刘爱兵[1]2004年在《乳酸克鲁维斯酵母（Kluyveromyces lactis）乳糖酶基因的克隆、表达及酶学性质分析》文中进行了进一步梳理β-半乳糖苷酶(B-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galactohydrolase，EC3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactasc)，能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用。乳糖酶主要用于改良乳制品和生产低聚半乳糖，还可用于蛋白质合成与遗传因子等方面的研究，具有重要的实践价值和理论意义。目前，工业生产中使用的乳糖酶主要来源于乳酸克鲁维斯酵母菌、黑曲霉和米曲霉。 本论文从一株乳酸克鲁维斯酵母菌中克隆获得乳糖酶基因，在大肠杆菌中进行表达并测定其酶学性质，同时也对利用巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)系统表达该基因进行了探索。 研究内容及结果如下： 1．乳糖酶基因的克隆及原核表达 以乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)菌株k538的基因组DNA为模板，设计引物，利用PCR获得乳糖酶基因Klac，经DNA测序验证，得到克隆T1549。乳糖酶基因插入到表达载体pET-30a(+)上构建重组表达质粒pETlac4，将pEFlac4电击转化到大肠杆菌BL21中，分别研究了阳性转化子在28℃、37℃下经IPTG诱导3h后的蛋白表达情况。表达产物的SDS-PAGE分析和酶活性测定表明，Klac基因在大肠杆菌中获得活性表达，其中低温条件28℃下的表达水平明显高于37℃，28℃诱导的细胞经超声波破碎所测酶活力为0.475U/mL，37℃仅为0.134U/mL。 2．原核表达乳糖酶的酶学性质测定 制备原核表达乳糖酶的原酶液。以ONPG为底物，分别测定了其最适pH值及pH稳定性、最适温度及热稳定性、金属离子和化学试剂的影响以及K_m值和V_(max)值。该酶最适pH值为5.8和6.4～7.5，属中性酶，碱性条件稳定，酸性条件不稳定；最适反应温度45℃～52℃，热稳定性较差，不适于高温反应；Fe~(2+)、Mn~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)和Zn~(2+)对乳糖酶有明显的激活作用，且该酶有一定的金属离子依赖性，Cu~(2+)具有很强的抑制作用；37℃、pH6.6条件下K_m=1.143 mmol/L，V_(max)=142.857nmol/min。 3．乳糖酶基因Klac在巴斯德毕赤酵母中表达 将Klac基因插入到载体pPIC9上构建重组表达质粒PIC9154983，电击转化巴斯德毕赤酵母受体菌GS115，经筛选和PCR鉴定，1#、8#和24#为重组菌株，Klac基因整合到GS115基因组中。叁个重组菌株经甲醇诱导培养未检测到分泌的乳糖酶，但胞内均检测到有活性的乳糖酶，分别为0.1392U/mL、0.3702U/mL和0.2214U/mL，说明乳糖酶基因Klac在巴斯德毕赤酵母中获得表达。
王志锋[2]2009年在《乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因在大肠杆菌中表达及酶学性质研究》文中指出β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactoside galactohydrolase,EC 3.2.2.23)又称乳糖酶(Lactase),能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷转移的作用。乳糖酶主要用于治疗乳糖不耐受症、生产低乳糖乳制品和低聚半乳糖。乳糖酶在免疫、检测及疾病诊断等方面也具有十分重要的意义。本论文利用大肠杆菌原核表达系统表达了乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因Lac4,并对重组乳糖酶的酶学性质进行分析,对基因工程菌的诱导表达条件进行优化,为乳糖酶的工业化生产和开发多功能的乳糖酶产品奠定基础。本研究得到的结论如下:1.乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达。将重组表达质粒pET-28a-lac4转化大肠杆菌BL21,加入IPTG诱导乳糖酶表达,超声波破碎后进行SDS-PAGE分析,乳糖酶基因在大肠杆菌中获得活性表达,重组乳糖酶以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在,而且两种形式的蛋白含量几乎相同。利用Ni-NTA亲和层析技术对重组乳糖酶进行纯化,Bradford Assay分析方法测定蛋白浓度,纯化的乳糖酶浓度为80.56μg/ml,乳糖酶活性为20.59±0.19 U/ml,比酶活性为255.55±2.32 U/mg。2.乳糖酶的酶学性质分析。对乳糖酶原酶液进行Ni-NTA亲和层析纯化,在SDS-PAGE上呈现出单一的蛋白带,重组乳糖酶酶分子量约为122 kDa。该酶最适反应pH为7.0,属中性酶,在pH4.0-10.0范围内有良好的稳定性;最适反应温度为43℃,37℃时乳糖酶的热稳定性较好,半衰期为30min;Ca~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(2+)、Co~(2+)、Mg~(2+)、Mn~(2+)对酶有非常明显的激活作用,Cu~(2+)对酶具有很强的抑制作用,表明该乳糖酶有一定的金属离子依赖性;在43℃,pH7.0条件下,以不同浓度的ONPG为底物,采用双倒数作图法,测定其Km值为3.49 mmol/L,Vmax值为4.22 mmol/min.mg。3.乳糖酶基因工程菌发酵条件的优化。采用正交设计试验对工程菌的培养基配方及诱导表达条件进行优化。确定最佳发酵培养基配方为:酵母粉3.0%,蛋白胨2.5%,葡萄糖2.5%,NaCl 1.0%;最佳培养及诱导条件为:诱导温度28℃,装液量10%,接种量1%,IPTG浓度0.15 mmol/L,诱导4.5 h。在此条件下对乳糖酶工程菌进行诱导培养,产酶水平可达到116.69 U/ml。
段文娟[3]2008年在《纤维单胞菌Cellulomonas sp.中性β-半乳糖苷酶新基因的克隆、表达及酶学性质分析》文中研究说明β-半乳糖苷酶通常被称为乳糖酶,它广泛存在于植物、细菌、真菌、放线菌以及动物肠道中。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,并具有半乳糖苷的转移作用,主要用来治疗乳糖不耐受症,处理加工牛乳、乳清,生产低乳糖牛奶和乳制品。乳糖酶的研究具有重要的实践价值和理论意义。本论文的目的是从特殊环境分离产乳糖酶的菌株,克隆得到具有特殊性质的乳糖酶基因,为进一步的工业化生产提供材料。本研究从来源于火焰山的土壤中筛选获得一株产乳糖酶的菌株Dm,通过对菌株生理生化特性的研究及16SrDNA的分子鉴定,初步认为该菌株属于纤维单胞菌属(Cellulomonas sp.)。利用PCR(简并PCR,热不对称交错PCR(TAIL-PCR)和反向PCR)的方法,克隆得到乳糖酶基因,命名为galc。galc全长2076bp,(G+C)%含量72.9%,编码692个氨基酸,无信号肽序列。经过序列分析和结构预测,推测galc为属于糖基水解酶第42家族的乳糖酶基因,编码的蛋白GALC含有叁个结构域。通过序列比对分析,galc与已报道的乳糖酶的序列相似性都在为40～60%之间,其中与来源于Arthrobacter sp. FB24相似性最高,为59%。可以初步确定galc为新的乳糖酶基因。本研究为首次在Cellulomonas sp.中克隆获得乳糖酶基因。将galc分别在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和Pichia pastoris GS115中进行了表达,并对原核表达的乳糖酶进行纯化和酶学性质分析。成熟蛋白的分子量为76kD,最适pH为6.4,最适温度47℃,比活为188.30 u/mg,动力学分析表明其Km为19.33mmol/L,Vmax为416.67nmol/min。
章沙沙[4]2010年在《β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及应用》文中研究表明β-半乳糖苷酶通用名称为乳糖酶,属于糖苷水解酶类,可将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖,并可以通过转糖苷作用合成低聚糖。乳糖酶不仅可缓解乳糖不耐受症,还可改良乳制品的品质、风味和口感。本研究采用基因工程技术对一株卷曲乳杆菌B164中的乳糖酶进行了基因克隆、表达和酶学性质分析,进一步地研究了其用于生产低乳糖牛奶的实际效果,结果如下：1.经16S rDNA序列比对,菌株B164鉴定为卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)。采用简并引物PCR和热不对称交错PCR (TAIL-PCR)的方法从菌株B164基因组中克隆得到乳糖酶基因bg42-164。该基因全长2031bp,编码676个氨基酸和一个终止密码子,无信号肽序列。经序列比对分析,bg42-164属于糖苷水解酶GH42家族。2.乳糖酶基因bg42-164连接pET-30a(+)表达载体并成功在大肠杆菌BL21(DE3)中得到活性表达,对重组表达的乳糖酶蛋白进行了纯化和酶学性质分析。乳糖酶蛋白BG42-164的分子量约为66 kD,最适反应温度50℃,最适pH 6.0,热稳定性较好,47℃处理30min,仍有90%以上的相对酶活力。Mg2+、Mn2+、Zn2+对BG42-164乳糖酶活性有显着的激活作用,而Cu2+,K+和SDS对酶活有较强的抑制作用。乳糖酶BG42-164的比活为159.77 U·mg-1,以邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷(oNPG)为底物,在50℃,pH6.0条件下,其Km=3.559 m mol·L-1, Vmax=19.231 n mol·min-1。将bg42-164基因连接pPIC9表达载体并转化毕赤酵母GS115,未能得到分泌表达。3.于牛奶中添加不同量的乳糖酶BG42-164,在50℃,37℃和18℃的条件下对牛奶中的乳糖进行水解。当酶活为5000 U·mL-1的乳糖酶取0.1mL添加到2 mL牛奶后,50℃下处理2h,牛奶中的乳糖全部水解；37℃下处理6h,乳糖水解率达到99%；18℃水解9h,乳糖水解率也能达到60%。综合考虑,乳糖酶BG42-164水解牛奶的优化工艺条件为：温度为50℃,5000U·mL-10.1mL乳糖酶添加到2mL牛奶中,水解2 h。
徐顺清, 陈杏洲, 崔罗生, 梁运祥, 张忠明[5]2010年在《乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质》文中指出通过PCR扩增从乳酸克鲁维酵母基因组获得乳糖酶基因lac4,将其克隆至大肠杆菌表达载体pET-28a(+),并在大肠杆菌BL21中获得表达,酶活性达(44.78±2.84)U/mL。利用Ni-ResinHP亲和层析技术纯化该酶,SDS-PAGE分析表明,重组酶分子质量约为122ku。酶学性质研究表明,该酶最适反应温度为43℃,37℃时半衰期为30min,最适反应pH为7.0,在pH4.0～10.0范围内有良好的稳定性,Ca2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Mg2+、Mn2+对酶有非常明显的激活作用,比酶活性为(255.55±2.32)U/mg,酶反应常数Km为3.49mmol/L,最大反应速率vmax为4.22mmol/(min.mg)。
李红飞[6]2006年在《黑曲霉D2-26乳糖酶分离纯化及酶学性质研究》文中指出乳糖酶是一种水解酶,目前主要应用于食品、医药、分析等领域。本研究以酶工程实验室所保存的一株黑曲霉D2-26为出发菌株,采用10L发酵罐发酵生产乳糖酶,建立了一套简单易行的乳糖酶提取纯化方法并对纯酶的酶学性质进行了详细研究。黑曲霉D2-26乳糖酶是胞外高温乳糖酶,具有生产成本低、提取纯化工艺简单、稳定性好、在生产中可以有效防止杂菌污染等特点,具有广阔的应用前景。 黑曲霉D2-26乳糖酶经过滤、超滤、硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25脱盐、DEAE-纤维素-32离子强度梯度层析、Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素-32pH梯度层析等纯化工艺分离纯化之后,经PAGE电泳鉴定得到单一条带,达到电泳纯。比活力提高到705.91U/mg,比初始发酵液比活提高了43.7倍多。 纯化的黑曲霉D2-26乳糖酶以ONPG为底物时的酶学性质为:最适温度70℃,作用温度较广,在40～70℃都具有较高的酶活性;在30～60℃有较高的耐受性,在30～50℃范围内处理120min,残留酶活均在90%以上,在60℃下处理相同时间其其残留酶活为73.42%;在4℃冷藏条件下具有良好的稳定性,乳糖酶蛋白在低温贮存20天后酶活才开始降低;最适pH为2.5,作用范围较宽,在pH2～4.5范围内均具有较高的酶活性:在pH2～9条件下贮存2d其相对酶活力均在70%以上,具有较好的pH耐受性:Mn~(2+)对乳糖酶有显着激活作用,可使其酶活提高44.94%,并且许多金属离子都能够在一定程度上提高其酶活性,Hg~(2+)、Pb~(2+)对酶活有较强的抑制作用:SDS对酶蛋白的变性作用严重抑制其酶活性,半乳糖对黑曲霉D2-26乳糖酶有一定的产物抑制作用,EDTA不影响乳糖酶的活性:以ONPG为底物采用双倒数作图法测得Vmax为97nmol/min,Km为8.77mmol/L;SDS-PAGE电泳显示黑曲霉D2-26乳糖酶分子量116.978KD,为单亚基蛋白;硫酸-苯酚法测得其糖基化程度为11.3%。 本论文对乳糖酶的分离纯化、酶学性质做了基础性研究,为其工业化生产打下了基础。
张伟[7]2002年在《利用生物技术开发一种新乳糖酶及其高效生产途径》文中指出意义和目的 牛乳及乳制品含有丰富的优质蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素和多种矿物质，尤其是其钙含量高且钙磷比例适当，易被人体消化吸收，还含有免疫球蛋白等抗病因子，因此牛乳及乳制品是人类改善营养、增强体质不可缺少的理想食品。我国已于2000年11月15日正式启动“学生饮用奶计划”，旨在提高全民营养状况、推动我国农业经济发展。目前世界人均牛乳年消费量为94kg，亚洲人均40kg，而我国仅为7kg，相差甚远，除了经济发展水平以外，一个重要的原因就是在中国人群中有很大一部分患有乳糖不耐受症。乳糖是牛乳中主要糖成分，其含量约为5％左右。许多人(因人种而异，西欧占2-8％，亚洲、非洲占60-90％)体内缺乏乳糖酶，因此他们很难消化牛奶，饮用牛奶后，乳糖在肠道内，被肠道细菌分解发酵，产生大量二氧化碳气体，导致肠道膨胀，并兴奋肠道蠕动，使收缩加强，造成肠鸣和腹泻，这种疾病称为乳糖不耐受症。生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的最佳途径。 β-半乳糖苷酶(β-D半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galatohydrolase,EC 3.2.1.23)通常被称为乳糖酶(Lactase)。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用。乳糖酶广泛存在于植物、细菌、真菌、放线菌以及动物肠道中。乳糖酶主要用来治疗乳糖不耐受症，处理加工牛乳、乳清，生产低乳糖牛奶和乳制品。近几年随着人们对乳糖不耐受症认识的深入，乳糖酶在食品和乳制品工业中的作用日益显着。但目前乳糖酶并未在中国食品和乳制品工业中得到广泛应用，主要原因是：(1)乳糖酶的单位产量较低；(2)市场上销售的乳糖酶多为胞内酶，酶的耐热性差、适用范围窄；且这种酵母来源(Kluyveromyces lactis、Kluyveromyces fragilis)的胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取、纯化工艺繁杂。由于上述等原因致使乳糖酶销售价格过高、应用成本昂贵、适用范围窄，不能满足食品和乳制品工业多方面的需要。 本论文研究的目的是从本实验室保存的一株产乳糖酶的亮白曲霉(Aspetgillus candidus)中克隆并获得拥有自主知识产权的乳糖酶基因，构建高效表达、有效分泌乳糖酶的重组毕赤酵母生物反应器，以解决乳糖酶单位产量低、胞内酶提取困难的问题。期望利用生物技术开发一条乳糖酶高效生产的新途径。 中国农业科学院博士学住论文结论 1．本研究从一株产乳糖酶的亮白曲霉（ASpergillu candidus冲克隆得到了乳糖酶基因组DNA及CDN＊序列，序列分析表明，该乳糖酶基因组DNA序列长3458hp，其中含有8个内含子，CDNA编码区长3015hp，共编码1005个氨基酸，前19个氨基酸为信号肽序列，氨基酸序列中共含有11个潜在的糖基化位点。将不同来源的乳糖酶基因与此基因进行比较发现，该基因与绝大多数乳糖酶基因同源性较低；与商业化应用的、在本研究中作为对照的 A．o叭ae ATCC 20423的乳糖酶基因组 DNA和衍生的氨基酸序列比较，两基因CDNA的同源性为99％，氨基酸的同源性为99．5％，二者的基因组DNA序列中有19个碱基不同，内含子区域有5个碱基不同，CDNA序列中有 14个碱基不同，其中 3个碱基的变化引起了 3个氨基酸的改变：ZI＋，T从cry a幻一？U．can＆血小 牡0，1U．口W二a一～＊U．can”山小989，NU．O炒二ae—D（．candidusX但经实验证实，二者在酶学性质上有显着的差异，由此说明我们克隆到了一个新基因，我们己将该基因在 GENEBANK中登录，登录号为：EMBLACCESSIONNO．AJ431643。 2．研究了亮白曲霉的乳糖酶的酶学性质：其最适叫．2，最适温度为60OC，PH稳定范围在pH3习之间，比活为706．54U／mg，以ONPG为底物时的义为1石7mmol几，七x为3．33卜mo厂L。将亮白曲霉的乳糖酶与商业化应用的、本研究作为对照的米曲霉ATCC 20423的乳糖酶进行了酶学性质的比较，结果表明亮白曲霉的乳糖酶在热稳定性、金属离子稳定性、比活、（、pH范围方面均优于后者，该乳糖酶具有更优越的酶学性质，在工业化生产中具有更广阔的应用前景。 3．亮白曲霉的乳糖酶基因在大肠杆菌和毕赤酵母中均得到了表达，大肠杆菌表达的乳糖酶蛋白分子量约为 11 okD，与理论分子量山 okD湘符；毕赤酵母表达的乳糖酶蛋白分子量为120．130kD，二者分子量之间有差别的原因可能是毕赤酵母表达系统可对该蛋白进行翻译后的糖基化修饰作用，而原核表达系统不具备该功能。 毕赤酵母表达系统可高效地表达有生物活性的亮白曲霉的乳糖酶，分泌表达量近 6g／L，酶活为 3600U／InL，且目的蛋白占发酵液中总分泌蛋白的 90％以上，发酵液中杂蛋白含量很少。因此本研究开辟了一条产量高、分离纯化简便、廉价大规模生产乳糖酶的新途径。 4．初步进行了亮白曲霉的乳糖酶水解新鲜牛奶的应用效果研究。将不同酶量的孪糖酶O000U、1500U）分另添力到10mL牛奶中，测定在不同温度下OZ℃、37OC、50oC、60oCX不同时间内，乳糖酶对牛奶中的乳糖的水解程度。通过高压液?
侯重文[8]2014年在《基因工程法构建乳糖酶高产菌株及发酵条件优化的研究》文中提出乳糖酶又称β-半乳糖苷酶,可以催化水解乳糖生成葡萄糖和半乳糖,并具有半乳糖苷的转移作用。乳糖酶作为一种生物酶制剂,主要用来治疗乳糖不耐受症,处理加工乳制品等,在医药、食品等诸多领域应用十分广泛。但目前乳糖酶的工业化生产还存在许多问题,如：乳糖酶的单位产量较低；多为胞内酶,纯化工艺复杂,应用成本高；适用范围较窄,对环境要求高等。其中米曲霉乳糖酶因其酶学性质好、可胞外分泌、商业化应用多、表达水平低等特点,被本文选为研究对象。本研究首次将米曲霉(Aspergillus oryzae)乳糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体中,实现该乳糖酶的有效分泌和高效表达。以米曲霉cDNA文库为模板,通过PCR扩增得到米曲霉乳糖酶基因cDNA,序列长度为3015bp。根据毕赤酵母的密码子偏好性对该乳糖酶基因进行了优化,成功提高了其密码子的使用频率,去除了不利于转录和表达的稀有密码子。然后连入GAP系列的表达载体构建基因工程菌株,该系列载体所用的GAP启动子作为组成型启动子,不需要其他毕赤酵母工程菌中常用的甲醇诱导步骤,在食品安全上有效避免了因甲醇使用所带来的问题。经过蓝白斑初筛及活性测定复筛最终得到了一株高产乳糖酶基因工程菌株GalC131。该菌株可高效地将乳糖酶蛋白分泌到胞外,无需破碎细胞,杂蛋白很少,后续纯化工艺简单,经超滤和凝胶层析后,可直接用于牛奶中乳糖水解。本研究对毕赤酵母工程菌GalC131发酵培养基中的碳源、氮源、金属离子和pH、温度、接种量等发酵条件分别进行了单因素优化,优化后的发酵培养基为葡萄糖45g/L、甘油15g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物20g/L、MgSO4·7H2O9g/L、FeSO4·7H2O60mg/L、CuSO4·5H2O6mg/L、K2HPO44g/L、CaSO40.93g/L、 K2SO418.2g/L、微量元素液1mL/L,发酵条件为pH7、30℃、接种量6%,300r/min。摇瓶发酵产酶酶活可达到672U/mL,较优化前提高了30.7%。在1L发酵罐中对碳源流加速率进行了优化,采用15mL/h-L在发酵16h后开始流加,并将发酵工艺在50L发酵罐中成功进行了中试放大,乳糖酶酶活达到4312U/mL,大大高于目前国内外报道的乳糖酶产量。本研究对GalCl31所产的重组米曲霉乳糖酶进行酶学性质研究,并以原始米曲霉乳糖酶作为对照。重组酶的最适pH为5.2,并在pH4.6-8.0之间保持稳定；最适反应温度60℃,热稳定性、金属离子稳定性等都优于对照酶,酶学性质表现更好。本研究还通过HPLC检测该乳糖酶在不同条件下对牛奶中乳糖的水解率,初步研究了其在制备低乳糖牛奶中的使用条件。在37℃、3000U/mL酶液0.3%的添加量条件下,乳糖水解率能达94%以上。同时该乳糖酶在低温条件下也具有良好的乳糖水解率,10℃(0.9%)水解率可达83%以上,25℃(0.9%)可达93%以上,有利于在乳制品生产中避免微生物腐败,保持牛奶新鲜度,降低生产成本。综上所述,本研究通过基因工程方法成功开发了一种产量高、可胞外分泌、后续纯化简单、生产过程安全、酶学性质好、低温表现良好的新型乳糖酶,为乳糖酶在食品等工业上的进一步大规模应用奠定基础。
白利[9]2010年在《耐热乳糖酶基因克隆、表达及酶学性质研究》文中研究指明我国大部分人群(约75%-95%)因体内缺乏乳糖酶而患有乳糖消化不良和乳糖不耐受症状,而乳糖酶能将乳制品中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖,利于人体对其消化吸收,故利用乳糖酶来生产这种乳糖水解产品为减轻乳糖不耐受症状提供了一种可行的方法,具有重要的实践价值和理论意义。本论文从一筛选菌株凝结芽孢杆菌Bacillus coagulansT242中克隆获得耐热乳糖酶基因,进行原核表达,分析其酶学性质。以凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans36D1基因组DNA及乳糖酶基因作为参考序列,分别设计同源性验证引物：F1/R1、F2/1R2,含乳糖酶基因DNA片段引物：F3/R3、F4/R4及乳糖酶基因扩增引物F/R,以Bacillus coagulans T242基因组DNA为模板,利用PCR获得碱基序列全长2005个碱基的乳糖酶基因gal。将gal基因插入到表达载体pET32-a(+)构建重组表达质粒(pET32-gal),亚克隆到E.coli HSTO8宿主细胞中,通过菌落PCR初步检测,再提取质粒测序,筛选出阳性克隆子。将表达质粒pET32-gal转化到E.coli BL21宿主细胞中,挑取阳性克隆子37℃培养至OD600约为0.6时,用IPTG(终浓度1mmol/L)分别在37℃、25℃诱导培养4h后,细胞破碎离心沉淀经SDS-PAGE分析检测到大量目的蛋白,说明表达产物为包涵体。为实现耐热乳糖酶基因gal的可溶性表达,将表达质粒pET32-gal与分子伴侣质粒pGro7同时转化E.coli BL21,经SDS-PAGE分析,在细胞破碎上清液中含有目的蛋白。进一步优化pET32-gal/pGro7/BL21诱导培养条件：在IPTG浓度为0.6mmol/L时37℃诱导培养4h,乳糖酶的表达量最高,酶活为6.791U/mL发酵液,是出发菌株乳糖酶活力的5倍。同时对表达后耐热乳糖酶进行酶学性质研究。pH6.8乳糖酶活力最高,属中性酶；pH6.0-9.0范围内,37℃保温1h,其相对酶活可达80%以上；其最适反应温度50℃,40-50℃保温20min,其相对酶活达80%以上,但60℃保温20min,则残余酶活仅为原酶的3.16%,热稳定性降低。Mg2+、Ca2+、SDS对乳糖酶有激活作用,其中Ca2+激活作用最大,K+、EDTA影响不大；Cu2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+对酶有抑制作用,其中Fe2+离子抑制作用最大,抑制率为68%。在50℃, pH6.8条件下,其Km=7.60mmol/L, max=128.21nmol/min。综上,乳糖酶最适pH为中性,且Ca2+对该酶激活作用明显,可用于水解牛乳中的乳糖。
宋春丽[10]2010年在《耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株乳糖酶的研究》文中研究指明乳糖酶(β-D-半乳糖苷酶,β-D-galactoside-galactohydrolase, EC 3.2.1.23)为一种水解酶,可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖,目前广泛应用于医药、食品、环保等领域。冷适应乳糖酶具有在低温下高活性的优点,应用在乳品加工和乳清引起的环境污染治理等方面,有着中温和高温乳糖酶无法达到的优越性。同时南极地区被认为是一个潜在的、重要的微生物资源库,可能是产生新型生物活性物质和先导化合物菌株的潜在种源地。我们实验室从采集自南极的海泥样品中筛选到33株酵母菌,本实验在15℃条件下,采用X-gal定性试验和ONPG定量试验从这33株酵母中筛选产乳糖酶的菌株,结果筛选到1株高产乳糖酶菌株17-1,经酵母菌常规方法和分子生物学方法鉴定,我们将其鉴定为一株普鲁兰久浩酵母(Guehomyces pullulans)。研究发现,G. pullulans 17-1菌株可同时产胞外和与细胞结合的(Cell-bound)乳糖酶,根据温度对菌体生长的影响,我们判定菌株17-1为一株耐冷型酵母。对耐冷酵母G. pullulans 17-1菌株产乳糖酶的培养基及培养条件进行了优化,确定了最佳培养基成分为(w/v)：乳糖3.0%,酵母粉0.7%,蛋白胨0.3%,紫苏油0.02%, KH2PO4 0.28%, MgSO4·7HO20.06%, MnSO4·3HO2 0.00085%,培养基初始pH为4.5,蒸馏水配制；最佳培养条件为：15℃、170 rpm振荡培养132 h,此时耐冷酵母G. pullulans 17-1菌株乳糖酶总产量可达13.9 U/mL。对发酵罐高密度发酵产酶条件进行了初探,实验结果表明可以将该乳糖酶的总产量提高到25.3U/mL。用粗酶样品水解乳糖溶液,水解产物为葡萄糖和半乳糖,水解牛奶可产生大量还原糖。G. pullulans 17-1菌株胞外乳糖酶经超滤法浓缩、SephadexTM G-200凝胶过滤、CM-Sepharose F.F.阳离子交换层析得到了纯化,比活力提高2.4倍。SDS-PAGE显示其单亚基分子量约为170.0 kDa,用凝胶过滤层析法测得该纯化酶的分子量约为335.0 kDa,因此推测G. pullulans 17-1菌株乳糖酶是一个同源二聚体。对该纯化酶的酶学性质进行了研究,结果表明：其最适作用温度和pH分别为50℃和4.0,受Ag+、Hg2+的强烈抑制(8.2%,8.4%),Li+离子对它有一定激活作用,对底物ONPG的Km值和Vmax分别为3.3 mM和9.2μmol/min。一级蛋白质谱分析表明,该乳糖酶的一个肽片ALEEYKK与其它已知酵母乳糖酶序列相匹配。将纯化的乳糖酶和4.6%乳糖溶液混合,50℃下孵育4 h后,测得乳糖溶液的水解率为43.5%,实验结果表明该乳糖酶在食品工业中有潜在的应用价值。
参考文献：
[1]. 乳酸克鲁维斯酵母（Kluyveromyces lactis）乳糖酶基因的克隆、表达及酶学性质分析[D]. 刘爱兵. 西南农业大学. 2004
[2]. 乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因在大肠杆菌中表达及酶学性质研究[D]. 王志锋. 华中农业大学. 2009
[3]. 纤维单胞菌Cellulomonas sp.中性β-半乳糖苷酶新基因的克隆、表达及酶学性质分析[D]. 段文娟. 中国农业科学院. 2008
[4]. β-半乳糖苷酶基因的克隆、表达及应用[D]. 章沙沙. 湖南农业大学. 2010
[5]. 乳酸克鲁维酵母乳糖酶基因在大肠杆菌中的表达及酶学性质[J]. 徐顺清, 陈杏洲, 崔罗生, 梁运祥, 张忠明. 华中农业大学学报. 2010
[6]. 黑曲霉D2-26乳糖酶分离纯化及酶学性质研究[D]. 李红飞. 河北农业大学. 2006
[7]. 利用生物技术开发一种新乳糖酶及其高效生产途径[D]. 张伟. 中国农业科学院. 2002
[8]. 基因工程法构建乳糖酶高产菌株及发酵条件优化的研究[D]. 侯重文. 山东大学. 2014
[9]. 耐热乳糖酶基因克隆、表达及酶学性质研究[D]. 白利. 大连工业大学. 2010
[10]. 耐冷酵母Guehomyces pullulans17-1菌株乳糖酶的研究[D]. 宋春丽. 中国海洋大学. 2010
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