导读:本文包含了载体构建阳性论文开题报告文献综述、选题提纲参考文献及外文文献翻译，主要关键词:载体,基因,阳性,质粒,抗原,乳腺,荧光。
载体构建阳性论文文献综述
温志红,代艳,何爽[1]（2015）在《人MicroRNA-335阳性对照质粒真核表达载体的构建及意义》一文中研究指出目的构建人MicroRNA-335(has-miR-335)阳性对照质粒表达载体。方法根据与has-miR-335"种子区"完全匹配的序列设计并合成一对互补的寡聚核苷酸链,经过缓慢降温退火得到目的小片段。将退火产物连接入荧光素酶报告基因载体p MIR-REPORT而得到has-miR-335阳性对照重组质粒。应用Lipofectamine 2000将has-miR-335阳性对照重组质粒、p MIR-REPORT空载体,分别与Pre-miRTMmicroRNA335 Precursor共转染至293T7/17细胞,用双荧光素酶方法检测has-miR-335在真核细胞中表达水平。结果获得has-miR-335阳性对照重组质粒,经测序结果正确。has-miR-335与其阳性对照结合在真核细胞中的表达下降。结论成功构建了has-miR-335阳性对照质粒表达载体。该载体可用于确认has-miR-335实验中RNA提取、转染和基因表达检测方法是否可靠。has-miR-335双荧光素酶报告基因检测体系的建立为进一步进行has-miR-335靶基因检测及验证奠定基础。(本文来源于《中国临床新医学》期刊2015年01期）
徐娥,任阳,朱琳娜,伍婷,袁章琴[2]（2012）在《大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选》一文中研究指出大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用。为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系。设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3。并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果。并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选。结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45%(P<0.01)、8.57%(P<0.01)和8.71%(P<0.01);干扰效率为39%(P<0.05)、64%(P<0.01)及68%(P<0.01)。稳定筛选的最佳G418浓度为800μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43%(P<0.05)、78%(P<0.01)及91%(P<0.01)。干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系。本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2012年11期）
田琦[3]（2011）在《山羊生长激素基因乳腺特异性基因打靶载体的构建及阳性细胞株的筛选》一文中研究指出研究表明生长激素(growth hormone, GH)可作用于乳腺间质细胞的GH受体,诱导细胞产生胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor1, IGF-1)刺激乳腺腺泡的发育和增加乳腺血流量,达到维持泌乳和提高奶产量的作用。本研究首先利用基因打靶技术将山羊GH基因定点导入山羊β-酪蛋白基因座中,构建乳腺特异性基因打靶载体pLG,然后在细胞和乳腺组织中进行功能验证。最后将pLG转染山羊耳皮成纤维细胞进行筛选,为今后培育转GH山羊奠定试验基础。本研究中主要试验内容分为以下叁部分：1.山羊β-酪蛋白基因5’和3’调控元件克隆及功能验证本试验的目的是扩增山羊β-酪蛋白的3’和5’调控元件,构建乳腺特异性打靶载体pGFP,通过绿色荧光蛋白(GFP)的表达验证β-酪蛋白基因调控元件的功能。首先从新鲜采集的肝素抗凝山羊血中提取山羊基因组DNA, PCR扩增其3’和5’调控元件进行测序并分别双酶切插入打靶载体pLOXP II的SalⅠ/ClaⅠ与NotⅠ/XhoⅠ多克隆位点,得到的载体命名为pL5。然后将GFP序列通过Xho Ⅰ单酶切插入pL5载体的Xho Ⅰ多克隆位点,得到的载体命名为pGFP.将载体pGFP通过脂质体法转染Bcap-37细胞,6小时后换液去除脂质体并加入10%胎牛血清,转染后36小时在荧光显微镜观察。测序结果表明PCR扩增得到的山羊β-酪蛋白基因的3’和5’端调控元件序列,与GenBank中公布的相应序列同源性在99.5%以上,可以作为基因打靶载体的两侧同源臂使用。pGFP质粒转染组细胞荧光强度显着高于对照组,证明克隆的山羊β-酪蛋白基因3’与5’调控元件具有在细胞水平指导外源基因表达的生物学活性。2.山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG的构建及其生物学功能验证将GH cDNA酶切插入pLG载体Xho Ⅰ多克隆位点,得到GH基因乳腺特异性打靶载体并将其命名为pLG。构建的乳腺特异性基因打靶载体pLG质粒采用脂质体法,分别导入人乳腺癌细胞Bcap-37和泌乳期山羊乳腺,转染后提取细胞裂解液和乳腺组织,采用RT-PCR和ELISA方法检测GH转录和表达水平。结果显示与空白组相比,转染pLG质粒组在细胞(P<0.01)和乳腺组织中(P<0.05)GH转录水平和蛋白表达量均显着提高,表明载体pLG可在乳腺细胞上和乳腺组织中成功转录和表达GH。试验结果显示构建的山羊GH基因乳腺特异性打靶载体可以应用到后续的转GH基因奶山羊生产研究中。3.山羊GH基因乳腺特异性打靶载体pLG转染山羊胎儿成纤维细胞和细胞筛选将pLG质粒通过脂质体法转染山羊胎儿成纤维细胞,转染后36h加入G418(600ng/mL)进行正筛选,10d后山羊胎儿成纤维细胞出现明显单克隆集落。将G418浓度降至300ng/mL并加入丙氧鸟苷(4umoL/mL)负筛选,7d后挑取单克隆集落消化传代至48孔细胞培养板进行连续扩培,扩培至6孔板后提取单克隆基因组DNA并冻存细胞。试验结果表明共筛选到36个单克隆细胞株,PCR检测结果显示其中有5个单克隆细胞株正确整合。(本文来源于《南京农业大学》期刊2011-12-01）
王帅,赵学明,朱化彬,杜卫华,郝海生[4]（2011）在《pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化》一文中研究指出绿色荧光蛋白(GFP)是一种分选细胞的理想标记,将绿色荧光蛋白基因定点整合到牛的Y染色体上是利用GFP分选X和Y精子的关键。本研究通过特殊的引物设计和高保真酶PCR扩增将loxp位点和Lox2272位点引入pEGFP-N3载体中,构建了重组质粒pEGFP-loxp-Lox2272。采用LipofectamineTM(Lip)2000介导线性化质粒pEGFP-loxp-Lox2272转染牛胎儿成纤维细胞,结果显示,在质粒用量一定的情况下30μLLip2000转染细胞的效果最理想;转染后的牛胎儿成纤维细胞用G418筛选,结果显示,浓度为600μg/mL的G418最适合筛选转基因细胞。本实验的结果为载体改造提供了一种有效的方法并为牛体细胞基因打靶阳性细胞系的筛选提供了重要的技术参考。(本文来源于《农业生物技术学报》期刊2011年04期）
林峰,苗北平,卢永田[5]（2011）在《重组adv5.oriP.HRP腺病毒载体构建及对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达》一文中研究指出目的:构建腺病毒载体adv5.oriP.HRP,观察其对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达。方法:采用p△EIsp1A穿梭质粒系统,酶切、定向克隆方法构建含HRP自杀基因的p△EIsp1A/oriP-HRP重组质粒,在293细胞中进行重组腺病毒adv5.oriP.HRP包装、扩增、纯化与病毒滴度测定,体外转染EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株与EBV阴性鼻咽癌CNE-2Z细胞株,RT-PCR法检测不同细胞系中adv5.oriP.HRP的表达,Western blot法检测经不同浓度adv5.oriP.HRP转染后细胞中HRP蛋白的表达。结果:p△EIsp1A/oriP-HRP在293细胞中包装扩增后的病毒滴度为528@1012TCID50/L;体外转染鼻咽癌C666-1细胞株与CNE-2Z细胞株后,RT-PCR检测到C666-1细胞系1229bp处得明亮条带,而CNE-2Z细胞几乎未检测到重组基因mRNA的表达,Western blot可见随着MOI的增加C666-1细胞中HRP蛋白表达逐渐增多,而在CNE-2细胞中HRP蛋白的表达几乎呈阴性,两组间差别有统计学意义(P<0.05)。结论:重组腺病毒adv5.oriP.HRP能在EBV阳性的鼻咽癌C666-1细胞株内靶向性转染和表达。(本文来源于《数理医药学杂志》期刊2011年03期）
王帅[6]（2011）在《牛Y染色体插入型打靶载体的构建及阳性细胞系的筛选》一文中研究指出在奶业生产中,人们期望借助性别控制技术获取更多的母牛。现有的性控技术远远不能满足奶业生产的需求,开发更为高效的性别控制技术具有重要的现实意义和广阔的应用前景。雄性特异性肌肉肥大转基因小鼠的成功制备实现了对小鼠Y染色体的基因打靶并特异性的提高了雄性转基因小鼠的生产性能。本研究的目的是期望通过基因打靶的方式将GFP基因定点整合到牛胎儿成纤维细胞的Y染色体上,并最终实现在牛的Y精子中或雄性胚胎中特异性表达绿色荧光蛋白,为大幅提高性别控制技术的效率提供可能。我们采集了两头发育40天的奶牛胎儿分别建立了胎儿成纤维细胞系。经PCR鉴定,两头胎儿中有一头是雄性胎儿,对应的细胞系命名为0195牛胎儿成纤维细胞。以载体p079 pPNT6为模板,利用PCR扩增出了长度为1952bp的片段,在扩增产物中靠近酶切位点KpnI的一端没有loxp位点。依据设计的酶切位点,用扩增产物替代载体p079 pPNT6上的相应片段,成功的将原载体中靠近酶切位点KpnI的loxp位点去除掉,构建了插入型打靶载体的骨架载体pPNT-loxp。以雄性胎儿的基因组DNA为模板,利用长片段PCR技术分别扩增出了3152bp和4147bp的USP9Y基因序列作为同源臂,在扩增长度为4147bp的片段时,将一个loxp位点引入到其5’端,在扩增长度为3152bp的片段时,将一个lox2272位点引入到其3’端。依据设计的酶切位点将两段同源臂先后插入到载体pPNT-loxp中,构建了牛Y染色体插入型打靶载体pPNTdloxp/USP9Y。利用类似的方法,我们分别将loxp位点和lox2272位点引入到pEGFP-N3载体中“CMV-EGFP”片段的两侧,构建了pEGFP-loxp-lox2272载体。利用pPNTdloxp/USP9Y打靶成功后,pEGFP-loxp-lox2272载体在Cre重组酶的介导下,能够将“CVM-EGFP”片段置换到Y染色体上。将pEGFP-loxp-lox2272载体用BamHI进行线性化,通过脂质体转染0195牛胎儿成纤维细胞。转染24小时后,消化细胞接种至96孔细胞培养板或48孔细胞培养板中,用G418浓度为600μg / mL的完全培养基筛选两周,然后用G418浓度为300μg / mL的完全培养基维持筛选两周,获得了82个扩大培养的细胞克隆。PCR鉴定结果显示在筛选到的细胞克隆中有一孔细胞中存在Y染色体打靶阳性的细胞。(本文来源于《甘肃农业大学》期刊2011-06-01）
宋利军[7]（2011）在《介导沉默INHA表达的转基因载体构建及阳性细胞的筛选鉴定》一文中研究指出水牛耐高温、抗病力较强,适宜在高温地区饲养,且水牛奶中乳蛋白和乳脂含量较高。但水牛繁殖力低、产奶量少的缺点,直接限制了奶水牛业的发展。抑制素(Inhibin, INH)抑制垂体合成和分泌FSH,从而影响卵泡发育、精子发生及生殖活动。RNA干扰(RNA interference, RNAi)在生物体内调节基因表达,可用于干扰INHA的表达。PB (piggyBac transposon)转座子遵循“剪切-粘贴”机制,具有特异性识别位点TTAA、剪切和插入不留下痕迹、稳定整合和传代、负载容量大和转座效率高等特点,且PB转座子具有能删除特定基因(如标记基因GFP)的Cre/LoxP系统,将其与转基因技术相结合可以获得安全的转基因动物。因此,本研究利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体,构建干扰INHA基因表达的转基因载体,经G418筛选获得转基因阳性细胞,为显微注谢或核移植技术获得转基因水牛提供素材,以期为提高水牛繁殖力和对INH基因功能深入研究奠定基础。本研究主要内容如下：(1)构建了5个干扰载体(其中1个瞬时表达载体和4个转基因载体)和3个阴性对照载体。利用瞬时表达载体RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen构建2个干扰载体psiRNA-1和psiRNA-2;利用含有Cre/LoxP系统的PB转座子载体pHi5和pHl,分别构建pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3、pHi5siRNA-4和pH1siRNA-1、PH1siRNA-3、pH1siRNA-4转基因载体；其中psiRNA-1、pHi5siRNA-1和pH1siRNA-1为阴性载体。(2)转基因载体pHi5、pHi5siRNA-1、pHi5siRNA-3和pHi5siRNA-4与转座酶载体混合后分别转染水牛颗粒细胞,通过检测INHA的表达量和孕酮的分泌量,筛选出具有较好干扰效果的片段siRNA-3和siRNA-4, siRNA-3干扰效果更好。(3)初步筛选鉴定出4个转基因阳性水牛胎儿成纤维细胞。两组转基因载体与转座酶载体混合后分别转染水牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选,观察GFP的表达情况。当筛选到第6d后,有4种细胞系能基本稳定表达GFP,初步表明成功获得转基因阳性细胞,分别为pHi5siRN A-3阳性水牛胎儿成纤维细胞、pHi5siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞、pH1siRNA-3阳性水牛胎儿成纤维细胞和pH1siRNA-4阳性水牛胎儿成纤维细胞。(4)建立了构建RNAi转基因载体技术,并建立了筛选转基因阳性细胞技术。(本文来源于《华中农业大学》期刊2011-06-01）
孟立[8]（2010）在《人乳铁蛋白表达载体的构建及转基因阳性细胞株的建立》一文中研究指出人乳铁蛋白(Human Lactoferrin, hLF)是一种具有高级空间结构的糖蛋白,具有广泛的生物学作用。大量体内体外试验表明：hLF不仅在肠道铁离子的吸收以及抵抗细菌、病毒、真菌、单细胞生物等方面具有重要作用,而且在调节炎症反应、调控基因表达及促进骨骼生长方面也具有重要作用。因此,hLF在疾病防治、营养补充、食物或药品的贮藏等方面具有广阔的应用前景,已成为近几年来研究的热点之一,利用原核和真核表达系统已在生产重组hLF方面做了很多尝试。然而,还有很多问题尚待解决,如蛋白的表达水平较低、翻译后的蛋白缺乏准确的修饰及纯化步骤复杂等,均致使这些方法不适合大规模的生产重组hLF。通过乳腺生产外源蛋白,具有成本低、分离纯化简单、可持续生产、不易污染及所表达的外源蛋白可进行翻译后加工、具有d然蛋白的结构与活性等优点,是生产基因工程药物的理想场所。鉴于此,本研究构建了hLF cDNA基因乳腺表达载体pGBC-hLF,此载体为随机插入载体。为进行载体的体外表达验证,在此载体中引入了Neo筛选基因,并在山羊乳腺上皮细胞和小鼠乳腺上皮细胞中进行表达验证,为下一步制备稳定整合有人乳铁蛋白cDNA基因的山羊胎儿成纤维细胞提供试验支撑；为了制备转hLF cDNA基因的山羊胎儿成纤维细胞并提高转基因细胞的筛选效率,本研究在pGBC-hLF基础上引入了新霉素基因(Neo)和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为筛选标记,并利用条件培养液培养转基因细胞,试验发现这样可有效缩短G418药物作用时间,并可得到较纯的转基因细胞；为了下一步获得在基因组中定点整合有hLF cDNA基因的转基因奶山羊,消除位置效应对目的基因的表达影响,本试验又构建了人乳铁蛋白的打靶载体pGBC5-hLF,并在山羊乳腺上皮细胞中进行了载体的生物活性分析,为下一步实验室制备hLF cDNA基因在山羊β-casein基因座定位整合的胎儿成纤维细胞奠定基础。本试验的具体内容如下：(1)构建了人乳铁蛋白(hLF)基因的乳腺表达载体pGBC-hLF-Neo并验证其在乳腺细胞中的表达情况。本载体以山羊β-casein基因上游包括启动子、外显子1、内含子1、部分外显子2作为5’端调控序列,下游包括部分外显子7、内含子7、外显子8、内含子8、外显子9及3'部分基因组片段作为3'端调控序列,长度分别为6.2 kb和7.1 kb,将hLF基因(目的基因)和Neo基因(筛选标记)分别插入到5’端调控序列和3’端调控序列的下游,构建成pGBC-hLF-Neo载体,其全长为25.348 kb。为了检测该载体的生物学功能,本试验进一步用脂质体介导法将其分别导入到山羊乳腺上皮细胞GMC和小鼠乳腺上皮细胞株C127中进行表达验证,经G418抗性筛选8-10 d,得到的抗性细胞克隆经催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养,通过RT-PCR和Western Blot检测表明,本研究所构建的hLF基因乳腺表达载体具有生物学活性,山羊β-casein基因启动子驱动的hLF基因能够在C127和GMC等乳腺上皮细胞中转录翻译,这为下一步建立稳定整合hLF基因奶山羊胎儿成纤维细胞奠定了基础。(2)构建了带有双标记基因Neo和EGFP的乳腺表达载体pGBC-hLF-Neo-IRES2-EGFP,并通过酶切、PCR、测序鉴定了所构建载体的完整性。通过脂质体转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418抗性筛选7-10 d后得到绿色荧光细胞克隆;利用单个或多个表达绿色荧光蛋白的转基因细胞分离培养了转基因细胞,并通过试验对比条件培养液和非条件培养液对转基因细胞克隆形成效率的影响,结果证明条件培养液更有利于阳性细胞克隆的形成。借助EGFP和Neo基因作为双筛选标记,可有效的缩短转基因细胞在G418药物中的培养时间,提高了阳性克隆细胞的筛选效率。尝试了利用多重PCR鉴定了表达载体在转基因细胞基因组中的整合情况,避免了单基因PCR导致的假阳性问题；建立了转hLF基因山羊胎儿成纤维细胞,为以后核移植技术生产转基因克隆动物所需的供体细胞的制备提供了一种参考体系。(3)构建了人乳铁蛋白基因的β-casein基因座的定点打靶载体,此载体以β-casein上游包括启动子,外显子1、内含子1及部分外显子2的6.3kb的调控序列作为5’同源长臂,以下游2.4 kb的序列包括外显子8和9作为3'同源短臂,Neo基因和tk基因分别作为正负筛选基因,并在Neo基因两端分别加上正向重复序列loxp序列；将人乳铁蛋白基因(hLF)克隆到5’同源长臂下游, Neo克隆到β-casein基因7、8外显子之间,tk基因克隆到3'同源短臂外侧并用原核序列进行保护；经克隆重组后构建了本地山羊乳腺定点打靶载体,对打靶载体进行酶切鉴定和部分DNA测序,结果证明最终构建的打靶载体符合预先设计的载体图谱；采用脂质体法转入GMC细胞中,以进行打靶载体的表达功能检测,利用RT-PCR和western-blot等检测到了hLF特异性的表达,结果说明本载体能够指导外源基因在动物乳腺细胞内正确表达。(本文来源于《南京农业大学》期刊2010-04-01）
王梦筠,韦芳,王慧萍,季迅达,陈霞芳[9]（2009）在《选择性杀伤CEA阳性结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用》一文中研究指出目的构建能选择性杀伤表达癌胚抗原(CEA)的结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体。方法PCR扩增CEA基因5’端调控序列,构建以EGFPLuc作为报告基因的表达质粒pCEA-EGFPLuc。利用脂质体将pCEA-EGFPLuc导入CEA阳性和阴性细胞中,通过检测增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达和荧光素酶(luciferase)活性,评价CEA启动子活性。构建由CEA启动子调控的E1A,并携带HSVtk基因的条件复制型腺病毒Ad.CEA-E1A/CMV-TK,分别感染CEA阳性肿瘤细胞(Lovo和SW620)和阴性肿瘤细胞(HeLa),通过E1A表达和细胞存活率检测,评价该病毒对CEA阳性肿瘤细胞的选择性杀伤效果及联合应用环氧鸟苷(GCV)后的协同效应。结果CEA启动子具有较好的选择性和较高的活性。Ad.CEA-E1A/CMV-TK只在CEA阳性的肿瘤细胞中表达E1A。感染Ad.CEA-E1A/CMV-TK后,Lovo和SW620细胞的存活率分别为(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%,均显着低于HeLa细胞的(87.44±2.76)%(P<0.01);联合GCV对Lovo和SW620的杀伤效果增加,细胞存活率分别为(17.26±3.65)%和(23.93±5.40)%,显着低于未加GCV的(36.72±2.49)%和(39.82±4.76)%(P<0.01)。结论由CEA调控复制的Ad.CEA-E1A/CMV-TK对CEA阳性的结直肠癌细胞具有选择性杀伤作用,联合GCV后杀伤效果明显增强。(本文来源于《上海交通大学学报(医学版)》期刊2009年07期）
黄琳,熊宇,王生育,何康霞,何杰[10]（2009）在《CEA启动子驱动的CD—TK表达载体的构建及其对CEA阳性肠癌细胞的体外杀伤作用》一文中研究指出背景:自杀基因治疗又称为基因介导的酶前药物治疗(gene directed enzyme prodrugtherapy,GDEPT).它是把某些能将非毒性药物代谢成细胞毒性药物的酶类合成的基因(自杀基因suicide gene),经基因工程技术导入肿瘤细胞,使之在肿瘤细胞内特异地表达,从而使无毒的药物前体代谢为毒性产物,引起肿瘤细(本文来源于《Programme and Abstracts of the International Symposium on Medical and Pharmaceutical Biotechnology》期刊2009-04-27）
载体构建阳性论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
大麻素Ⅰ型受体(CNR1)是介导内源性大麻素发挥作用的关键分子,在食欲和能量代谢调控中发挥着重要作用。为了更深入研究CNR1的基因功能,本实验旨在构建和筛选有效沉默CNR1基因的干扰表达载体,并筛选出稳定转染干扰质粒的阳性细胞系。设计合成3对CNR1基因的特异性发夹小干扰RNA(siRNA)干扰引物,将其连接入干扰载体pYr-1.1,构建可沉默CNR1基因的siRNA表达载体CNR1-1、CNR1-2和CNR1-3。并采用LipofectamineTM(Lip)2000介导质粒转染L6细胞,绿色荧光蛋白的表达和流式细胞仪监测转染效率,通过实时荧光定量分析siRNA表达载体的干扰效果。并进一步用G418进行了稳定转染细胞筛选。结果显示,CNR1基因的siRNA表达载体构建正确,瞬时转染L6细胞的转染效率分别为10.45%(P<0.01)、8.57%(P<0.01)和8.71%(P<0.01);干扰效率为39%(P<0.05)、64%(P<0.01)及68%(P<0.01)。稳定筛选的最佳G418浓度为800μg/mL,稳定筛选后干扰效率分别为43%(P<0.05)、78%(P<0.01)及91%(P<0.01)。干扰效率较高的CNR1-3表达载体和稳定转染CNR1-3的细胞系为构建筛选成功的siRNA表达载体和阳性细胞系。本研究提供了一种有效沉默CNR1基因表达的方法,同时稳定沉默的阳性L6细胞系成功筛选为进一步研究大麻素Ⅰ型受体的基因功能提供了基础资料。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
载体构建阳性论文参考文献
[1].温志红,代艳,何爽.人MicroRNA-335阳性对照质粒真核表达载体的构建及意义[J].中国临床新医学.2015
[2].徐娥,任阳,朱琳娜,伍婷,袁章琴.大麻素Ⅰ型受体基因(CNR1)特异性siRNA表达载体的构建及稳定干扰阳性L6细胞克隆的筛选[J].农业生物技术学报.2012
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[4].王帅,赵学明,朱化彬,杜卫华,郝海生.pEGFP-loxP-Lox2272载体的构建及牛胎儿转基因阳性细胞筛选程序的优化[J].农业生物技术学报.2011
[5].林峰,苗北平,卢永田.重组adv5.oriP.HRP腺病毒载体构建及对EBV阳性鼻咽癌C666-1细胞株的靶向表达[J].数理医药学杂志.2011
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[9].王梦筠,韦芳,王慧萍,季迅达,陈霞芳.选择性杀伤CEA阳性结直肠癌细胞的条件复制型腺病毒载体的构建及应用[J].上海交通大学学报(医学版).2009
[10].黄琳,熊宇,王生育,何康霞,何杰.CEA启动子驱动的CD—TK表达载体的构建及其对CEA阳性肠癌细胞的体外杀伤作用[C].ProgrammeandAbstractsoftheInternationalSymposiumonMedicalandPharmaceuticalBiotechnology.2009
论文知识图
