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PCV2 Cap多拷贝基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

2020-12-02阅读(614)

PCV2 Cap多拷贝基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪断奶后多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）的主要病原体,该病主要发生在 5-12周龄仔猪,以体重减轻为主,并伴随有间质性肺炎、淋巴结肿大及肝炎等症状。1991年在加拿大西部首次发现该病,此后在世界各地都有报道,对世界养猪业造成了重大的经济损失。目前疫苗免疫是我国防控PMWS的主要预防手段。Cap蛋白是由PCV2 ORF2基因编码的结构蛋白,能够介导PCV2的识别和入侵,该蛋白含有主要的中和抗原表位,能诱导有效的免疫保护效果。昆虫杆状病毒系统表达的Cap蛋白能自组装成病毒样颗粒（Virus-like particle,VLP）,可以作为PCV2的亚单位疫苗或诊断抗原应用,因而使Cap蛋白成为PCV2检测和疫苗研究的热点。已有研究证实,利用昆虫杆状病毒表达系统表达Cap蛋白可用来制备PCV2亚单位疫苗和诊断抗原。因此,本研究采用杆状病毒GP64分泌型信号gp64sp引导Cap蛋白在昆虫细胞中分泌表达,同时利用2A自剪肽（Self-cleaving 2A peptide,2A）对Cap蛋白在昆虫细胞中进行高效的表达以提高Cap蛋白的表达水平。首先制备了一种单拷贝重组杆状病毒rvAc-gp64sp-cap1 和两种双拷贝重组杆状病毒 rvAc-gp64sp-cap1-2A-cap2 及rvAc-gp64sp-cap1-2A-gp64sp-cap2,在感染 Sf9 细胞后,Western Blotting 分析浓缩后的上清液证明Cap蛋白已成功分泌表达,同时分析了 Cap蛋白在不同时间的分泌表达量,结果表明在重组杆状病毒感染后的4 d到第5 d时蛋白分泌表达量最高,最后通过比较3种重组杆状病毒毒感染Sf9细胞后的分泌表达量可知,两种双拷贝的重组杆状病毒Cap蛋白的分泌表达量基本相同且都明显多于单拷贝的重组杆状病毒的Cap蛋白分泌表达量（P<0.01）。我们基于pFastBac-Dual构建cap四拷贝的重组杆状病毒,经过Western Blotting分析表明该重组杆状病毒所分泌表达的Cap明显多于单拷贝和双拷贝,且比单拷贝重组杆状病毒分泌表达Cap蛋白的量要多2.7±0.4倍（P<0.001）。用四拷贝的重组杆状病毒感染High five（Hi5）细胞优化Cap蛋白的分泌表达。在经阳离子交换层析后通过透射式电子显微镜观察可知四拷贝重组杆状病毒所分泌表达的Cap蛋白能自组装成VLP。通过超滤浓缩Cap蛋白自组装的VLP（VLP-Cap）皮下注射免疫BALB/c小鼠,脾淋巴细胞增殖实验和间接ELISA检测表明,单拷贝重组杆状病毒和四拷贝重组杆状病毒分泌表达的Cap蛋白均能诱导小鼠产生的特异性免疫应答。本研究通过gp64sp分泌型信号肽取代ORF2原有核定位信号肽,利用昆虫杆状病毒表达系统成功实现了 Cap蛋白在昆虫细胞中分泌表达的目的,同时成功利用2A自剪肽进行了多个PCV2 cap基因在昆虫细胞中的高效表达,产生的VLP免疫接种小鼠后能诱导特异性的体液免疫和细胞免疫。本研究在昆虫细胞以分泌方式高效表达PCV2 Cap蛋白组装VLP方面进行了尝试性工作,为后续实际应用奠定了基础。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语
  • 第一章 绪论
  •   1 猪圆环病毒2型的概述
  •     1.1 PCV2的结构及其基因组结构
  •       1.1.1 ORF1编码Rep蛋白
  •       1.1.2 ORF2编码Cap蛋白
  •       1.1.3 ORF3-ORF11基因的功能
  •   2 PCV2疫苗的研究进展
  •     2.1 灭活疫苗
  •     2.2 弱毒疫苗
  •     2.3 亚单位疫苗
  •     2.4 活载体疫苗
  •     2.5 病毒样颗粒疫苗
  •   3 昆虫杆状病毒表达系统
  •   4 2A自剪肽2A的简介
  • 第二章 研究方案设计
  •   1 研究目的及意义
  •   2 研究内容
  •   3 技术路线
  • 第三章 重组杆状病毒的构建及Cap蛋白的分泌表达
  •   1 引言
  •   2 材料与试剂
  •     2.1 实验材料
  •     2.2 主要试剂与耗材
  •     2.3 主要仪器
  •     2.4 主要试剂的配制
  •       2.4.1 细胞培养所用试剂
  •       2.4.2 分子克隆所需试剂
  •       2.4.3 SDS-PAGE及Western Blotting试剂的配制
  •       2.4.4 阳离子层析试剂配制
  •   3 实验方法
  •     3.1 单拷贝和双拷贝转移载体的构建
  •       3.1.1 目的基因的扩增
  •       3.1.2 目的基因的酶切与连接
  •       3.1.3 感受态细胞TG1的制备
  •       3.1.4 连接产物的转化
  •       3.1.5 提取重组质粒的提取及双酶切鉴定
  •       3.1.6 重组质粒的测序及重组菌种的保存
  •       3.1.7 重组质粒pFastBac-Dual-gp64sp-cap1-2A-cap2的构建
  •     3.2 Bac-to-Bac系统制备重组杆状病毒
  •       3.2.1 DH10Bac感受态细胞的制备
  •       3.2.2 重组Bacmid转座子的构建
  •       3.2.3 重组Bacmid提取及鉴定
  •     3.2.3.1 重组Bacmid的提取
  •     3.2.3.2 重组Bacmid的鉴定
  •       3.2.4 细胞的复苏、培养及冻存
  •     3.2.4.1 细胞的复苏
  •     3.2.4.2 细胞的传代培养
  •     3.2.4.3 细胞的冻存
  •       3.2.5 重组Bacmid转染Sf9细胞
  •       3.2.6 蛋白表达的鉴定
  •     3.3 重组杆状病毒的扩增及病毒滴度的测定
  •       3.3.1 重组杆状病毒的扩增
  •       3.3.2 病毒滴度的测定
  •     3.4 Cap蛋白分泌表达时间的优化
  •       3.4.1 细胞上清液浓缩
  •       3.4.2 Western Blotting分析分泌蛋白表达
  •     3.5 单拷贝及双拷贝重组杆状病毒分泌表达Cap蛋白的检测
  •     3.6 四拷贝重组杆状病毒分泌表达Cap蛋白的检测
  •       3.6.1 四拷贝重组杆状病毒的构建
  •       3.6.2 Western Blotting分析Cap蛋白表达量
  •     3.7 四拷贝重组杆状病毒在Hi5细胞中的分泌表达
  •     3.8 透射式电子显微镜观察
  •   4 结果分析
  •     4.1 目的基因的PCR鉴定
  •     4.2 重组质粒的双酶切鉴定
  •     4.3 重组质粒的测序鉴定
  •     4.4 重组Bacmid的PCR鉴定
  •     4.5 Cap蛋白表达的检测
  •     4.6 Cap蛋白分泌表达的最佳时间的检测
  •     4.7 单拷贝及双拷贝重组杆状病毒分泌表达Cap蛋白的检测
  •     4.8 四拷贝重组杆状病毒的构建
  •       4.8.1 PCR扩增产物鉴定
  •       4.8.2 四拷贝重组质粒的双酶切鉴定及测序分析
  •       4.8.3 重组Bacmid的PCR鉴定
  •     4.9 Cap蛋白分泌表达量的比较分析
  •     4.10 四拷贝重组杆状病毒感染Hi5细胞优化后Cap蛋白的分泌表达
  •     4.11 透射电子显微镜观察蛋白结构
  •   5 讨论
  • 第四章 分泌表达的Cap蛋白的免疫原性分析
  •   1 引言
  •   2 材料与试剂
  •     2.1 实验材料
  •     2.2 主要试剂与耗材
  •     2.3 主要仪器
  •     2.4 主要试剂的配制
  •   3 实验方法
  •     3.1 分泌表达Cap蛋白的收集及免疫样品的制备
  •     3.2 BALB/c小鼠的分组与免疫
  •     3.3 脾淋巴细胞增殖实验
  •     3.4 免疫小鼠血清效价检测
  •   4 结果
  •     4.1 小鼠脾淋巴细胞增殖实验检测细胞免疫
  •     4.2 特异性抗体的检测
  •   5 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 江乾森

    导师: 舒建洪,陈健

    关键词: 猪圆环病毒型,蛋白,杆状病毒,病毒样颗粒,分泌表达

    来源: 浙江理工大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,农业科技

    专业: 生物学,畜牧与动物医学,畜牧与动物医学

    单位: 浙江理工大学

    分类号: S858.28;S852.651

    DOI: 10.27786/d.cnki.gzjlg.2019.000033

    总页数: 71

    文件大小: 4929K

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