基于毛状根培养体系的甘草CHS及CHI基因功能研究

论文摘要

甘草是我国最常用的大宗药材之一,素有“十方九草”之誉。近些年来,栽培甘草普遍存在品质退化和有效成分含量低等问题,已成为制约甘草资源可持续发展的关键问题。大量文献报道显示:毛状根可稳定高效的生产药用植物的次生代谢产物,因此利用毛状根培养体系对甘草的次生代谢途径开展研究具有重要价值。甘草苷是甘草中最重要的活性成分之一,查尔酮合酶（chalcone synthase,CHS）及查尔酮异构酶（chalcone isomerase,CHI）是甘草苷生物合成途径中起关键调控作用的限速酶。因此,本论文拟在前期克隆获得甘草CHS及CHI基因的基础上,构建植物双元表达载体及发根农杆菌工程菌,利用毛状根培养体系对甘草CHS及CHI基因进行功能研究,揭示其影响黄酮类化合物生物合成的分子机制。本课题的研究结果还将进一步筛选甘草苷高水平积累的毛状根体系,为甘草苷的离体合成奠定理论基础和提供技术支持。本文根据课题组前期对于甘草黄酮类化合物含量与CHS、CHI基因多态性相关关系的分析结果筛选出黄酮高含量对应的特异CHS、CHI基因单倍型;采用基因融合的方法构建甘草转CHS、CHI基因植物双元表达载体;通过电转法将甘草转CHS、CHI基因植物双元表达载体导入发根农杆菌;用转基因发根农杆菌工程菌侵染甘草外植体诱导转基因毛状根,并进行PCR和测序验证;建立同时测定甘草毛状根中四种黄酮成分含量的UPLC方法,并对培养得到的转CHS、CHI基因甘草毛状根进行含量测定;通过qRT-PCR对转CHS、CHI基因毛状根中目标基因的拷贝数进行测定,分析目标基因拷贝数与毛状根中黄酮类化合物含量的相关性。本论文共取得了如下研究结果:（1）根据黄酮类化合物含量与CHS、CHI基因多态性相关关系的分析结果,筛选出黄酮类化合物高含量甘草样品对应的特异CHI-1（GenBank注册号:KY115232）,CHS-60（GenBank注册号:KY810356）单倍型。（2）选择Bgl Ⅱ和Spe Ⅰ作为酶切位点,pCAMBIA1305.1为植物双元表达载体,采用基因融合的方法,成功构建甘草转CHI、CHS基因植物双元表达载体pCA-CHI、pCA-CHS。（3）采用电转法（电转条件:C:25μF;PC:200Ω;U:2400V）分别将携带有甘草CHI和CHS基因的双元表达载体pCA-CHI和pCA-CHS导入到发根农杆菌ACCC10060中,构建得到转甘草CHI、CHS的发根农杆菌工程菌。（4）利用转CHI、CHS基因发根农杆菌工程菌侵染甘草外植体胚轴及子叶,通过PCR验证及测序验证,成功获得了转CHI、CHS基因甘草毛状根。（5）建立了同时测定甘草毛状根中4种主要黄酮类化合物含量的UPLC方法,并采用此方法对54份甘草毛状根样品中的黄酮类化合物进行含量测定。统计学分析表明,黄酮总含量在转CHI基因甘草毛状根和空白甘草毛状根样品、转CHS基因甘草毛状根和空白甘草毛状根样品中均存在显著性差异,通过比较秩均数,黄酮含量满足:转CHI基因甘草毛状根>转CHS基因甘草毛状根>空白甘草毛状根,从而证实过表达CHS、CHI基因能够增加甘草毛状根中黄酮类成分的含量。（6）利用qRT-PCR对15份转CHI基因和转CHS基因毛状根中目标基因拷贝数进行了测定,结果显示8份过表达CHI基因甘草毛状根中CHI基因拷贝数分别为1、2或5个,7份过表达CHS基因毛状根中CHS基因拷贝数分别为7、9、10、11、13或18个。（7）根据目标基因拷贝数及黄酮类化合物含量测定结果,最终优选出拷贝数为9的转CHS基因甘草毛状根以及拷贝数为5的转CHI基因甘草毛状根作为进一步离体积累黄酮类化合物的甘草毛状根材料,为将来扩大培养奠定基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

符号说明

前言

1 立题依据

1.1 甘草药材用途广泛、需求巨大

1.2 毛状根在药用植物次生代谢研究方面具有重要价值

1.3 甘草苷是甘草的指标成分之一,具有重要的研究价值

1.4 功能基因是药用植物指标成分生物合成的重要分子基础

1.5 CHS及CHI基因是黄酮类化合物生物合成途径的重要功能基因

2 研究思路与方法

2.1 研究目标

2.2 研究内容

2.3 技术路线

文献综述

1 毛状根的研究现状

1.1 药用植物毛状根的研究现状

1.2 甘草毛状根的研究现状

2 甘草中黄酮类化合物的研究概况

2.1 黄酮类化合物研究概况

2.2 甘草中黄酮类化合物研究概况

3 黄酮类化合物生物合成途径功能基因的研究概况

3.1 CHS基因的研究进展

3.2 CHI基因的研究进展

3.3 甘草中有效成分含量变化分子机制研究现状

第一章黄酮高含量甘草特异CHS、CHI基因单倍型筛选

1 实验材料

1.1 植物材料

2 实验方法

2.1 甘草特异CHS基因单倍型分析及筛选

2.2 甘草特异CHI基因单倍型分析及筛选

3 实验结果

3.1 黄酮高含量组特异CHS基因单倍型筛选结果

3.2 黄酮高含量组特异CHI基因单倍型筛选结果

4 小结与讨论

第二章过表达甘草CHI、CHS基因植物双元表达载体的构建

1 实验材料

1.1 菌体及质粒

1.2 试剂

1.3 仪器及耗材

2 实验方法

2.1 含甘草CHI、CHS大肠杆菌工程菌的活化及重组质粒提取

2.2 植物双元表达载体pCAMBIA1305.1酶切位点的分析

2.3 连接引物设计

2.4 带酶切位点的基因片段PCR反应

2.5 PCR产物回收纯化

2.6 表达载体的构建

2.7 目的基因片段与表达载体双酶切产物的连接

2.8 重组质粒的转化

2.9 阳性克隆的筛选及测序

3 实验结果

3.1 含甘草CHI和CHS基因的重组T质粒提取结果

3.2 CHI和CHS基因扩增结果

3.3 pCAMBIA1305.1载体质粒提取结果

3.4 pCAMBIA1305.1载体双酶切结果

3.5 菌液PCR验证结果

3.6 菌液测序结果

4 小结与讨论

第三章转甘草CHI、CHS基因发根农杆菌工程菌的构建

1 实验材料

1.1 菌体及质粒

1.2 试剂

1.3 仪器及耗材

2 实验方法

2.1 含重组pCA-CHI、pCA-CHS质粒大肠杆菌的活化

2.2 pCA-CHI、pCA-CHS质粒的提取

2.3 发根农杆菌ACCC10060的活化

2.4 发根农杆菌ACCC10060感受态细胞的制备

2.5 重组质粒pCA-CHI、pCA-CHS转化发根农杆菌

2.6 阳性克隆的筛选及PCR验证

2.7 测序结果分析

3 实验结果

3.1 pCA-CHI、pCA-CHS质粒提取结果

3.2 pCA-CHI、pCA-CHS质粒验证结果

3.3 rolC基因验证结果

3.4 测序结果

4 小结与讨论

第四章过表达CHI、CHS基因甘草毛状根的诱导及培养

1 实验材料

1.1 菌体

1.2 试剂

1.3 仪器及耗材

2 实验方法

2.1 发根农杆菌工程菌的活化

2.2 转CHI、CHS基因发根农杆菌工程菌质粒提取

2.3 甘草外植体材料制备

2.4 侵染、共培养及除菌

2.5 甘草毛状根的PCR验证及测序验证

3 实验结果

3.1 甘草外植体培养情况

3.2 侵染及共培养情况

3.3 毛状根诱导情况

3.4 转CHI、CHS基因甘草毛状根验证

4 小结与讨论

第五章 UPLC法同时测定甘草毛状根中4种黄酮类成分含量

1 实验材料

1.1 植物材料

1.2 实验仪器

1.3 试剂

2 实验方法

2.1 甘草毛状根样品的培养

2.2 混合对照品溶液的制备

2.3 供试品制备

2.4 色谱条件

2.5 线性

2.6 检测限和定量限

2.7 重复性实验

2.8 精密度实验

2.9 稳定性实验

2.10 回收率实验

2.11 耐用性实验

2.12 毛状根样品的含量测定

3 实验结果

3.1 毛状根液体培养情况

3.2 UPLC方法学考察

3.3 甘草毛状根样品中4种黄酮类化合物的含量分析

3.4 相关性分析

3.5 差异性分析

4 小结与讨论

第六章转基因甘草毛状根中CHS及CHI拷贝数的测定

1 实验材料

1.1 植物材料

1.2 实验仪器

1.3 试剂

2 实验方法

2.1 毛状根总DNA的提取

2.2 甘草CHI、CHS、Actin基因的获得

2.3 qRT-PCR标准曲线的建立

2.4 样品qRT-PCR扩增

3 实验结果

3.1 毛状根样品DNA提取

3.2 质粒标准品PCR及测序验证结果

3.3 qRT-PCR标准曲线的建立

3.4 熔解曲线分析

3.5 转CHI、CHS基因甘草毛状根中各目标基因拷贝数测定结果

4 小结与讨论

第七章结语

1 总结

2 展望

参考文献

致谢

在学期间主要研究成果

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 尹彦超

导师: 刘颖

关键词: 查尔酮合酶,查尔酮异构酶,甘草,黄酮,毛状根

来源: 北京中医药大学

年度: 2019

分类: 基础科学,医药卫生科技

专业: 生物学,中药学

单位: 北京中医药大学

分类号: R282.71

总页数: 104

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