王萍[1]2004年在《胃癌p16基因启动子5’CpG岛甲基化状态》文中认为许多遗传因素和环境因素共同促进了肿瘤的形成，DNA甲基化为它们之间的相互作用提供了纽带。众所周知，正是机体固定的DNA甲基化的模式在很大程度上保证了基因组的稳定性和正常基因的表达。然而，在肿瘤中这种理想的平衡状态被许多肿瘤抑制基因中被称为CpG岛的调控区异常甲基化所打破。相关的肿瘤抑制基因有：BRCA1、hMLH1、p16INK4A、APC、VHL等，这种CpG岛的异常甲基化导致了它们的转录抑制。所以许多学者认为CpG岛的异常甲基化与肿瘤形成及衰老密切相关。p16基因甲基化异常在人类许多肿瘤包括胃癌中均可见到，其它肿瘤如淋巴瘤、前列腺癌、乳腺癌、食管癌、肺癌等。过去对胃癌p16基因甲基化研究多集中在外显子甲基化异常与肿瘤关系，而对p16基因启动子CpG岛甲基化状况与胃癌发生发展的相关性报道较少。 由于甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR，MSP)这一新技术的进展，使得更多的甲基化位点被研究。相比于Southern杂交法和甲基化敏感性酶切的PCR分析法，它不仅能弥补此两种方法的缺点，自身还具有众多显着优点。MSP避免了应用限制性酶及由此造成的酶切不完全的问题，同时还有灵敏度高、特异性强且适合异质性样本等优点。本实验用MSP法检测了胃癌、癌旁及正常组织p16基因启动子5'CpG岛甲基化状况。目的是探讨p16基因启动子CpG岛异常甲基化状态及异常甲基化的发生与胃癌患者的临床病理特征的关系。郑州大学2004届硕士研究生毕业论文胃癌P16基因启动子5’cPG岛甲基化状态 材料和方法 胃癌手术切除标本32例取自2002一2003年郑州大学第一附属医院、河南省人民医院和河南省肿瘤医院。所有的标本均经病理学明确诊断。患者年龄23一69岁，平均年龄48岁。患者术前均未接受过放疗和化疗。其中，高中分化腺癌7例，低分化19例，粘液腺癌和印戒细胞癌6例。所有组织标本离体后立即置液氮中速冻然后保存于一80℃。用MSP、非变性聚丙烯凝胶电泳和PCR产物测序分析检测胃癌、癌旁和正常组织p16基因启动子5’CpG岛甲基化发生状况，并将它们与临床病理资料相结合分析。 采用SPSSIO.0统计软件包进行统计分析，以尸<0.05为有统计学意义。 结果 1.胃癌组织、癌旁组织和正常组织p16基因启动子5’CPG岛甲基化率分 别为56.25%、25%和6.25%，胃癌组织与正常组织甲基化发生率的差别 具有显着性，尸<0.05。 2.胃癌患者中，33.33%的高中分化腺癌与57.8%的低分化腺癌有P16基因 启动子5’CpG岛甲基化，二者甲基化发生率的差别具有显着性，尸< 0 .05。 3.有淋巴结转移组甲基化率为73.7%显着高于无淋巴结转移组，尸<0.05。 4.胃癌组织p16基因启动子CPG岛甲基化率随浸润深度的增高而增高， 但在统计学上差异无显着性，尸>0.05。 5.胃癌患者中，男女患者的甲基化率分别为33.33%和50%，差别无显着 性(尸>0.05);<50岁患者与)50岁患者甲基化率分别为47%和 66.7%，差别无显着性(尸>0.05);肿瘤大小大于或小于3cm的患者甲 基化率的差异无显着性(尸>0.05)。 结论 1.MSP是检测CPG富含区甲基化状态的一种简单、敏感和特异的方法。 2.胃癌组织p16基因启动子5’CPG岛甲基化显着高于正常组织，说明该 基因上游调控序列的甲基化可能是胃癌形成过程中的一个重要分子标志。郑州大学2004届硕士研究生毕业论文胃癌P16基因启动子5’CpG岛甲基化状态3.低分化腺癌p16基因启动子cpG岛甲基化率高，表明p16甲基化频率 与肿瘤的分化程度密切相关。4.CpG岛甲基化的程度与淋巴结转移密切相关，其甲基化在胃癌恶性进 展中起重要作用，可以考虑作为估计胃癌患者预后的一个指标。5.胃癌中p16基因启动子甲基化与患者的年龄、性别、浸润深度及肿瘤大 小等临床病理因素无关。
刘玲[2]2012年在《新疆哈萨克族食管癌早期相关基因甲基化分析及功能研究》文中认为目的： DNA甲基化是肿瘤发生的早期分子事件，CpG岛局部甲基化异常早于细胞的恶性增生，因此基因启动子区高甲基化或低甲基化是肿瘤发生早期的一个高度灵敏的肿瘤生物标志物，可通过检测肿瘤相关基因的甲基化状态，为肿瘤的早期诊断、疗效观察及预后判断提供极为重要的信息。新疆哈萨克族食管癌是我区的特高发疾病，基于目前尚无系统的，在肿瘤发生前即可操作的早期预警体系，本课题拟从研究消化道肿瘤早期相关的原癌基因survivin，cdc42与抑癌基因p16，FHIT在哈萨克族食管癌组织中的mRNA差异表达入手，探讨其启动子区CpG岛甲基化状态与基因表达的关系，在此基础上进一步研究基因启动子区甲基化状态的改变对基因表达的调控及对细胞生物学功能的影响，为新疆哈萨克族食管癌早期预警指标体系的建立，早期诊断，治疗和预后提供理论依据。方法：1）哈萨克族食管癌组织中survivin、cdc42、p16和FHIT基因mRNA水平的表达检测：采集新疆哈萨克族食管癌组织及远端无癌组织标本48对，Trizol法提取总RNA，应用半定量RT-PCR技术检测4个消化道肿瘤早期相关基因在食管癌组织及远端无癌组织中的表达；2）哈萨克族食管癌中survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区CpG岛的甲基化检测：应用Methprimer软件查找survivin、cdc42、p16和FHIT基因启动子区第一个CpG岛，并设计甲基化引物及非甲基化引物，用亚硫酸氢钠修饰基因组DNA之后运用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测survivin、cdc42甲基化状态；利用高分辨率熔解曲线技术（HRM）检测p16和FHIT基因启动子区CpG岛甲基化程度，进而探究甲基化状态或程度差异与基因表达的关系；3）survivin及cdc42启动子区CpG岛重组载体的构建及甲基化状态对报告基因CAT活性的影响：重组体的构建：PCR扩增包含survivin、cdc42基因启动子区第一个CpG岛的DNA片段，及任意一段不含CpG岛的random序列，酶切后分组，一组体外甲基化酶修饰，另一组不修饰，分别与酶切的pCAT3-Enhancer载体相连，构建CpG island-pCAT3-Enhancer重组载体，将未甲基化修饰的重组体及pCAT3-Enhancer空载体转化至甲基化酶缺陷的大肠杆菌ER1793（Mcr-、Mrr-）中，将甲基化修饰的重组载体及pCAT3-Enhancer空载体转化至可持续甲基化状态的大肠杆菌JM109中。挑选阳性克隆，测序并检测甲基化程度；重组载体转染至食管癌细胞株Eca109中：将8种载体转染至食管癌细胞株Eca109中，37℃孵育48小时；报告基因氯霉素乙酰基转移酶（CAT）活性的检测：收获细胞，提取CAT基因表达产物，加C~(14)标记的氯霉素后，用薄层层析法测定CAT活性，以此分析survivin，cdc42启动子区CpG岛甲基化对下游CAT活性调控能力的影响，确定基因启动子区甲基化差异对基因表达的影响。结果：1）在48对食管癌组织标本中，癌组织中survivin，cdc42，p16，FHIT阳性表达率分别为87.50%，97.92%，75.00，83.33%，远端无癌组织中阳性表达率分别为58.33%，100.00%，77.08%，85.42%。癌组织与远端无癌组织比较，survivin阳性表达率明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT阳性表达率癌组织与远端无癌组织之间差异无统计学意义（P＞0.05）。survivin mRNA表达水平癌组织明显高于远端无癌组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。cdc42，p16，FHIT mRNA表达水平癌组织与远端无癌组织差异无统计学意义（P＞0.05）；2）在48例食管癌癌组织中，survivin mRNA的表达与淋巴结转移、临床分期、肿瘤侵犯深度具有相关性（r=0.379、0.488、0.393；P=0.017、0.002、0.019），与分化程度无相关性（P＞0.05）。cdc42mRNA表达与临床分期，肿瘤分化程度具有相关性（r=0.452，r=0.325；P=0.003P=0.034），与淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。p16mRNA表达与临床分期、分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。FHITmRNA表达与肿瘤临床分期具有相关性（r=0.338，P=0.035），而与分化程度、淋巴结转移及侵润程度之间均无相关性（P＞0.05）。3）在20对食管癌标本中，癌组织中70%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，远端无癌组织中75%的survivin基因启动子区CpG岛为杂合型甲基化，组织间杂合型甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA表达水平均大于远端无癌组织；远端无癌组织中有4例甲基化，其对应的mRNA均未表达；4）在20对食管癌标本中，癌组织中有90%c的dc42启动子区CpG岛呈现出甲基化状态，远端无癌组织中有80%呈现为甲基化状态，组织间甲基化状态无明显差异（P＞0.05）。且cdc42启动子区CpG岛甲基化状态与mRNA水平的表达无相关性；5）在20对食管癌标本中，癌组织及远端无癌组织中p16启动子区CpG岛甲基化例数均为20例，甲基化比例100%。p16启动子区CpG岛甲基化水平在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05）。p16启动子区CpG岛甲基化水平与食管癌组织TNM分期具相关性（r=0.511，P=0.030），与组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高阳性表达相比，甲基化与mRNA水平的表达无相关性；6）在20对标本中，FHIT启动子区CpG岛呈现低甲基化比例及水平。癌组织及远端无癌组织甲基化比例分别为35.00%和30%。甲基化水平均小于10%，且在癌组织及远端无癌组织无明显差异（P＞0.05），甲基化水平与食管癌组织TNM分期，组织分化，侵润程度，淋巴结转移均无相关性（P＞0.05）。与其mRNA高表达比较，提示低甲基化水平可能未影响基因的表达；7）甲基化及非甲基化的pCAT3-Enhancer载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的载体下游报告基因CAT酶的活性显着低于非甲基化的载体；8）甲基化及非甲基化的Random-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；9）甲基化及非甲基化的survivin启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，CAT酶的活性均接近阴性水平；10）甲基化及非甲基化的cdc42启动子区CpG岛-pCAT3-Enhancer重组载体，转染至食管癌细胞株中，甲基化的重组载体CAT酶的活性显着低于非甲基化的重组载体CAT酶的活性。结论：1）哈萨克族食管癌癌组织中survivin mRNA水平表达的增高在哈萨克族食管癌的发生、发展过程中起到了一定的作用。4例远端无癌组织中survivin启动子区CpG岛甲基化对应了mRNA的沉默表达，提示在正常组织中启动子区CpG岛甲基化具备调控基因表达的能力。在食管癌细胞株中，survivin启动子区CpG岛的甲基化及非甲基化均导致了CAT的失活。提示在癌组织或癌细胞中，启动子区CpG岛的甲基化可能与基因表达无直接关系，在癌变过程中可能有更多的机制调控了该基因的表达。2）哈萨克族食管癌中cdc42基因mRNA在癌组织和远端无癌组织中阳性表达率及表达水平无差异，提示该基因可能不是参与食管癌发生发展的主要机制。其启动子区CpG岛甲基化状态的阳性率在癌组织和远端无癌组织中也无差异，且甲基化状态与该基因mRNA水平的表达无关。在食管癌细胞株中，cdc42启动子区CpG岛的甲基化降低了下游报告基因CAT酶的活性，而非甲基化使酶保持较高活性。提示cdc42启动子区CpG岛甲基化本身具有调控基因表达的能力，而在哈萨克族食管癌中其启动子区CpG岛甲基化与基因表达无直接关系，说明在癌变过程中可能存在更多的调控机制参与了该基因的表达；3）哈萨克族食管癌中p16mRNA在癌组织和远端无癌组织中均为高表达，p16启动子区CpG岛甲基化比例高达100%，提示p16可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，且甲基化可能不是调控该基因表达的主要分子机制。4）哈萨克族食管癌中，FHIT mRNA在癌组织及远端无癌组织中表达无差异，其启动子区CpG岛甲基化比例及程度均较低，提示FHIT可能未参与哈萨克族食管癌的发生发展，同时低甲基化水平可能未影响FHIT基因的表达。
焦焕利, 刘文天[3]2006年在《胃癌及癌前病变中肿瘤相关基因CpG岛高甲基化的研究》文中研究说明目的:胃癌的发病是经过多个步骤逐步发展形成的, 是多基因异常表达的结果。DNA甲基化在肿瘤相关基因的表达调控中发挥主要的作用。本文拟通过检测胃癌、癌前病变和正常对照组中p16基因、错配修复基因(hMLH1)和钙粘蛋白(E—cadherin,E—CD)基因启动子区CpG岛甲基化水平及其表达,并结合临床病理资料,分析它们在胃癌发生、发展中的作用。方法:1．病例分组为叁组,分别是胃癌41例,癌前病变(慢性萎缩性胃炎、肠化生及不典型增生)40例及正常对照 (浅表胃炎或正常胃粘膜)38例。2．用甲基化特异性PCR (Methylation—Specific PCR,MSP)检测胃癌、癌前病变和正常对照组中p16、hMLH1和E—CD基因启动子5’CpG岛甲基化,将PCR扩增产物克隆并测序。3．免疫组化检测相关的基因蛋白表达。结果:1．p16基因启动子区5’CpG岛甲基化及其表达:胃癌中甲基化阳性率为56．09％(23／41),癌前病变为17．50％(7／40),而正常对照为2．63％(1／38),前组较后两组有统计学意义(P<0．05)。胃癌中p16基因表达阳性率为51．22％(21／41),癌前病变为90．00％(36／40),正常对照为 100．00%(38／38),前组较后两组有统计学意义(P<0．05)。未分化型胃癌的甲基化阳性率(81．25％)明显高于分化型(40％)(P <0．05),有淋巴结转移的胃癌其甲基化阳性率(80．95％)明显高于无转移组(30％)(P<0．05)。甲基化阳性率随浸润深度的增加而增高,但无统计学上意义(P>0．05)。甲基化阳性率与性别和年龄无关。甲基化阳性的胃癌,其p16表达阳性率显着低于甲基化阴性的胃癌(P<0．05)。2．E—CD基因启动子区5’ CpG岛甲基化及其表达胃癌中甲基化阳性率为19．51％(8／ 41),癌前病变为0．00％(0／40),而正常对照0．00％(0／38),前组较后两组有统计学意义(P<0．05)。胃癌中E—CD基因表达阳性率为70．73％(29／41),癌前病变为97．50％(39／40),正常对照为100．00％(38／38),前组较后两组有统计学意义(P<0． 05)。未分化型胃癌的甲基化阳性率(43．75％)明显高于分化型(4％)(P<0．05)。有淋巴结转移的胃癌其甲基化阳性率(80． 95％)明显高于无转移组(30％)(P<0．05)。甲基化阳性率随胃癌浸润深度的增加而增高,有统计学上意义(P<0．05)。甲基化阳性率与性别和年龄无关。甲基化阳性的胃癌。其E—CD表达阳性率显着低于甲基化阴性的胃癌(P<0．05)。3．hMLH1 基因启动子区5’CpG岛甲基化及其表达:胃癌中甲基化阳性率为34．15％(14／41),癌前病变为5．00％(2／40),而正常对照为0％(0／38),前组较后两组有统计学意义(P<0．05)。胃癌中hMLH1基因表达阳性率为60．97％(25／41),癌前病变为 95．00％(38／40),正常对照为100．00％(38／38),前组较后两组有统计学意义(P<0．05)。未分化型胃癌的甲基化阳性率(43． 75％)较分化型(28％)增高,但无统计学意义(P>0．05)。有淋巴结转移的胃癌其甲基化阳性率(38．09%)较无转移组(30%)增高, 无统计学意义(P>0．05)。甲基化阳性率与性别、年龄及浸润深度无关。甲基化阳性的胃癌,其hMLH1表达阳性率显着低于甲基化阴性的胃癌组织(P<0．05)。结论:1．胃癌组织中存在有p16、E—CD及hMLH1基因启动子5’CpG岛高甲基化, 并导致其基因表达率显着低于正常对照及癌前病变组织。2． p16、hMLH1基因甲基化的发生,从正常、癌前病变到胃癌有逐渐增加的趋势,提示其基因CpG岛高甲基化有可能作为诊断早期胃癌的一项较为敏感的指标。3．p16基因高甲基化与分化程度、淋巴结转移密切相关。4．E—CD基因的高甲基化与胃癌分化程度、胃壁浸润深度、淋巴结转移明显相关。可作为预测浸润、转移程度,评价预后的有效指标。
谷小虎[4]2005年在《胃癌与p15、p16基因启动子区甲基化的关系》文中指出前言 胃癌是全世界最常见的恶性肿瘤之一,在我国居各类恶性肿瘤之首。近年来的研究表明,胃癌的发生发展是一个多基因参与的多阶段过程。 肿瘤抑制基因(Tumor Suppressor Gene,TSG)是目前肿瘤研究领域的一个热点,是生物体内细胞增殖、分化和凋亡过程中的负性调节信号之一。细胞周期调控体系对维持正常细胞周期是必需的,而调控体系中关键因子的异常可导致调控紊乱,以致细胞增殖异常,不能及时分化和凋亡,肿瘤发生。 目前普遍认为DNA异常甲基化改变是除缺失与突变之外导致抑癌基因表达失活的第叁种机制,在肿瘤的发生发展中起着不可忽视的作用。DNA甲基化(methylation)是DNA的一种天然修饰方式,是由DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化的加上甲基基团(CH_3-)的碱基修饰过程。在人类和哺乳动物中,甲基化的胞嘧啶多位于CpG岛上,在人类基因组中CpG岛只占10%,其中70%～80%呈甲基化状态。基因甲基化的过程就是基因表达受到抑制的过程。抑癌基因甲基化以及基因启动子甲基化都与肿瘤的发生密切相关。 p15和p16基因是与肿瘤发生有密切关系的细胞周期素依赖性激酶抑制剂(CDKI),抑制细胞增殖,它的失活将有助于细胞的无限制生长,促进肿瘤的形成。许多研究发现p15、p16基因启动子区甲基化改变与白血病、胃癌、肝癌、大肠癌、以及食管癌等多种恶性肿瘤有关。对这方面进行研究有助于揭示细胞周期的调控,并为阐明细胞增殖、分化、癌变等过程提供线索,并且可能为肿瘤的临床诊断、治疗、预后提供理论、实验依据。 本实验采用甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)方法和免疫组织化学方法,检测胃癌原发灶、转移灶及癌旁非癌组织中p15、p16基因甲基化水平和蛋白表达情况旨在探讨p15、p16基因甲基化与胃癌转移
舍雅莉[5]2006年在《胃癌中RASSF2A和p16基因甲基化及其表达异常的实验研究》文中提出目的:检测胃癌及癌旁组织中RASSF2A和p16的甲基化及表达情况,探讨基因启动子区CpG岛甲基化与基因表达缺失之间的关系;并进一步研究RASSF2A和p16在胃癌中的作用机制以及与胃癌患者临床病理参数之间的关系。 方法:应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)、半定量RT-PCR法分别检测胃癌和癌旁组织中RASSF2A和p16启动子区CpG岛甲基化、mRNA表达情况,并用免疫组化S-P法检测p16蛋白的表达情况。 结果:(1)RASSF2A在胃癌组织中的甲基化率为57.14%(16/28),显着高于癌旁组织中甲基化率10.71%(3/28),差异有统计学意义(x~2=13.46,P<0.01);胃癌组织中,甲基化率随浸润深度的增加而增高,有统计学意义(P<0.01);有淋巴结转移者与无淋巴结转移者的甲基化率分别为81.25%(13/16)和25%(3/12),两组差异有统计学意义(P<0.01);随分化程度的降低,甲基化率有增高的趋势,但是差异无统计学意义(P>0.05);RASSF2A甲基化率与胃癌患者的性别、年龄无统计学意义(P>0.05)。 (2)RASSF2A mRNA在胃癌组织中的相对光密度值为0.827±0.238,显着低于癌旁组织中的相对光密度值1.360±0.076,差异有统计学意义(T=-5.94,P<0.01);胃癌组织中,RASSF2A mRNA表达强度随分化程度的降低而降低,有统计学意义(P<0.01);有淋巴结转移患者相对光密度值为0.604±0.254,显着低于无淋巴结转移患者相对光密度值0.873±0.212(P<0.05);随浸润深度的增加表达强度有下降的趋势,但是无统计学意义(P>0.05)。RASSF2A mRNA表达与胃癌患者的性别、年龄无统计学意义(P>0.05)。
焦焕利[6]2006年在《胃癌及癌前病变中肿瘤相关基因CpG岛高甲基化的研究》文中认为背景和目的: 胃癌的发病是经过多个步骤逐步发展形成的,是多基因异常表达的结果。DNA甲基化在肿瘤相关基因的表达调控中发挥主要的作用。本文拟通过检测胃癌、癌前病变和正常对照组中p16基因、错配修复基因(hMLH1)和钙粘蛋白(E-cadherin,E-CD)基因启动子区CpG岛甲基化水平及其表达,并结合临床病理资料,分析它们在胃癌发生、发展中的作用。 材料和方法 1.病例分组为叁组,分别是胃癌41例,癌前病变(慢性萎缩性胃炎、肠化生及不典型增生)40例及正常对照(浅表胃炎或正常胃粘膜)38例。 2.用甲基化特异性PCR(Methylation-Specific PCR,MSP)检测胃癌、癌前病变和正常对照组中p16、hMLH1和E-CD基因启动子5'CpG岛甲基化,将PCR扩增产物克隆并测序。 3.免疫组化检测相关的基因蛋白表达。 结果 1.p16基因启动子区5'CpG岛甲基化及其表达 胃癌中甲基化阳性率为56.09%(23/41),癌前病变为17.50%(7/40),而正常对照为2.63%(1/38),前组较后两组有统计学意义(P<0.05)。胃癌中p16基因表达阳性率为51.22%(21/41),癌前病变为90.00%(36/40),正常对照为100.00%(38/38),前组较后两组有统计学意义(P<0.05)。 未分化型胃癌的甲基化阳性率(81.25%)明显高于分化型(40%)(P<0.05);有淋巴结转移的胃癌其甲基化阳性率(80.95%)明显高于无转移组(30%)(P<0.05)。甲基化阳性率随浸润深度的增加而增高,但无统计学上意义(P>0.05)。
黄大兵[7]2009年在《胃癌组织p16、RUNX3和CHFR基因启动子区CpG岛异常甲基化的研究》文中研究说明目的DNA启动子区CpG岛的异常甲基化是导致胃癌中抑癌基因功能失活的重要机制之一,参与了胃癌的发生发展。本研究通过联合应用甲基化特异性PCR法(MSP法)、亚硫酸氢盐修饰后测序法(BSP法)检测胃癌组织、癌旁组织和正常对照组织中p16基因、RUNX3基因和CHFR基因启动子区CpG岛的甲基化水平,探讨它们在胃癌发生发展中的作用以及与临床资料参数之间的联系。方法选择经病理确诊的61例原发性胃癌患者,胃癌患者术前均未行放疗和化疗,收集胃癌根治术后肿瘤组织及其配对的癌旁组织。同时收集30例胃正常对照组织,应用MSP方法和BSP方法检测标本中p16、RUNX3、CHFR基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果1. p16基因启动子区CpG岛的异常甲基化胃癌组织中甲基化阳性率为68.8% (42/61),癌旁组织为6.5% (4/61),而正常组织为3.3% (1/30),前组与后两组比较均有统计学意义(p<0.05)。低分化和未分化组胃癌组织的p16基因甲基化阳性率明显高于高分化和中分化组胃癌组织的甲基化阳性率;有淋巴结转移的胃癌组中p16基因甲基化阳性率显着高于无淋巴结转移组(p<0.05);胃癌中T3和T4期p16基因的甲基化阳性率显着高于T1和T2期的甲基化阳性率(p<0.05);而p16基因甲基化阳性率在患者的年龄、性别、病理分期、肿瘤大小、淋巴结转移数目中的差异均无显着性(p>0.05)。2. RUNX3基因启动子区CpG岛的异常甲基化胃癌组织中RUNX3基因甲基化阳性率为54.0% (33/61),癌旁组织为8.1% (5/61),正常组织为0% (0/30),前组与后两组比较有统计学意义(p<0.05)。RUNX3基因在≥5cm的胃癌组织中的甲基化阳性率显着高于其在<5cm的胃癌组织的甲基化阳性率(p<0.05),而其异常甲基化在患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、组织分化程度、病理分期以及淋巴结转移等临床资料参数中的差异均无显着性(p>0.05)。3. CHFR基因启动子区CpG岛的异常甲基化胃癌组织中CHFR基因甲基化阳性率为40.9% (25/61),癌旁组织为9.8% (6/61),正常组织为0% (0/30),前组与后两组比较有统计学意义(p<0.05)。CHFR基因在≥5cm的胃癌组织中的甲基化阳性率显着高于其在<5cm的胃癌组织的甲基化阳性率(p<0.05),而其异常甲基化在患者年龄、性别、肿瘤浸润深度、组织分化程度、病理分期以及淋巴结转移等临床资料参数中的差异均无显着性(p>0.05)。4. p16和RUNX3基因之间、p16和CHFR基因之间以及RUNX3和CHFR基因之间在胃癌组织中的异常甲基化作用无显着相关性和一致性(p>0.05)。结论1.胃癌组织、癌旁组织均存在p16、RUNX3和CHFR基因启动子区CpG岛的异常甲基化作用,且它们在癌组织中的甲基化阳性率显着高于相应的癌旁组织,提示抑癌基因启动子区CpG岛异常甲基化在胃癌的发生发展中是早期和频繁的特异性事件,同时存在多个抑癌基因启动子区CpG岛的异常甲基化是胃癌发生的重要机制之一。2.从正常胃组织、癌旁组织到胃癌组织,p16、RUNX3、CHFR基因启动子区CpG岛异常甲基化阳性率逐渐增加,提示此叁基因的异常甲基化可作为胃癌早期诊断的敏感指标。3. p16基因启动子区CpG岛异常甲基化与胃癌患者组织分化程度、有无淋巴结转移以及肿瘤浸润深度均密切相关,可作为评估胃癌组织分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移的有效指标。4. RUNX3和CHFR基因启动子区CpG岛异常甲基化与肿瘤大小密切相关,它们的异常甲基化可用于评估胃癌细胞的生长。
王栋[8]2006年在《胃癌相关基因甲基化检测和药物联用去甲基化的研究》文中提出背景: 胃癌患者的高死亡率主要因为缺乏胃癌早期诊断的特异性标志物和有效的治疗手段。以往的研究主要集中在肿瘤特异性的基因组DNA序列的改变上,如基因易位、反转、缺失、突变等,但在相当一部分肿瘤患者的癌细胞中,抑癌基因沉默并非基因水平改变所致,而是由于基因启动子区发生了甲基化。在基因表达调控、细胞增殖分化、肿瘤发生发展中,DNA甲基化起着重要作用。基因调节元件内的甲基化,如启动子、增强子等的甲基化,一般会抑制它们的功能。据Knudson的“二次打击学说”,由于甲基化或甲基化与突变、缺失共同作用,使得抑癌基因的两个等位基因完全失活。甲基化酶抑制剂5-氮-2脱氧胞苷嘧啶(5-Aza-2—deoxycytidine,Aza)能逆转肿瘤细胞的基因甲基化,恢复mRNA转录活性和蛋白表达,而且表达水平随细胞的类型和药物剂量的改变而不同,从而证实启动子的甲基化是抑癌基因表达关闭的主要原因。结合肿瘤相关基因的功能研究及甲基化相关基因失活的机制研究,充分证明抑癌基因CpG岛甲基化直接促进恶性行为。因此在肿瘤早期诊断、评估肿瘤风险及预后中,DNA甲基化将成为具有广泛应用前景的分子标志。 近年来在多种肿瘤中观察到P16、E-CD、hMLH1基因启动子区异常甲基化,同时伴随基因转录失活和表达缺失。那么在临床胃癌标本中,胃癌细胞系中,P16、ECD、hMLH1的甲基化状况、基因转录、表达水平如何呢?如果存在转录失活和表达抑制,启动子区甲基化是否是其发生的主要机制呢?去甲基化药物Aza能否针对基因甲基化的靶点发挥疗效呢?Aza联合脱乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(sodium phenylbutyrate,SPB),能否逆转胃癌细胞系、裸鼠胃癌种植瘤的基因甲基化,并恢复基因转录和表达活性呢?因此,本课题开展对P16、ECD、hMLH1基因在胃癌临床标本、胃癌细胞系、裸鼠胃癌种植瘤中的基因启动子区甲基化检测以及针对该靶点进行去甲基化治疗的研究。
宋宇[9]2014年在《胃癌中HHIP、Patched基因的表达及甲基化水平与临床特征的关系》文中研究指明研究背景和目的：胃癌是严重危害人类健康的最常见的恶性肿瘤之一，发病率位居所有恶性肿瘤的第二位，死亡率列所有恶性肿瘤的第叁位。目前根治性手术仍然是胃癌的主要治疗方式，也是唯一有希望治愈胃癌的手段。但临床上仍有大多数患者确诊时已是中晚期，手术效果不佳，直接影响预后。因此深入研究胃癌发生、发展的分子机制，可为胃癌早期诊断提供依据，同时也为临床治疗提供有效的靶点治疗，具有重要的临床意义。近年来有研究证明Hedgehog(HH)信号传导通路在胃的胚胎发育过程中起非常重要的调控作用，该通路的过度激活可导致胃癌的发生，因此HH通路与胃癌的发生、发展密切相关，针对该通路的特异性靶向治疗有可能成为临床上治疗胃癌的有效的新措施。HH通路主要由HH配体，膜受体Patched (Ptch)、Smoothened (Smo)及下游的转录因子Gli组成。近年来有研究发现Hedgehog通路中还包括Hedgehog-interactingprotein (HHIP)基因，HHIP能和Patched竞争性结合Hh蛋白，从而阻断HH信号转导。对HH通路来说，HHIP基因与Patched基因是该通路的两个负反馈因子，可直接抑制Hedgehog通路，具有极其重要的意义。因此本课题选用HHIP和Patched为目的基因，进行深入研究。表观遗传学是指DNA序列不发生变化，但基因表达却发生了可遗传的改变，这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生的改变，即基因型未发生变化而表型却发生了改变，且这种改变在发育和细胞增殖构成中能稳定传播。其中DNA甲基化，组蛋白修饰改变，非编码RNA等是表观遗传修饰的主要方式，也是研究的热点。目前研究发现：基因组的广泛低甲基化是肿瘤细胞的一个普遍特征；肿瘤抑制基因启动子区的高甲基化可导致抑癌基因沉默、失活致表达产物减少或丧失。DNA甲基化与胃癌之间关系密切，研究发现在胃癌的各个阶段都能检测有基因甲基化的存在，甚至癌前病变阶段也能发现。本文对胃癌中HHIP、Patched基因的表达及甲基化水平进行检测和分析，并通过随访，观察HHIP、Patched基因的表达与叁年总生存率的相关性，试图发现HHIP、Patched基因在胃癌发生、发展的作用机制及与胃癌预后的相关性。目前有报道Patched基因在胃癌中启动子区呈高甲基化，而研究主要集中在胃癌细胞株，对HHIP和Patched基因在胃癌组织中的甲基化状态分析未见相关报道，因此本文以HHIP和Patched为研究基因，分别检测两个基因在胃癌组织、癌旁组织中的表达和启动子区CpG岛甲基化状态，分析其与临床病理特征的关系。并通过随访，观察HHIP、Patched基因的表达与叁年总生存率的相关性。对人胃癌细胞株AGS在体外予去甲基化药物5-aza-dc干预，观察干预前后HHIP mRNA表达差异，启动子区CpG岛甲基化状态的影响。构建稳定的HHIP过表达慢病毒载体，转染胃癌细胞株AGS，观察转染前后HHIP mRNA表达和启动子区CpG岛甲基化状态的差异。从而揭示HHIP、Patched基因在胃癌发生、发展的作用机制及与胃癌预后的相关性，为胃癌的早期诊断、判断预后和靶向治疗提供新的思路。研究方法和材料：1.研究材料胃癌标本取自2009年6月-2013年12月在张家港市第一人民医院接受手术治疗的病人，术前均未经化疗和放疗，术后病理检查确定组织类型均为胃腺癌，无其他部位原发肿瘤。共选取60例胃癌组织和60例癌旁正常组织，每例标本的癌组织和癌旁正常组织均常规病理切片证实，并液氮保存。其中男性患者34例，女性患者26例，年龄36-72岁之间，平均年龄60.82岁，Ⅱ期胃癌患者40例，Ⅲ期患者20例，高中分化32例，低分化患者28例，有淋巴结转移24例，无淋巴结转移36例。胃癌细胞株AGS购自中国科学院上海细胞库，来源于一个未经治疗的切除的胃肿瘤碎块，为腺癌细胞，具有局部浸袭转移能力。2.研究方法主要分为对胃癌组织及癌旁组织研究；对胃癌细胞株AGS研究。2.1.对胃癌组织及癌旁组织的研究2.1.1.半定量RT-PCR取人胃癌组织和癌旁组织，使用Trizol试剂抽提总RNA，由逆转录试剂盒转录成cDNA后，采用RT-PCR法检测HHIP、Patched mRNA表达水平。2.1.2.免疫组化法取人胃癌组织和癌旁组织蜡块切片，按照APC法进行HHIP和Patched蛋白测定。2.1.3. bisulfite sequencing PCR（BSP）法常规抽提胃癌组织和癌旁组织DNA，亚硫酸盐处理后，进行BSP检测并测序，分析HHIP、Patched启动子区CpG岛每个位点甲基化状态。2.1.4. methylation-specific PCR (MSP)法常规抽提胃癌组织和癌旁组织DNA，亚硫酸盐处理后，应用Methyl Primer Express v1.0软件设计MSP引物，予MSP法检测HHIP启动子区CpG岛甲基化状态。2.1.5.随访采用Kaplan-Meier法进行叁年总生存率的统计。2.2.对胃癌细胞株AGS的研究2.2.1予去甲基化药物5-aza-dc干预AGS细胞株，进行相关研究。2.2.1.1MTT法用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10uM的5-aza-dc药物处理生长良好的AGS细胞株24h、48h、72h。用MTT法检测不同浓度下AGS细胞株的生长情况。2.2.1.2Annexin V／PI法检测凋亡用0、0.5、1.0、2.0、5.0、10uM的5-aza-dc对AGS细胞株进行干预，采用流式细胞仪检测细胞凋亡。2.2.1.3半定量RT-PCR使用Trizol试剂抽提AGS细胞株干预前后的RNA，由逆转录试剂盒转录成cDNA，采用RT-PCR法检测干预前后HHIP基因mRNA的差异。2.2.1.4BSP法常规抽提干预前后AGS细胞株DNA，亚硫酸盐处理后，予BSP法检测干预前后HHIP启动子区CpG岛每个位点甲基化状态变化。2.2.1.5MSP法常规抽提干预前后AGS细胞株DNA，亚硫酸盐处理后，予MSP法检测干预前后HHIP启动子区CpG岛甲基化状态变化。2.2.2构建稳定的HHIP过表达慢病毒载体，转染AGS，进行相关研究2.2.2.1筛选和构建稳定的HHIP过表达慢病毒载体2.2.2.2MSP法常规抽提转染前后AGS细胞株DNA，亚硫酸盐处理后，予MSP法检测干预前后HHIP启动子区CpG岛甲基化状态变化。2.2.2.3研究HHIP过表达对AGS细胞株生长、增殖的影响。3.统计分析采用SPSS16.0统计软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差（x s）表示，计数资料以百分比（%）表示，采用x2检验、t检验、Kaplan-Meier法、Spearman相关分析等，p＜0.05为有统计学差异。研究结果：1.对胃癌组织及癌旁组织的研究1.1.半定量RT-PCR HHIP、Patched基因在人胃癌组织及癌旁组织中均可见表达，HHIP mRNA在胃癌中的表达强度0.8181±0.381，低于癌旁组织中的表达强度1.6033±0.262，而Patched mRNA在胃癌中的表达强度1.7537±1.150，低于癌旁组织中的2.7993±1.458。HHIP、Patched mRNA表达与性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征无明显统计学差异。但Patched mRNA在低分化胃癌中表达明显低于中高分化，HHIP mRNA表达与分化程度未见统计学差异。1.2.免疫组化法HHIP蛋白在胃癌组织中的阳性率为18/60（30%），在癌旁正常组织中的阳性率为36/60（60%），Patched蛋白在胃癌组织中为20/60(33.33%)，癌旁组织中阳性率为48/60(80%)。HHIP、Patched蛋白表达与性别、年龄、TNM分期、分化程度、淋巴结转移等临床病理特征无明显统计学差异。1.3. BSP法60例胃癌组织中表现为HHIP、Patched CpG位点完全甲基化或部分甲基化，而癌旁组织中CpG位点大部分非甲基化，少数甲基化。将HHIP和PatchedmRNA表达与甲基化程度进行Spearman相关分析，发现HHIP和Patched mRNA表达与甲基化程度呈负相关。1.4. MSP法60例胃癌组织中HHIP启动子区CpG岛甲基化有28例，甲基化率达46.67%，而癌旁组织中甲基化率为20%，HHIP基因启动子区CpG岛甲基化率明显高于相应的癌旁组织.1.5.随访通过随访，发现HHIP和Patched阳性表达胃癌患者叁年总生存率优于阴性表达患者，因此HHIP和Patched可作为判断胃癌预后的预测因子。2.对胃癌细胞株AGS的研究2.1.予去甲基化药物5-aza-dc干预AGS细胞株，进行相关研究。2.1.1MTT法5-aza-dc对AGS细胞株增殖的抑制作用随着药物浓度的增加和时间的延长逐渐增加，呈时间和剂量依赖性。2.1.2Annexin V／PI法检测凋亡在一定剂量范围内随着5-aza-dc药物浓度的增加，细胞凋亡率增加。但达到一定浓度后，细胞凋亡率随着药物浓度的增加而下降。2.1.3半定量RT-PCR AGS细胞株在5-aza-dc干预后HHIP基因被激活，表达明显增高。2.1.4BSP法5-aza-dc干预后HHIP基因启动子区CpG位点甲基化明显减少。2.1.5MSP法胃癌细胞株AGS甲基化程度为99.7%±0.67%，经去甲基化干预后，甲基化程度明显下降，甚至表现为无甲基化。2.2构建稳定的HHIP过表达慢病毒载体，转染AGS，进行相关研究2.2.1成功构建稳定的HHIP过表达慢病毒载体。2.2.2MSP法胃癌细胞株AGS甲基化程度为99.67%，过表达慢病毒载体转染后，甲基化程度明显下降，甚至表现为无甲基化。2.2.3HHIP基因过表达后可抑制胃癌细胞株生长、增殖。结论：1、胃癌和癌旁组织中可见HHIP和Patched mRNA和蛋白表达，但在胃癌组织中HHIP和Patched基因低表达。2、HHIP和Patched mRNA和蛋白表达与性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征无关。但Patched mRNA在低分化胃癌中表达明显低于中高分化，HHIP mRNA表达与分化程度未见统计学差异。3、HHIP和Patched可能作为判断胃癌预后的预测因子。4、胃癌组织和胃癌细胞株中均存在HHIP和Patched启动子区CpG岛高甲基化，是胃癌区别于正常胃组织的分子事件，与HHIP和Patched抑癌机制有关，可能与胃癌的发生有关，有可能成为胃癌早期诊断的肿瘤标志物。5、5-aza-dc可以诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，在一定浓度范围呈时间和剂量依赖性。去甲基化药物有可能成为一种胃癌治疗途径。6、HHIP基因过表达后可抑制胃癌细胞株生长、增殖，有可能成为胃癌的新的生物学标记，针对HHIP形成的药靶，有可能成为胃癌治疗的一个新的途径。
姜晓东[10]2009年在《DAPK、E-cadherin和p16基因启动子异常甲基化与胃癌关系的研究》文中提出目的目前关于胃癌发生机制的研究主要集中于分子和细胞生物学水平,包括抑癌基因在内的相关基因的失活在胃癌的发生发展过程中发挥重要作用。基因的失活方式有很多,而启动子CpG岛的异常甲基化受到越来越多的重视。最近的研究证实启动子CpG岛甲基化可能在胃癌发生发展过程中都发挥重要作用,并且是导致抑癌基因失活的重要机制。本实验通过检测肿瘤相关基因启动子CpG岛在胃癌组织、癌旁5cm组织和良性胃黏膜组织中的甲基化水平,探讨这些基因启动子异常甲基化与胃癌发生的关系。方法将标本分组为叁组,分别是胃癌组织、相应癌旁5cm组织各47例,良性胃黏膜组织(浅表胃炎或正常胃粘膜)20例。常规酚/氯仿法抽提组织标本的基因组DNA,经过亚硫氢酸盐处理,采用目前常用的甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)方法检测上述叁组标本中死亡相关蛋白激酶(death-associated protein kinase, DAPK)基因、上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin或CDH1)基因和p16基因启动子CpG岛甲基化的状况并分析每个基因甲基化程度与临床参数之间的关系。结果20例良性胃黏膜组织中只有1例标本的P16基因启动子区CpG发生了甲基化,其它基因均未发生甲基化。47例胃癌组织中DAPK,E-cadherin和p16叁个基因的甲基化发生率分别是:66.0%(31/47)、44.7%(21/47)、63.8%(30/47)。相应47例的癌旁组织中,DAPK、E-cadherin和p16基因的甲基化率分别为:36.2%(17/47)、25.5%(12/47)、12.8%(6/47)。综合这叁个基因的甲基化状况, 87.2%(41/47)的胃癌组织和48.9%(23/47)癌旁组织中有一个或一个以上基因发生了甲基化。癌组织中,含有一个基因甲基化的为12(25.5%)例,含两个基因甲基化的为17(36.2%)例,这叁个基因全都甲基化的为12(25.5%)例。癌旁组织中,叁个基因全部甲基化的有2(4.3%)例,8(17.0%)例标本发生了两个基因甲基化,13(27.7%)例标本发生了一个基因甲基化。叁个基因中DAPK基因和p16基因在胃癌组织中的甲基化率明显高于癌旁组织(p<0.05),且有统计学上的相关性(K值分别为:0.296、0.153,p<0.05)。癌组织的甲基化指数(methylated index,MI)明显高于癌旁组织(t=5.139, p<0.01)。胃癌患者中DAPK基因启动子区的甲基化程度分别与肿瘤分化程度、淋巴结转移和TNM分期具有相关性(p<0.05)。癌组织中E-cadherin基因启动子区甲基化程度与肿瘤的浸润深度、TNM分期以及淋巴结转移相关(p<0.05)。p16基因的甲基化程度与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期等临床资料无统计学相关性。结论胃癌中DAPK、E-cadherin和p16基因启动子区异常甲基化是一种普遍现象,并且DAPK、E-cadherin基因启动子高甲基化与胃癌的临床病理特点有一定的内在联系,提示其可能是引起胃癌发生的重要原因,并且在胃癌的发展过程中起到重要作用。检测多基因甲基化可能为诊断胃癌提供一种新的方法,并可能为改变肿瘤细胞甲基化水平、基因治疗提供有力的理论依据。
参考文献：
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[9]. 胃癌中HHIP、Patched基因的表达及甲基化水平与临床特征的关系[D]. 宋宇. 苏州大学. 2014
[10]. DAPK、E-cadherin和p16基因启动子异常甲基化与胃癌关系的研究[D]. 姜晓东. 安徽医科大学. 2009
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