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CRISPR/Cas9技术在酿酒酵母脂类代谢通路中的应用以及提高脂肪酸产量的研究

2020-12-08阅读(348)

CRISPR/Cas9技术在酿酒酵母脂类代谢通路中的应用以及提高脂肪酸产量的研究

论文摘要

随着大气污染能源枯竭的危机加重,寻找新型可以再生的的能源迫在眉睫,生物产脂肪酸作为一种可转化为生物柴油的化学品的技术,受到越来越多的重视。传统的改造微生物是利用基因重组的方式,耗时费力。CRISPR/Cas9以及dCas9系统作为新一代基因编辑和调控的技术,已经广泛地应用在多种物种中,能够快速修改基因组和调控基因的表达。CRISPR系统是利用gRNA将Cas9蛋白或dCas9蛋白引导在目标DNA序列上起作用,但是如何挑择有效的gRNA是关键问题。本研究利用CRISPR-dCas9正交技术对高产脂肪酸酿酒酵母中的两个代谢通路进行调控中的关键两个节点的调控,利用16种不同的表达抑制组合找到最优化的抑制情况:通过抑制PGI1基因以增加磷酸戊糖途径提高细胞中的NADPH,抑制IDH2基因以提高乙酰辅酶A的量,脂肪酸合成的前体物质的提高,最终增加了22%脂肪酸产量。脂肪酸在细胞内参与合成脂滴、膜结构等多种结构,如何提高脂肪酸在酿酒酵母体内的占比还未研究清楚。本研究还利用CRISPR-Cas9技术在对脂肪酸参与的多个通路进行阻断,删除整条通路上的基因,导引碳流向脂肪酸的合成和积累,从而增加脂肪酸的产量。我们发现阻断脂肪酸降解途径、磷脂降解途径和二酰基甘油合成途径有利于脂肪酸的合成和储存。我们的研究可以为脂肪酸在酵母中的生产起到促进作用,并且验证CRISPR技术可以加快酵母菌种的代谢工程改造,提高产量和性状。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 绪论
  •   1.1 提高脂肪酸产量的现实意义:可再生清洁能源生物柴油
  •     1.1.1 国内外生物柴油发展现状
  •     1.1.2 生物能源在我国的开发问题
  •   1.2 酿酒酵母产脂肪酸及其衍生物
  •     1.2.1 酿酒酵母产脂肪酸
  •     1.2.2 脂肪醇在酵母中的积累
  •     1.2.3 烷烃在酵母中的积累
  •   1.3 提高脂肪酸产量目前的途径
  •     1.3.1 阻断关键酶基因的表达
  •     1.3.2 消除竞争途径碳代谢
  •   1.4 CRISPR/Cas9介导的多基因编辑技术在酿酒酵母中的研究进展
  •     1.4.1 CRISPR/Cas9基因编辑技术
  •     1.4.2 CRISPR/Cas9技术的应用
  •     1.4.3 CRISPR/dCas9介导的基因调控技术
  •   1.5 研究课题的意义
  • 第二章 利用CRISPR/dCas9技术进一步改造酿酒酵母工程菌
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验工具和试剂
  •     2.2.1 菌株、载体和合成引物
  •     2.2.2 培养基试剂和仪器
  •     2.2.3 实验用的酶及仪器
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 酿酒酵母电转感受态制备及转化
  •     2.3.2 酿酒酵母快速全基因组DNA提取
  •     2.3.3 大肠杆菌感受态的制备及转化
  •     2.3.4 大肠杆菌质粒提取
  •     2.3.5 PCR产物纯化
  •     2.3.6 Golden-Gate
  •     2.3.7 PCR反应体系及程序
  •     2.3.8 酶切体系
  •     2.3.9 细胞生长滴点试验
  •     2.3.10 mCherry红色荧光测量方法
  •     2.3.11 酿酒酵母发酵
  •     2.3.12 酿酒酵母细胞总脂肪酸的提取和定量方法
  •   2.4 结果与讨论
  •     2.4.1 质粒pdCas9的构建
  •     2.4.2 质粒pdCas9-LacZ的构建
  •     2.4.3 载体pST.1.G.URA3的构建
  •     2.4.4 dCas9-His3及dCas9-His3-Neg载体的构建
  •     2.4.5 成功验证dCas9质粒有效果
  •     2.4.6 验证dCas9是否能应用于脂肪酸生产
  •     2.4.7 找到用于不同程度下降调节IDH2和PGI1的gRNA位点
  •     2.4.8 表达载体gRNA的构建
  •     2.4.9 红色荧光蛋白mCherry定量检测结果
  •     2.4.10 构建不同gRNA搭配的dCas9-IDH2/PGI1载体
  •     2.4.11 不同gRNA搭配dCas9下调IDH2和PGI1对脂肪酸生产的影响
  •   2.5 本章小结
  • 第三章 利用CRISPR/Cas9技术在酿酒酵母中消除脂肪酸生产的竞争代谢途径
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验工具和试剂
  •     3.2.1 实验所用的菌株、构建的载体、合成引物
  •     3.2.2 试剂及仪器
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 合成dornor的序列
  •     3.3.2 乙醇沉淀DNA的方法
  •     3.3.3 构建pCas9-gRNA载体的方法
  •   3.4 结果与讨论
  •     3.4.1 构建pCas9相应载体
  •     3.4.2 构建pCas9-PLB载体
  •     3.4.3 阻断酿酒酵母中脂肪酸积累的竞争通路对脂肪酸产量的影响
  •     3.4.4 阻断酿酒酵母中脂肪酸积累的竞争通路对脂肪酸产率的影响
  •   3.5 本章小结
  • 第四章 结论与展望
  •   4.1 结论
  •   4.2 展望
  • 参考文献
  • 致谢
  • 作者和导师简介
  • 附件

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 路曼

    导师: Jens Nielsen,姚心

    关键词: 多基因编辑,酿酒酵母

    来源: 北京化工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 北京化工大学

    分类号: Q78

    DOI: 10.26939/d.cnki.gbhgu.2019.001356

    总页数: 78

    文件大小: 5169K

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