朱育晓[1]2003年在《药用植物商陆组织培养及其次生代谢产物的研究》文中提出植物是天然药物的重要来源。天然药物具有诸多的优越性，使得人类对其的需求不断增加。然而，由于自然环境的破坏、无计划的采挖和栽培技术等原因，使得—些天然野生药用植物供应困难。化学合成植物药又因其成本、技术、抗药性等因素所限而难以推广。因此，应用生物技术生产天然药物具有重要的经济意义和社会意义。 为了开发中药商陆的新药源，本实验以栽培商陆的根、茎、叶等不同的器官为外植体，诱导愈伤组织形成，并经悬浮培养和平板培养获得了单细胞无性系与高产细胞株。同时研究了培养条件(光照、培养温度、外源激素等)对愈伤组织诱导和生长、细胞悬浮培养以及单细胞平板培养的影响，筛选出适宜的培养条件。 薄层层析鉴定表明：商陆组织培养物中含有原植株中所含的所有重要药用成分(皂苷、甾醇、生物碱、组胺等)，并且根愈伤组织中皂苷的含量高于原植株，毒性成分组胺的含量比原植株低。 商陆茎和果实中含有一种红色天然色素。本实验建立了商陆色素生物合成的培养系统，并通过直接观察单细胞无性系的颜色，筛选出了该色素的高产细胞株；测定了色素的性质及各种因素对色素稳定性的影响。 生物碱是商陆利尿活性的主要成分。通过高产细胞株的筛选，使愈伤组织中生物碱的含量提高了2倍。系统分离和薄层层析鉴定结果显示，商陆总生物碱中至少含有5种生物碱，其中弱碱性生物碱1种，中性、强碱性生物碱3种，水溶性生物碱1种。
王渭玲[2]2008年在《膜荚黄芪营养特性及次生代谢调控的研究》文中研究指明膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch．)为豆科紫云英属多年生草本植物，以根入药，为传统的大宗药材。随着对黄芪药理作用及保健作用认识的不断深入，黄芪除供药用外，还广泛用于饮料、补品、化妆品、茶等工业生产中，市场需求用量逐年增加。人工栽培黄芪已成为主要的药材来源途径，但由于对黄芪矿质营养理论方面缺乏研究，黄芪的施肥技术尚无系统的资料，导致栽培黄芪的产量和质量偏低，严重制约了黄芪产业的发展。本论文采用田间试验和毛状根培养试验，系统研究了膜荚黄芪矿质营养特性、优化施肥模式、不同营养元素条件下黄芪多糖及黄芪皂苷的积累动态变化、毛状根培养系统的建立及毛状根的生长及次生代谢的调控。这些研究结果不仅具有重要的科学意义，也将为黄芪高产优质人工栽培技术的建立、对保护野生黄芪资源、对减轻生态环境破坏、实现中药现代化和中药国际化具有重要意义。主要研究结果如下：1．膜荚黄芪干物质累积规律通过对黄芪干物质累积动态分析，得出黄芪干物质累积的Logistic方程为：W_1=(33170)/((1+298126e)~(-0.1087x))，R~2=-0．9939~(**)，相关性达到极显着水平，因此可用此模型计算黄芪生长期间的干物质积累量。黄芪植株不同部位干物质累积与分配随生长季节而变化，出苗后100～132d是地上部分干物质积累最快的时期，占总积累量的88．22％；根系干物质累积晚于地上部分，出现在出苗后163d～185d。全株干物质的累积率在出苗后100～132d，快速增加，是植株干物质累积最快的时期，主要是茎叶干物质组分。出苗后132～163d，全株干物质累积量最多，主要是根部干物质组分。2．黄芪植株N、P、K、Fe、Mn、Zn、Cu的吸收、分配特性与最大效率期黄芪植株对NPK的吸收量为N＞K＞P。不同部位的含量为茎叶＞根系。N、P、K含量苗期最高，随生育进程而下降。不同生育时期黄芪的养分积累状况是不均衡的，整株养分的积累量前期少，中期增加迅速，后期缓慢增加。地上N、P、K的积累量从苗期持续增加到出苗后163d左右达到高峰后，随后积累量增加缓慢。根系中N、P、K的积累量一直呈上升趋势，到收获期达到最大值。各个生育时期的地上部分和根系中，N的积累量最大，K次之，P最小。临界期和最大效率期以养分相对积累速率(RARN，g·g~(-1)·d~(-1))分析养分累积高峰期，N、P的最大相对积累强度在100d左右，K的最大相对强度在100～132d之间。出苗后70～100d是N、P、K营养临界期；出苗后100～132d，N、P、K相对吸收强度基本都维持在最高值，是黄芪N、P、K养分最大效率期。黄芪植株Fe、Zn、Cu、和Mn的吸收与累积特性为：Fe、Mn、Zn、Cu元素的含量呈前期逐渐增加后期逐渐下降的趋势。黄芪根系中元素含量为Fe＞Zn＞Cu＞Mn。植株中元素的累积量均为Fe＞Zn＞Mn＞Cu。3．N、P、K对黄芪生长及次生代谢物累积的影响与优化施肥模式研究黄芪的生长及产量形成因子明显受N、P、K肥的供应水平所影响，影响程度由大到小依次为NPK配合＞单施N＞单施K＞单施P。N、P、K各元素及其配比明显影响了黄芪多糖、黄酮和总皂苷的累积，P、K促进了黄芪多糖、黄酮的累积，N、K促进了总皂苷的累积。对黄芪的需肥特性研究表明，黄芪根系中不同元素吸收积累总量顺序为：N＞K＞P＞Fe＞Zn＞Mn＞Cu。每生产100kg黄芪药材需要从土壤和肥料中吸收2．32kgN；0．323kg P_2O_5；1．62kg K_2O；37．77gFe；2．24g Zn；0．66g Mn；0．65gCu。N：P_2O_5：K_2O为7．18：1：5．02。建立了黄芪产量、黄芪根总皂苷与N、P、K叁因素的回归模型，采用频率分析法对模型寻优，目标产量为6300～7300 kg／hm~2及目标总皂苷含量为12．0～13．5mg／g时，优化施肥方案为N138～156Kg／hm~2，P_2O_579～85 Kg／hm~2，K_2O122～43Kg／hm~2，配比为1：0．5：0．87。4．黄芪毛状根培养体系的建立及次生代谢的调控用发根农杆菌R1601感染，以下胚轴作为的外植体，菌液A600 nm为0．55～0．60，侵染时间15min，外植体与发根农杆菌共培养3 d，MS培养基附加NAA 0．5mg／L，IBA0．2mg／L及以羧苄青霉素为除菌剂。黄芪毛状根生长可分为延迟期(0～5 d)、恒速生长期(5～25d)和衰亡期(25～40 d)。培养25d毛状根的生长量到达最大值。恒速生长期中毛状根干重的平均增长速率符合方程：(dx)/(dt)=(3．37g)/(F．d) R~2=0．841~(**)相关性达极显着水平。IAA、IBA及NAA在0．1-0．5mg／L浓度范围时促进毛状根生长；2．4-D浓度时抑制黄芪毛状根生长。IAA和NA A促进黄芪毛状根多糖和总皂苷的累积，IBA和2．4-D对黄芪毛状根多糖和总皂苷的积累有负作用。茉莉酸甲酯和水杨酸对黄芪毛状根生长及多糖和总皂苷累积具有促进作用。
毕晓秀[3]2008年在《紫锥菊毛状根培养体系的建立及次生代谢产物研究》文中认为紫锥菊(Echinacea purpurea(L)Monench)是菊科(Compositae)松果属植物,原产北美州,为北美传统草药,主要含有多糖、总酚和烷基酰胺等药用成分。紫锥菊药物具有增强人体免疫力的功效,可以消炎,杀死病毒和细菌,为近年来欧洲和北美最流行的免疫制剂。紫锥菊药物的研究开发在我国将有广阔的市场前景。该属植物共有8个种及数个变种,均为多年生草本,头状花序单生于茎或枝项,其主要特征是花托为圆锥形,具有管状花和舌状花,通常为玫瑰色或紫色。紫锥菊具有抗炎、抗菌和调节机体免疫力功能具有显着的药理作用和极高的药用价值。利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)诱导药用植物产生的毛状根,无论在生物量的增加,药用有效成分积累还是生产稳定性方面,都显示了独特的优越性,使得毛状根培养成为获得药用次生代谢物的又一重要途径。因此,本文从紫锥菊毛状根培养体系的建立及次生代谢产物的积累的影响,对药用植物紫锥菊毛状根进行了研究。本文利用A4、R1601、1025叁种发根农杆菌诱导紫锥菊的遗传转化,建立紫锥菊毛状根诱导体系。紫锥菊外植体被A4、R1601、1025叁种发根农杆菌感染后,30d后,外植体伤口处陆续分化生长出白色的毛状根,毛状根密集生长、分枝多,且向上生长。A4菌株的诱导效果明显好于其他两种菌株,A4对紫锥菊叶片的毛状根诱导率高达66.7%。同时对毛状根诱导的几个影响因素进行实验研究,实验结果表明,紫锥菊毛状根的最佳诱导条件为:发根农杆菌A4,感染时间12min,菌液OD600值0.8,共培养温度24℃,共培养时间2 d,预培养时间2 d,AS浓度50μmol/L,培养基pH值6.0,此条件下紫锥菊毛状根的平均诱导率达到54%;对诱导出的毛状根进行PCR检测,证实其确为已转化的毛状根。初步分析了紫锥菊毛状根中次生代谢产物的含量,将紫锥菊毛状根大量培养后,分离并分析其中次生代谢产物多糖和总酚的含量,利用超声波提取毛状根中的有效成分,检测得到紫锥菊毛状根中的多糖含量为15.54%,总酚的含量为2.491%。
李琰[4]2008年在《雷公藤组织培养生产次生代谢产物及其代谢调控研究》文中认为雷公藤是一种重要的杀虫植物和传统的中药材,近年来在医用和农用无公害新型杀虫剂等方面的需求不断增加,使野生雷公藤资源盲目的开采利用而急剧减少。为保护雷公藤自然资源,维护生态环境,实现雷公藤资源可持续利用发展和满足人们的需求,通过组织培养的方式来生产雷公藤的有用次生代谢产物,具有重要的实际应用价值。本研究以雷公藤一年生枝条扦插形成的根、茎、叶为外植体诱导愈伤组织,经多次继代培养后选择疏松型愈伤组织建立悬浮细胞系和不定根培养体系,探讨外植体、培养基各种成分、培养条件、前体物质、诱导子等对悬浮细胞、不定根的生长和雷公藤内酯醇及生物碱含量的影响。主要研究结果如下:1.雷公藤愈伤组织诱导及培养条件优化雷公藤的外植体种类、基本培养基类型、激素浓度及组合对愈伤组织诱导有显着的影响。根、茎、叶3种外植体均可诱导出愈伤组织,6种基本培养基中MS诱导率最高;单独添加2,4-D时以1.0 mg/L诱导率最高,为47.37%;单独添加NAA时以2.0 mg/L诱导率最高,为36.32%,生长素与细胞分裂素KT或6-BA的配合使用时明显提高出愈率,最佳培养基及激素组合为MS+1.0 mg/L 2,4-D +0.5~1.0 mg/L KT,愈伤组织诱导在90%以上。以3种不同来源的愈伤组织进行继代培养,研究愈伤组织生长与内酯醇及生物碱积累的关系,探讨基本培养基类型、激素浓度及组合、预防褐变等对愈伤组织生长及对内酯醇和生物碱含量的影响。结果表明,在连续继代多次后,根愈伤组织逐渐变的疏松、颗粒状,而茎、叶愈伤组织致密、呈块状,褐化严重。根愈伤组织增长量、内酯醇含量也明显高于茎、叶愈伤组织,而叶愈伤组织中生物碱的含量明显高于根、茎愈伤组织中的含量;7种基本培养基中6,7-V的愈伤组织增长量最大,White培养基有利于内酯醇和生物碱的积累,但愈伤组织增长量较低;不同浓度2,4-D、NAA及与KT、6-BA组合表明,1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT明显促进愈伤组织生长和生物碱的形成,而4.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于愈伤组织中内酯醇的合成;培养基中加入5~10 mg/LAgNO3,不仅能明显抑制愈伤组织褐变,也明显提高内酯醇含量。暗光培养的愈伤组织增长量、内酯醇及总生物碱含量均较高,且褐化程度较轻。培养到第50天愈伤组织增长量达到最大值,第55天时内酯醇含量达到最大值,生物碱含量随着培养时间的延长而升高。2.雷公藤悬浮培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响以根愈伤组织建立了悬浮系,研究基本培养基类型、继代时间、接种密度、pH值和添加7种氨基酸、10种非生物诱导子和7种前体物质对细胞的生长和内酯醇和生物碱含量的影响。悬浮细胞在NT培养基的增长量最高,MS适合进一步继代培养,在White培养基上内酯醇和总生物碱的含量最高;最佳接种密度为8~12 g/L,最适继代时间为30~35 d,培养55天时收获细胞。培养液pH值为5.8时,细胞增长量最大,内酯醇在pH值为6.4时最高,pH值为5.2时总生物碱最高。培养基中天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸和丝氨酸的加入明显抑制雷公藤细胞的生长,且浓度越大抑制作用越强;加入苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等在低浓度时能促进细胞的生长。7种氨基酸均能不同程度的促进内酯醇的合成,其中精氨酸1mmol/L和半胱氨酸2 mmol/L时,内酯醇含量较对照提高了3.2倍和2.8倍。除半胱氨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他氨基酸的加入对雷公藤生物碱的合成均起不同程度的促进作用,其中蛋氨酸0.5 mmol/L时,雷公藤不仅生物碱含量较对照提高了1.5倍,内酯醇含量也较对照提高了2.3倍。非生物诱导子中,大豆蛋白、水杨酸、水解酪蛋白、谷氨酰胺、酸水解干酪素和甲醛抑制细胞的生长,矮壮素、乙酸钠、酵母提取物和苯甲酸钠在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除酸水解干酪素抑制内酯醇的合成以外,其他均对内酯醇的合成起促进作用,其中谷氨酰胺2 mmol/L和大豆蛋白1 g/L时,内酯醇含量较对照提高了2.4倍和2.9倍。除水杨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他诱导子的加入对雷公藤生物碱的合成均起促进作用,其中酵母提取物2 g/L时,雷公藤生物碱含量较对照提高了1.3倍。甲醛浓度为1.0 mL/L时,虽然细胞增长量仅为对照的77%,但内酯醇含量为对照的2倍,总生物碱含量为对照的1.2倍。前体物质中,除桂皮酸对雷公藤细胞的生长起抑制作用外,其他前体物质在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除丙二酸抑制内酯醇的合成以外,其他前体物均对内酯醇的合成起促进作用,其中桂皮酸10 mg/L时,较对照提高了2倍;异戊二烯10 mL/L内酯醇为对照的2.5倍,总生物碱含量为对照的1.5倍,而细胞的增长量下降并不明显,为对照的96%。柠檬酸、桂皮酸和丙酮酸对雷公藤生物碱的合成起抑制作用,丙二酸、苹果酸和酒石酸在低浓度时对雷公藤生物碱的合成起促进作用,其中丙二酸浓度为2.0 mmol/L细胞内总生物碱含量为对照的2倍。3.雷公藤不定根培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响以悬浮细胞诱导不定根,建立不定根摇瓶培养体系,研究培养液中营养元素的消耗规律,探讨大量元素、微量元素、碳源及有机物和生物诱导子等对不定根生长和内酯醇及生物碱含量的影响。在悬浮细胞中,加入4.0 mg/L NAA,可诱导产生不定根,经过多代培养,形成了稳定的雷公藤不定根培养体系,检测不定根中内酯醇含量为悬浮细胞的2.1倍,为根皮粉中的4.5倍。经对NT培养基中大量元素的消耗动态研究,不定根进入快速生长期后,氮、磷、钾元素含量明显不足导致生长进入停滞期;当NO3-/NH4+与NT培养基一致并维持不变时,随着培养基中氮浓度的提高,雷公藤不定根增长量急剧上升,当总氮浓度为50 mmol/L时,增长量达到最大值。当总氮浓度为30 mmol/L时,内酯醇和总生物碱含量达最大值。在NO3-/NH4+为9︰1时,不定根增长量最大,内酯醇含量与NT培养基氮源比例基本一致时最高;只有铵态氮的情况下,不定根中总生物碱的含量为最高。不定根增长量随着PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度的升高而升高;内酯醇含量在K+浓度为NT培养基的1.3倍时,Ca~(2+)浓度为NT培养基的2/3时,达到最大值,内酯醇含量随着PO43-浓度的升高而升高,NT培养基中Mg~(2+)浓度即可使内酯醇含量达到最大值;NT培养基中PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度即可使总生物碱含量达到最大值。微量元素中,NT培养基中Fe~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)即可满足雷公藤不定根的生长,2倍Mn~(2+)浓度可使雷公藤不定根的生长量达最大值,在试验范围内,Na2MoO4浓度越高不定根增长量越高,培养基中缺乏H3BO3、KI和CoCI2不影响雷公藤不定根的生长;Fe~(2+)浓度为正常标准的1/3时,内酯醇和总生物碱的积累达到最大值;在试验范围内内酯醇和总生物碱的含量随Mn~(2+)浓度的升高而升高;Zn~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇的积累达到最大值,而生物碱的积累在该试验范围内随着Zn~(2+)盐浓度的升高而升高;Cu~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇和生物碱的积累达到最大值;H3BO3的加入对内酯醇及总生物碱的合成起抑制作用,浓度越高抑制作用越强;培养基中缺乏KI时不影响生物碱的合成,内酯醇的含量随着KI浓度的升高而升高;培养基中缺乏CoCI2并不影响内酯醇的合成,在NT培养基正常标准的2倍时,生物碱的含量最高;培养基中缺乏Na2MoO4有利于不定根中内酯醇和生物碱的合成,不定根中内酯醇和生物碱的含量随着钼酸钠浓度的升高而降低。碳源中,适合不定根生长、内酯醇形成的碳源为蔗糖,适合生物碱积累的碳源为葡萄糖;适合雷公藤不定根生长的蔗糖浓度为45 g/L,不定根中内酯醇和生物碱含量在蔗糖浓度为20 g/L时最高。7种有机物中,NT培养基中的正常标准的肌醇和VB1,即可使雷公藤不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。加入0.5 mg/L的烟酸可使内酯醇的含量达到最大值,但烟酸的加入对不定根中生物碱的合成明显的抑制作用,且浓度越高抑制作用越强。当VB6浓度为1mg/L,不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。在试验范围内,不定根增长量、内酯醇含量随着甘氨酸浓度的增加而升高,生物碱含量在甘氨酸浓度为1 mg/L时,达到最大值。叶酸和生物素的加入并不影响雷公藤不定根的生长,但在叶酸浓度为1 mg/L时,可使内酯醇及生物碱的含量达到最大值。生物素在0.5 mg/L时,内酯醇含量达到最大值,在1 mg/L时,生物碱的含量达到最大值。采用7种生物诱导子分别处理雷公藤不定根,均能促进不定根中内酯醇和生物碱的合成,并且对不定根的生长均没有明显影响,其中链霉菌和苹果炭疽病菌效果最好。经苹果炭疽病菌处理的雷公藤不定根中内酯醇的含量达88.65μg/gDW,为对照(39.62μg/gDW)的2.2倍,生物碱含量达6.09 mg/g DW,为对照(3.02 mg/gDW)的2倍。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及不定根的生长状态有关。对苹果炭疽病菌来说,诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖100μg/mL;不定根在对数生长末期对诱导作用最敏感;在加入诱导子15 d后收获不定根,不定根中的内酯醇含量最高,而生物碱含量随诱导子作用时间的延长而提高。在不同体积的叁角瓶中,按叁角瓶体积的2/5加入培养液,随着叁角瓶体积的增大,雷公藤不定根增长量略有下降, 1 L和5 L的叁角瓶中不定根增长量分别下降2.92%和6.57%,而不定根和培养液中的内酯醇及生物碱含量差异不明显。内酯醇和生物碱均为分泌型,在过滤不定根后的培养液中内酯醇占每瓶内酯醇总量的56%,总生物碱占每瓶总量的65%。4.雷公藤组培产物有效成分含量测定及杀虫活性研究建立了在同一提取物中同时测定雷公藤内酯醇和总生物碱的方法。内酯醇的检测范围为1~100μg/ mL,(R2= 0.9999);雷公藤总生物碱在5-100μg/ mL范围内线性关系较好(R2= 0.9998);在同一提取液中,雷公藤内酯醇和总生物碱的加样回收率分别为100.72%(RSD=0.975%)、100.33%(RSD=2.56%)。不同组织培养产物提取液对3龄小菜蛾的生长均有明显的抑制和毒杀作用,其中不定根培养物提取物处理后每天的小菜蛾体重增加量均成了负值,72 h后70%左右已经死亡,存活的试虫体重比试验前下降了18.33%。5.雷公藤再生体系建立及组培快繁研究以雷公藤胚性愈伤组织为材料,研究了体细胞胚的发生过程和植株再生、芽苗增殖的影响因素。组织学观察表明,雷公藤体细胞胚起源于愈伤组织内部的单细胞,发育历程与合子胚相似。在愈伤组织再生中,NAA较2,4-D效果好, 6-BA优于KT,NAA与6-BA配合使用明显提高再生率。6种培养基中,MS和B5的愈伤组织再生率达100%,在0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的MS培养基上,不仅愈伤组织再生率达100%,而且每块愈伤组织平均形成芽数也比较多。胚性愈伤组织在继代培养过程中,植株再生率和愈伤组织分化形成的小苗数,经历了一个由低到高再到低的过程。以继代八个月到一年之间的胚性愈伤组织的再生能力最强,达100%。雷公藤胚性愈伤组织在继代20个月后已经丧失分化能力。再生苗茎段增殖以1/2MS+2.0 mg/L IBA为好,生根培养以1/2MS+2.0 mg/L IBA+0.5 g/L活性炭较好,生根率达100%。移栽至珍珠岩与腐殖质土(1︰1)的混合基质中成活率达96%。
于海娣[5]2012年在《木豆毛状根培养体系的建立及相关生理生化研究》文中研究指明由发根农杆菌诱导出来的毛状根具有快速生长,多分枝,无向地性以及遗传性能相对稳定的优点,其新陈代谢能力非常活跃,而且具有与原植物相似的次生代谢途径。因此,毛状根不仅能够合成与原植物相同的化合物,而且可能积累这些化合物的中间产物和衍生物,含量与原植株相当甚至高于原植株含量,甚至会产生新的化合物。在药用植物研究领域,利用发根农杆菌诱导和培养毛状根的方式提取药物的有效成分,已成为一个研究的热点。本文以发根农杆菌LBA9402和木豆叶片为材料,经过预培养、浸染、共培养、除菌等步骤,最后扩大培养得到木豆毛状根的培养体系。以此为基础,测定木豆毛状根悬浮培养的生长动态、保护酶(CAT、 POD、SOD)活性、可溶性蛋白含量的变化的趋势以及次生代谢物芹菜素、染料木素合成的动态变化。探讨了紫外照射、钙离子、IBA叁种诱导因素对木豆毛状根生理生化指标的影响,为提高木豆毛状根悬浮培养生长率及其中次生代谢物含量提供依据。主要研究结果如下：1.木豆毛状根培养体系的建立利用发根农杆菌LBA9402浸染木豆叶片得到木豆毛状根,从实验中得到诱导木豆毛状根的最佳条件是：预培养2-4天,在浓度为OD600=0.6-0.8的菌液中浸染20min,吸干叶片表面菌液,转入无激素培养基中共培养3天,得到木豆叶片毛状根的转化率为60.00%,乙酰丁香酮能够促进发根农杆菌的转化,提高木豆叶片毛状根的诱导率。经PCR检测,得到特异性条带,说明发根农杆菌的T-DNA成功整合进毛状根的基因组中。实验还证明,N6液体培养基、30g/L的蔗糖以及外源激素IBA都可以促进木豆毛状根的生长。2.木豆毛状根生长周期中生理生化指标的研究木豆毛状根的生长率与培养基中蔗糖含量存在良好的线性关系,成反比；其生长经历了延迟期、快速生长期以及生长平缓期；叁种保护酶的活性总体来说是先上升后下降的趋势,而可溶性蛋白的含量则呈一直增加；芹菜素与染料木素的含量都随着时间的延长不断增加,到生长周期趋于平缓,木豆毛状根的生长代谢周期为20天。3.影响因素对木豆毛状根生理生化指标的影响紫外照射20min、1mmol/L钙离子浓度以及0.5mg/L的IBA浓度促进木豆毛状根生长的效果最显着。当IBA浓度是0.5mg/L时,保护酶活性达到最大,最有利于芹菜素和染料木素的积累。紫外照射会抑制POD和SOD的活性,钙离子处理下的POD和SOD酶活性的变化趋势与其生长率的变化趋势相一致,而CAT酶的变化则缺少规律性。可溶性蛋白含量变化不显着。
黄伟剑[6]2015年在《广藿香毛状根培养及细胞悬浮系建系的研究》文中研究表明广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]为唇形科刺蕊草属植物,以干燥地上部分入药,其性辛、微温,为常用的传统中药,同时也是“十大广药”之一。本研究以广藿香叶片为外植体,诱导广藿香无菌苗,并以广藿香无菌苗为实验材料,对发根农杆菌诱导广藿香毛状根以及广藿香细胞悬浮培养进行研究,主要研究结果如下:(1)广藿香毛状根的诱导及鉴别本研究以发根农杆菌ATCC15834及C58C1侵染广藿香无菌苗叶片外植体,分别研究发根农杆菌侵染的最佳时间、乙酰丁香酮浓度、预培养时间、侵染时间、共培养时间对广藿香毛状根诱导率的影响,并利用PCR技术对所诱导的毛状根进行鉴别。研究表明,发根农杆菌ATCC15834在140 r/min、28℃、黑暗条件下振荡培养18 h;发根农杆菌C58C1在同样条件下振荡培养19h,OD600值均为0.6,可用于侵染外植体。广藿香毛状根诱导的最佳条件为:预培养时间2 d,乙酰丁香酮质量浓度15 mg/L,侵染时间25 min,共培养时间2 d,发根农杆菌ATCC15834和C58C1诱导率均达到最高,分别为83.3%和80.5%。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根的基因组中整合及表达,广藿香毛状根被成功诱导。(2)广藿香毛状根植株再生及鉴别本研究利用“两步法”,研究在不同激素配比以及不同培养条件下对广藿香毛状根诱导愈伤组织的影响。研究表明,诱导广藿香毛状根再生植株的最佳条件为:在光照14h/d,25±2℃,MS+6-BA(2.0 mg/L)+NAA(0.1 mg/L)培养基中诱导愈伤组织,30d后诱导率为100%;在MS+NAA(0.1 mg/L)+6-BA(0.1 mg/L)培养基中诱导芽分化,35d后诱导率为100%;在1/2MS培养基中生根培养,20d后生根率为100%。PCR扩增结果证实,发根农杆菌Ri质粒的T-DNA部分已在广藿香毛状根再生植株的基因组中整合及表达。(3)广藿香疏松愈伤组织诱导本研究以MS培养基为基础,研究在不同激素配比以及培养条件下对诱导广藿香疏松愈伤组织的影响。研究表明,在光照14h/d,25±2℃,MS+2,4-D(0.05mg/L)+KT(0.5 mg/L)培养基,愈伤组织诱导率最高,为87.5%,多次继代后可获得白色或黄白色疏松愈伤组织。(4)广藿香悬浮细胞培养体系建立及百秋李醇含量测定分别研究光照、转速、接种量、温度、碳源对广藿香悬浮细胞生长的影响,建立悬浮细胞培养体系;研究SA和MJ对广藿香悬浮细胞生长以及百秋李醇含量的影响。研究表明,广藿香悬浮细胞生长曲线呈S型,9-15d为对数期,24d为一个生长周期;广藿香悬浮细胞培养体系最佳条件为:光照24h/d,转速135r/min,接种量7g/100ml,温度25±2℃,碳源为蔗糖30g/L,振荡培养18d,广藿香悬浮细胞FW为529.8795 g/L。SA浓度为1 mg/L时,对广藿香悬浮细胞生长具有促进作用,FW为546.1853 g/L,DW为16.1237g/L;各浓度的MJ对广藿香悬浮细胞生长均具有抑制的作用。各浓度的SA与MJ均对广藿香悬浮细胞百秋李醇含量具有促进作用,SA浓度为20mg/L时,广藿香悬浮细胞中百秋李醇含量最高,为0.0976mg/g,是空白对照的2.69倍;MJ浓度为50mg/L时,广藿香悬浮细胞中百秋李醇含量最高,为0.0638mg/g,是空白对照的1.76倍。
杨慧洁, 闻玉莉, 杨世海[7]2010年在《不同因子对药用植物毛状根次生代谢产物积累的影响》文中指出毛状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术[1]。近年来,毛状根培养已广泛应用于植物次生代谢产物生产、品种改良和特种植物栽培等领域[2]。相对于常规细胞培养和组织培养,毛状根培养系统具有生长快速、不需外源植物激素、合成次生代谢物质能力强而且稳定,并能向培养液释放部分代谢产物等优点,通过改变培养条件,毛状根甚至可以合成比原植物中高出数倍的活性物质,以及原来植物所不含有的活性成分[3]。
高帅[8]2012年在《金铁锁毛状根优良细胞株系的筛选及培养体系的优化》文中提出金铁锁(Psammosilene tunicoides W.C.Wu et C.Y.Wu)为我国特有的濒危药用植物,具有镇痛、抗炎、止血,免疫调节等作用。由于人们长期过度破坏性采集,金铁锁居群生存受到威胁,资源日益减少,现已作为稀有濒危物种列入《中国植物红皮书》。另外,由于金铁锁的生长期长,自然更新率低,野生资源不能立即恢复,所以必须寻找新的药源以缓解药材供应紧张的局势。毛状根培养体系是一种非常有潜力的生产次生代谢物的生物技术,毛状根培养系统具有生长快速及合成次生代谢物质能力强而且稳定的特点。本试验从金铁锁毛状根的诱导、高产细胞株系筛选及培养叁个方面,对金铁锁毛状根的相关内容进行了研究,以期建立高效培养体系,为进一步的大规模的培养及产业化奠定基础。具体试验方法及结论如下：1金铁锁毛状根的诱导本试验利用发根农杆菌ATCC15834,通过对外植体的类型、预培养时间、共培养时间、菌液的浓度、浸染时间、乙酰丁香酮(AS)的浓度等方面,分析了金铁锁毛状根的最佳诱导条件,并对所得到的金铁锁毛状根进行遗传转化鉴定。研究表明,金铁锁被发根农杆菌ATCC15834感染后,10d后,外植体伤口处陆续分化生长出白色的毛状根,毛状根多分枝、多根毛及无向地性。金铁锁毛状根的最佳诱导条件是：预培养时间为2d,共培养时间为2d,菌液的OD600值为0.8,浸染时间为10min,AS浓度为10mg/L,在MS培养基上培养20d后,其平均诱导率为76.7%；对诱导出的毛状根进行遗传转化鉴定,PCR扩增证实发根农杆菌Ri质粒的rol基因已在金铁锁毛状根中整合和表达。2优良金铁锁毛状根细胞株系的筛选本试验对所得到的36个金铁锁毛状根株系进行筛选,培养30d,通过测定其生物量及总皂苷含量,确定最佳毛状根细胞株系。研究结果表明,A-33细胞株系其生物量最高,为0.673g(DW),总皂苷含量为0.64%；而A-23无性系其总皂苷含量最高,为0.68%,生物量为0.513g(DW)。从获得总皂苷的产量看,A-33细胞株系的总皂苷产量最高,故为最优良细胞株系。3金铁锁毛状根培养体系的优化本试验对所得到的优良毛状根细胞株系进一步的进行培养条件的优化,通过对培养基类型、碳源的类型及浓度、氮源的种类、外源激素的类型及浓度、诱导子的类型及浓度、新鲜培养的加入等方面,分析了对金铁锁毛状根产量的影响。研究表明,金铁锁毛状根在1／2MS液体培养基中,有利于总皂苷的积累,总皂苷含量为0.69%,干重为0.601g；蔗糖更加有利于其生物量及总皂苷的积累,3%蔗糖有利于总皂苷的积累,总皂苷的含量为0.69%,干重为0.606g；水解乳蛋白有利于毛状根生物量及总皂苷的积累,培养在添加有500mg／L的水解乳蛋白的毛状根其生物量及总皂苷含量分别较对照培养提高了23.0%及38.6%,而培养在添加有蛋白胨的毛状根,其生物量及总皂苷都较对照低；添加0.5mg／L酵母浸粉,对金铁锁毛状根的生长影响不明显,添加Ca2+及C02+抑制金铁锁毛状根的生长,但促进总皂苷的积累,培养在添加3mM Ca2+及100μM Co2+的毛状根,其总皂苷含量分别较对照提高33.8%及29.6%；金铁锁毛状根在20d时,加入新鲜培养基继续培养20d,其干重有明显的增加,较20d时提高31.6%,但对总皂苷的积累影响不明显。
王海涛[9]2014年在《麻花艽（Gentiana straminea）和大叶秦艽（Gentiana macrophylla）细胞培养研究》文中进行了进一步梳理麻花艽（Gentiana straminea Maxim）和大叶秦艽（Gentiana macrophylla Pall）属龙胆科龙胆属，为多年生草本植物，是我国传统常用中药材。其以根和花入药，多产于西藏、青海、陕西、甘肃、四川等地。近年来，由于临床用药量的增加和过度采挖，致使麻花艽和大叶秦艽野生资源日趋减少。因此，开展麻花艽和大叶秦艽的细胞工程研究则显得尤为重要。为此，本研究以麻花艽和大叶秦艽为试验材料，从愈伤组织和悬浮细胞两个方面开展这两种植物的细胞培养研究，并研究细胞培养过程中龙胆苦苷含量的变化，旨在为通过细胞培养来生产次生代谢产物奠定技术基础。主要研究结果如下：1.以麻花艽无菌苗叶片为外植体，以MS为基本培养基，附加2.0mg·L-12,4-D和0.5mg·L-16-BA，添加0.85%的琼脂，适于愈伤组织的诱导，其最高诱导率为90.6%。2.以大叶秦艽无菌苗叶片为外植体，以MS为基本培养基，附加1.5mg·L-12,4-D和0.5mg·L-16-BA，添加0.85%的琼脂，适于愈伤组织的诱导，其最高诱导率为87.7%。3.开展了麻花艽愈伤组织培养的研究。麻花艽愈伤组织的生长曲线呈“S”型，生长周期为33d，可分为4个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期；每一时期的细胞分裂指数分别为22.18%、54.23%、67.55%和26.97%，各时期对应的龙胆苦苷含量分别为7.92、15.01、25.02和14.04mg·g-1DW。龙胆苦苷的积累与愈伤组织的增殖呈同步趋势，在稳定期达到最大值。4.开展了大叶秦艽愈伤组织培养的研究。大叶秦艽愈伤组织的生长曲线呈“S”型，生长周期为33d，可分为4个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期；每一时期的细胞分裂指数分别为25.54%、47.09%、63.56%和34.15%，各时期对应的龙胆苦苷含量分别为11.80、16.38、22.49和8.79mg·g-1DW。龙胆苦苷的积累与愈伤组织的增殖呈同步趋势，在稳定期达到最大值。5.对麻花艽和大叶秦艽不同生长时期愈伤组织细胞的形态结构进行了观察。延滞期细胞较小，近球形；对数生长期细胞近等边形，胞质浓厚，细胞分裂旺盛；稳定期细胞开始变长；衰退期细胞基本呈长条形。随着细胞的生长，质体逐渐发育成熟，到了衰退期，质体开始解体。6.通过对初始接种量、蔗糖浓度、摇床转速、温度、基本培养基及诱导子的优化，开展了麻花艽的细胞悬浮培养研究。以MS为基本培养基、初始接种量为30g·L-1、蔗糖浓度3%、摇床转速110r·min-1、温度22℃以及加入100mg·L-1的酵母膏或5g·L-1的果糖，有利于麻花艽悬浮细胞的生长及龙胆苦苷的合成。7.通过对初始接种量、蔗糖浓度、摇床转速、温度、基本培养基及诱导子的优化，开展了大叶秦艽的细胞悬浮培养研究。以MS为基本培养基、初始接种量为20g·L-1、蔗糖浓度3.5%、摇床转速110r·min-1、温度22℃以及加入100mg·L-1的水解酪蛋白或5g·L-1的果糖，有利于大叶秦艽悬浮细胞的生长及龙胆苦苷的合成。8.在麻花艽细胞悬浮培养的最优条件下，研究了细胞悬浮培养过程中龙胆苦苷含量的变化。麻花艽悬浮细胞的生长曲线呈“S”型，生长周期为30d，可分为4个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。各时期细胞内龙胆苦苷含量分别为16.53、20.14、23.86和14.63mg·g-1DW，释放到培养液中龙胆苦苷含量分别为5.22、7.97、9.11、11.10mg·g-1DW，稳定期最大，为32.97mg·g-1DW，大于愈伤组织中龙胆苦苷的含量；龙胆苦苷的增长趋势与麻花艽细胞悬浮培养的生长曲线一致。9.在大叶秦艽细胞悬浮培养的最优条件下，研究了细胞悬浮培养过程中龙胆苦苷含量的变化。大叶秦艽悬浮细胞的生长曲线呈“S”型，生长周期为30d，可分为4个时期，即延滞期、对数生长期、稳定期和衰退期。各时期细胞内龙胆苦苷含量分别为8.69、18.82、23.22和11.44mg·g-1DW，释放到培养液中龙胆苦苷含量分别为5.92、6.81、7.82、8.94mg·g-1DW，稳定期最大，为31.04mg·g-1DW，大于愈伤组织中龙胆苦苷的含量；龙胆苦苷的增长趋势与大叶秦艽细胞悬浮培养的生长曲线一致。
徐大卫[10]2012年在《不同因子对圆叶牵牛毛状根的生长及次生代谢产物的影响》文中研究说明圆叶牵牛(Pharbitis purpurea (L.) Voigt)是旋花科一年生草本植物。种子可入药,味苦性寒；有毒。归肺、肾、大肠经。具有泄水通便,消痰涤饮,杀虫攻积的功效。用于水肿胀满,二便不通,痰饮积聚,气逆喘咳,虫积腹痛。本文分别通过增殖倍数法及高效液相色谱法测定圆叶牵牛毛状根的生长状况及其次生代谢产物咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量,从而明确培养基种类、接种量、碳源种类及浓度、培养温度、pH、激素、诱导子等不同因子对圆叶牵牛毛状根的影响。在圆叶牵牛毛状根的培养中发现,培养基的种类,接种量、培养基中的碳源种类及浓度,培养基的pH、培养温度均对圆叶牵牛毛状根的生长及咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量有一定的影响。最适合的培养条件是以1/2MS为液体培养基,其中蔗糖浓度为3%,pH为5.5-6.0,接种量为O.1g,培养温度为27+2℃。在研究激素对圆叶牵牛毛状根的影响时发现,2,4-D、6-BA、NAA、KT、GA3均能不同程度地影响圆叶牵牛毛状根的生长及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的积累,但是生物量的生长和咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量增长倍数并不同步。其中2,4-D明显抑制圆叶牵牛毛状根的生长,高浓度明显促进咖啡酸、咖啡酸乙酯的合成,但咖啡酸,咖啡酸乙酯的总产量逐渐降低；6-BA轻微抑制毛状根的生长,对毛状根的干重及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量没有明显的影响；GA3对毛状根的生长没有显着的作用,低浓度的GA3对毛状根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的合成有一定的促进作用,0.5mg/L时咖啡酸、咖啡酸乙酯含量最高,促进作用最强。当GA3的浓度继续增加时,咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量逐渐下降；NAA、KT对圆叶牵牛毛状根的生长及其咖啡酸、咖啡酸乙酯均有促进作用。NAA最适宜的浓度为0.5mg/L,KT最适宜的浓度为1.0mg/L-1.5mg/L分别利用MJA、SA、黑曲霉叁种诱导子的不同浓度处理圆叶牵牛毛状根。结果表明,不同诱导子对圆叶牵牛毛状根的生长及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量有不同的影响。培养基中诱导子MJA和黑曲霉浓度越高,对毛状根生长的抑制作用越强,SA对毛状根的生长没有明显的影响。不同浓度的MJA对圆叶牵牛毛状根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的合成有显着地促进作用,浓度越高,促进作用越强。当MJA浓度为100μmol/L时咖啡酸总产量最高,可达到330.6μg,是未加诱导子的1.12倍,当MJA浓度为50μmol/L时咖啡酸乙酯总产量最高,可达到42.57μg,是未加诱导子的1.07倍。当SA浓度为30μmol/L时,毛状根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量最高,分别为0.0286%、0.0034%,此时咖啡酸、咖啡酸乙酯的总产量也最高454.74μg、69.96μg。当黑曲霉浓度为40mg/L时,咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量达到最高,分别为450.4619μg、56.4719μg。综合毛状根的生物量及其咖啡酸、咖啡酸乙酯的含量考虑,培养基中MJA浓度为50-100μmol/L或SA浓度为30μmol/L或黑曲霉浓度为40mg/L时,适合圆叶牵牛毛状根的培养,其中咖啡酸、咖啡酸乙酯的总产量达到最高。研究结果表明,不同激素组合、不同诱导子组合、激素和诱导子组合对圆叶牵牛毛状根中咖啡酸、咖啡酸乙酯的总产量有一定的影响。激素0.5mg/LNAA与激素1.0mg/L KT、诱导子100μmol/LMJA与30μmol/L SA、激素0.5mg/LNAA与30μmol/L SA组合是培养圆叶牵牛毛状根的最佳组合。咖啡酸的产量分别为376.2μg、387.2μg、452.1μg,咖啡酸乙酯的产量分别为49.8μg、48.63μg、51.2μg。
参考文献：
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[8]. 金铁锁毛状根优良细胞株系的筛选及培养体系的优化[D]. 高帅. 广州中医药大学. 2012
[9]. 麻花艽（Gentiana straminea）和大叶秦艽（Gentiana macrophylla）细胞培养研究[D]. 王海涛. 青海大学. 2014
[10]. 不同因子对圆叶牵牛毛状根的生长及次生代谢产物的影响[D]. 徐大卫. 吉林农业大学. 2012
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