA组分随细胞周期的进行不断增多。在核仁外叁分之一处围绕着一层很厚的常规电镜下看不到的由凝聚状态不同的核仁周缘染色质纤维结构。这种核仁周缘染色质结构参与了核仁形态和位置的维持过程。因为当HeLa细胞进入到G2期末期核仁周缘染色质开始凝聚时,位于核仁周缘的染色质组分逐渐消失,核仁形态也
王晓丹[8]2015年在《马铃薯晚疫病菌RxLR效应蛋白与寄主蛋白互作促进侵染的机制研究》文中指出马铃薯晚疫病(Potato Late Blight)由致病疫霉菌P.infestans引起,该病害在适宜的环境条件下能快速发展造成病害流行,是一种毁灭性的卵菌病害。生产上,防控马铃薯晚疫病最有效的手段是种植抗病品种,但是由于该病病原菌P.infestans不断发生毒性变异,经常导致作物品种抗性的丧失,病害呈周期性流行和爆发。在晚疫病菌侵染寄主的过程中,该病原菌与寄主发生互作,植物体产生免疫反应,这包括复杂的交叉-结合的信号传输网和信号调节过程。植物诱导防御的第一个阶段包括对保守微生物分子的认知(病原菌相关分子模式;PAMPs),或者由于细胞的损伤而产生的分子(DAMPs)的识别,导致防御通道的激活,这一过程被称为跨膜识别受体触发的防卫反应(PTI)。寄主的特异性病原物则逐步地操纵和抑制PTI,来提高植物感病性。效应蛋白(Effector),是植物病原微生物在与寄主植物互作过程中分泌的、可被植物NBS-LRR抗性蛋白特异识别、兼具毒性与无毒性功能的蛋白,是病原物用于抑制PTI的策略之一。因此,鉴定效应蛋白及与它们互作的寄主靶蛋白,以及研究效应蛋白操纵寄主使植物感病机制是当前研究的一个重点。本论文以致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的定位在细胞核上的重要效应蛋白PexRD41为研究对象,该效应蛋白的基因地址是04089,因此本研究通称PITG_04089(Pi04089),获得的研究结果如下:(1)通过在Pi04089基因序列的N端融合绿色荧光蛋白GFP,介导农杆菌后转染模式植物本氏烟,接种马铃薯晚疫病菌,与对照GFP空载体相比,显着促进了马铃薯晚疫病的侵染。借助共聚焦荧光显微镜Confocal进行活体观察,确定了PITG_04089蛋白显着地定位于细胞核,在细胞核核仁周围形成一个环。被测RxLR效应蛋白PITG_04089(Pi04089)基因表达量在晚疫病菌侵染的早期阶段(24h和48h)出现显着的基因上调,这种上调作用甚至可以持续到72h。(2)为了验证核仁在Pi04089行使功能中的作用,本研究在GFP-040894 N端加入出核信号NES,形成NESGFP-Pi04089融合蛋白,经confocal观察,GFP绿色荧光蛋白在细胞核仁中显着减少,同时细胞质中的绿色荧光显着增强,说明该信号将GFP-Pi04089极大地运出细胞核。在本氏烟上进行ATTA实验,瞬时表达GFP-Pi04089和NESGFP-Pi04089后接种晚疫病菌,病斑测量值进行方差实验,结果显示与GFP-Pi04089相比,修饰后的NESGFP-Pi04089显着地降低了晚疫病菌的侵染水平,大大削弱了效应蛋白Pi04089对晚疫病的侵染,表明细胞核是Pi04089在植物体内实现功能的重要部位。(3)为了筛选Pi04089在植物体内的互作靶蛋白,实验室构建了马铃薯晚疫病菌酵母双杂交库,cDNA文库材料来自于P.infestans侵染15h和72h的马铃薯植株病组织,从酵母双杂交系统中筛选到Pi04089在寄主中的靶蛋白为含3个KH结构域的RNA结合蛋白KRBP1(命名为StKRBP1)。此外,通过免疫共沉淀(Co-IP)技术,也验证了StKRBP1与Pi04089在植物体内的互作关系。(4)通过双分子荧光互补(BiFC)技术,发现Pi04089与KRBP1互作发生在细胞核内,免疫印迹western blotting实验证实了这些蛋白组合在植物中稳定存在。当Pi04089与KRBP1在本氏烟共表达(co-expression)时,Pi04089原先在细胞核核仁的环消失,定位因KRBP1的存在而改变,该效应蛋白定位到与KRBP1相同的细胞核核斑点上。在两者共表达植株上接种晚疫病菌,发现在病原菌早期侵染阶段(24h),KRBP1蛋白表达量显着提高,因此证明了KRBP1对晚疫病菌侵染起正调节的作用。(5)利用病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术,将KHRBPs的保守基序GxxG突变为GDDG,构建了2个VIGS突变体StKRBP1mut。通过酵母双杂交和免疫共沉淀技术,证明该突变体与Pi04089在酵母和植物体内不再互作。突变体阻止了Pi04089在核斑点上的定位,StKRBP1mut蛋白表达量也没有增加。(6)突变体StKRBP1mut不再帮助晚疫病菌提高对叶片的侵染,这表明核苷酸结合位点对效应蛋白Pi04089与KRBP1互作是必要的。研究结果显示KRBP1是一个感病因子(Susceptibility Factor),效应蛋白Pi04089可能修饰或增强了KRBP1的活性,与KRBP协作提高病原菌侵染。
王璞[9]2016年在《表观修饰在热介导的植物程序性细胞死亡过程中的功能研究》文中提出细胞周期和程序性细胞死亡过程涉及发育、衰老、非生物压力适应、病原体侵染等多个方面,它一直是基础研究的热点领域。在动物中,程序性细胞死亡分为细胞凋亡、细胞自噬和细胞坏死。叁种不同类型的程序性细胞死亡过程存在明显的细胞学和生理生化差异,并且不同类型过程的分子信号通路之间是相互独立而又密切相关的。在植物中,目前对程序性细胞死亡过程的分类并不十分清晰,因为各个程序性细胞死亡案例的分子调控网络之间差异性很大。因此,不同程序性细胞死亡案例的调控网络研究可以为区分不同类型的程序性细胞死亡过程提供依据。染色质修饰是表观遗传学的一个重要分支,它可以通过对染色质结构的调控来调节基因表达。在很多重要的生物学过程中染色质调控都起着关键性的作用,比如说诱导多能干细胞(iPS)的分化、生殖细胞的形成、种子萌发、植物逆境反应等。尽管如此,在程序性细胞死亡过程中的染色质修饰研究至今还是寥寥无几。对细胞周期和热介导的程序性细胞死亡过程中染色质修饰的功能研究不仅可以揭示各种染色质修饰或者染色质修饰酶的功能多样性,而且还能加深人们对细胞周期和程序性细胞死亡过程分子调控网络的理解。本论文主要以玉米幼苗为材料研究细胞周期和热介导的程序性细胞死亡过程中的分子调控网络、表观修饰调控、rDNA调控,试图揭示不同程序性细胞死亡过程中染色质修饰的功能。本论文包括以下研究内容：1.热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中的组蛋白修饰调控我们使用DNA ladder和TUNEL实验检测到热压力诱导玉米幼苗叶片发生程序性细胞死亡。活性氧分子含量和相关酶酶活检测结果显示,热处理导致细胞内活性氧分子和活性氧相关酶酶活升高,特别是热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中超氧负离子含量和活性氧相关酶酶活明显升高。活性氧分子积累通常会导致膜系统损伤,细胞膜通透性实验显示,活性氧分子造成细胞膜通透性增加。另外,蛋白免疫印迹和荧光免疫染色结果表明,在热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中基因组水平组蛋白H3K9、H4K5、H3乙酰化升高,组蛋白H3K4二甲基化不变,组蛋白H3K9二甲基化降低,同时伴随着染色质脱浓缩。为了研究程序性细胞死亡过程中组蛋白修饰变化和活性氧分子积累之间的关系,我们使用低浓度表观修饰抑制剂处理玉米幼苗,观察玉米幼苗叶片细胞的生理生化和表观修饰变化。我们使用了两个组蛋白磷酸化抑制剂H89和AT13148,两个DNA甲基化抑制剂5-AC和RG108,两个组蛋白去乙酰化抑制剂TSA和CUDC-101。结果显示,这些低浓度表观修饰抑制剂可以导致基因组水平组蛋白H4K5乙酰化升高,并且玉米幼苗叶片细胞阻滞在有丝分裂早前期。进一步的活性氧分子含量和活性氧相关酶酶活检测结果表明,低浓度表观修饰抑制剂诱导的细胞周期阻滞过程中细胞内氧压升高,于是我们以这个细胞周期阻滞现象为模型研究细胞内活性氧水平和表观修饰变化之间的关系。抗氧化剂硫脲可以缓解低浓度表观修饰抑制剂诱导的细胞周期阻滞过程,这说明活性氧分子调控这些细胞周期阻滞过程并且表观修饰变化调节细胞内活性氧水平。由于低浓度表观修饰抑制剂只导致基因组水平组蛋白H4K5乙酰化升高,所以我们使用高浓度组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA来更好地模拟基因组水平组蛋白高乙酰化状态。高浓度TSA可以导致细胞内活性氧水平升高,这说明热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中很可能是组蛋白修饰变化调节细胞内活性氧水平。为了研究热压力诱导的玉米叶片程序性细胞死亡过程中凋亡相关基因的表观修饰调控,我们使用定量实时PCR和染色质免疫共沉淀实验检测基因表达和启动子区域组蛋白修饰情况。定量实时PCR实验表明,热压力诱导的程序性细胞死亡过程中抑凋亡基因hexokinase表达量降低,促凋亡基因metacaspase type Ⅱ和putative metacaspase表达量升高；同时组蛋白乙酰转移酶基因GCN5和HAT-B表达量升高,组蛋白去乙酰化酶基因HDAC101表达量降低。进一步的染色质免疫共沉淀实验证实,组蛋白修饰在hexokinase和putative metacaspase基因表达中起调控作用。2.热压力下的45S rDNA表观修饰调控我们使用荧光免疫染色检测到热压力下玉米幼苗叶片细胞核仁裂解的现象,核仁裂解的细胞比例随着热处理时间的延长而增加。为了研究热压力下核仁裂解的功能,我们使用荧光原位杂交实验检测45S rDNA在热压力下的变化。荧光原位杂交的结果显示,在热处理1天时45S rDNA脱浓缩细胞比例高于未处理组,在热处理2天和3天时45S rDNA脱浓缩细胞比例与未处理组没有差异,在热处理6天时45S rDNA脱浓缩细胞比例又明显高于未处理组。热压力下核仁和45S rDNA的变化不一样,这说明它们在热压力下的功能存在差异。为了进一步研究45S rDNA在热压力下的功能,我们使用定量实时PCR实验检测45S rDNA的转录情况。定量实时PCR结果表明,在热处理1天时45S rDNA的ETS和18S区域转录量都明显高于未处理组,这说明热压力激活45S rDNA转录；在热处理2天和3天时45S rDNA的ETS和18S区域转录量都略高于未处理组,这说明热压力没有明显激活45S rDNA转录；在热处理4天后45S rDNA的ETS区域转录量远远高于未处理组,而45S rDNA的18S区域转录量只是略高于未处理组,这说明热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中45SrDNA转录起始激活并且转录延伸受到抑制。45S rDNA转录情况在热压力过程中快速变化,这说明45S rDNA在热压力下受到不同形式的调控。为了研究表观修饰在45S rDNA转录调控中的功能,我们使用质谱和染色质免疫共沉淀实验检测45S rDNA转录变化过程中启动子区域DNA甲基化和组蛋白修饰的变化情况。45S rDNA启动子区域DNA甲基化结果显示,热压力下该区域各个位点的DNA甲基化情况没有明显变化。染色质免疫共沉淀实验显示,组蛋白修饰在45S rDNA转录起始过程中起调控作用,而与热压力诱导的玉米幼苗叶片程序性细胞死亡过程中45S rDNA转录延伸抑制没有直接关系。
关欣[10]2016年在《HeLa细胞周期中核仁超微结构改组重构行为与rDNA分布和转录的动态变化研究》文中研究说明核仁是间期细胞核中最显着的结构,是核糖体RNA基因转录和转录产物进一步加工成熟的场所。核仁叁个主要特征区域由纤维中心(fibrillar center,FC)结构区域和致密纤维组分结构区域(dense fibrillar component,DFC)以及颗粒区结构区域(granular component,GC)组成。在细胞周期进程中核仁发生规律的解体、消失和重建的过程,这种高度动态变化的特点使核仁超微结构及其功能的研究进展缓慢,也是存在诸多争论分歧的重要原因之一。争论的主要焦点是核仁中核糖体基因(r DNA)分布以及转录位点、转录后形成r RNA前体的剪切位点等在哪个具体的区域?过去的大多数研究者只是针对细胞周期中某个时期的细胞核仁进行相关的研究,却忽视了核仁细胞分裂间期也是一个相对的动态结果,核仁内部结构组分及其物质是跟随着G1期、S期、G2期进程而发生变化,因此r DNA分布、转录和剪切位点也应是动态变化的。本文采用胸腺嘧啶核苷双阻断法对HeLa细胞进行同步化培养,PCNA免疫抗体标记、吖啶橙特异性染色法以及常规电子显微镜超薄切片技术结合NAMA-Ur特异性方法、Bernhard染色法等对HeLa细胞核仁在细胞周期不同时段的超微结构变化以及核仁中r DNA分布和转录位点进行研究,主要结果如下:1.HeLa细胞核仁FC和DFC在细胞周期进程中不同时段的动态变化:在早G1期的小核仁中FC和DFC的体积都较小,界限模糊,到晚G1期时段核仁体积变大,形成较大FC和DFC。早S期FC和DFC经典构型发生改变,中S期FC和DFC结构消失,核仁内呈现匀质结构,晚S期时,较小的FC结构重新出现,数量较多。G2期,大型FC和DFC与数量众多的小FC和DFC并存于核仁中。2.通过NAMA-Ur方法对r DNA进行特异性染色,结果显示r DNA组分在细胞周期进程中分布位置和形态随着不同时期而改变:早G1期以染色质纤维的形式分布在FC内部或边缘;晚G1期、早S期、晚S期和G2期的FC区域分布致密的染色质块和DFC区域周围松散的DNA纤维组分;中S期DNA组分两种形态分布:一种是FC区域染色较浅的团块状DNA组分,一种是在匀质结构中的致密的颗粒状DNA组分。可见DNA组分分布范围随着细胞周期进程的不同时段而改变。3.通过Bernhard染色对核仁RNA进行优先染色,结果显示HeLa细胞核仁r RNA转录位点标记出现在FC和DFC交界处以及DFC区域,在细胞间期不同时段的核仁中,结果也不尽相同:在G1期,核仁FC边缘少量染色较浅的RNA组分。在早S期,FC区域边缘有较少的RNA组分。在中S期,匀质结构内的RNA组分呈致密的纤维条索状相互连接。晚S期,FC边缘含有致密的RNA颗粒组分。在G2期,主要在DFC区域及其与FC交界有致密的“半月形”RNA组分结构,说明此时转录生成r RNA初始产物的速度最高,活跃度最强。4.采用吖啶橙特异性染色HeLa细胞核仁DNA和RNA,结果显示早G1期,较强的DNA绿色荧光分布核膜处,RNA橙色荧光主要分布在细胞质。晚G1期和S期,DNA绿色荧光主要分布核仁及其核仁周边,RNA橙色荧光主要分布在核仁。在G2期,RNA橙色荧光信号最强,说明在G2期RNA转录活跃程度最强。5.采用B23蛋白免疫抗体标记在光镜下观察细胞周期不同时段的荧光信号强度变化,观察结果提示,在G1期、S期和G2期时段B23蛋白一直存在,特别是在G2期B23蛋白标记荧光信号最强,在分裂期细胞核仁内几乎观察不到明显的B23蛋白荧光信号,说明在核仁中存在着活跃状态和储存状态两种不同形式。综上所述,在HeLa细胞核仁结构中FC和DFC数目和形态在细胞分裂间期过程中同样是高度动态变化的,特别是在中S期时段核仁FC和DFC发生了改组与重构的形态学变化,这是我们的新发现。在细胞间期中核仁FC和DFC区域的r DNA组分也是动态变化的。提示核仁r RNA转录、前体剪切的活动状态和位点随着细胞间期的G1、S、G2期进程而不断变化。本实验观察结果为进一步阐明真核生物细胞核仁在细胞周期进程中超微结构与r RNA转录、剪切之间的关系提供和完善了更多的实验依据和数据基础。
参考文献：
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[7]. HeLa细胞核仁rRNA基因转录和pre-rRNA剪切与超微结构动态关系研究[D]. 王凤才. 东北师范大学. 2006
[8]. 马铃薯晚疫病菌RxLR效应蛋白与寄主蛋白互作促进侵染的机制研究[D]. 王晓丹. 东北农业大学. 2015
[9]. 表观修饰在热介导的植物程序性细胞死亡过程中的功能研究[D]. 王璞. 武汉大学. 2016
[10]. HeLa细胞周期中核仁超微结构改组重构行为与rDNA分布和转录的动态变化研究[D]. 关欣. 东北师范大学. 2016