孙惠青[1]2003年在《水稻内生细菌的研究及其杀虫工程菌的构建》文中研究表明本研究从四川主要栽培水稻品种D优527体内共分离到102株细菌。研究了内生细菌在水稻植株内不同生育期、不同组织部位的动态分布曲线特点，确定编号为SR-15、SR-25、SL-37的叁株细菌为优势菌株，并进行了优势菌株的回接、定殖试验，验证其内生性。经生理、生化特性结合形态学的研究，确定了优势内生菌株在微生物学上的分类地位，并进行了与Bt杀虫蛋白基因的重组，以及杀虫蛋白基因的表达及对水稻二化螟防治研究，验证了优势内生细菌作为生防工程载体菌的可行性。此外，对菌株的致病性、促生性等生物学特性进行研究。 取得的主要结果如下： 1 利用改进的细菌分离技术，从健康栽培水稻品种D优527的植株体内共分离到102株细菌，从根系中分离到41株，从叶片分离到37株，从茎分离到24株。其中，革兰氏阳性细菌77株，革兰氏阴性细菌25株。利用ERIC-PCR技术对菌株基因组进行分析，结果显示，菌株基因组间存在多态性。 2 对所获得菌株进行种群、数量的动态分析，研究细菌在根、茎、叶内随水稻生育期变化的动态分布情况，其中，水稻分蘖期和孕穗期是细菌种群数量分布的高峰时期。 3 根据种群分布特点，初步确定SR-15、SR-25、SL-37为优势种群，而SR-15优势性尤为明显，并确定了SR-15、SR-25、SL-37菌株在不同生育期数量动态变化趋势，其中，SR-15在分蘖期和孕穗期数量分布高于其它两菌株。 4 对SR-15、SR-25、SL-37菌株的生物学特性进行研究，结果显示，菌株的生长均符合细菌生长的典型的生长曲线，在不同pH、温度、培养基条件下，菌株生长的动态变化各有差异，且与相关报道的内生细菌生长特性具有一定的相似性。 5 转puc18标记验证内生性试验结果表明，在不同电压下，电击转化细菌的效率不同，在电压为1500V时转化效率最高，而puc18使用量对转化效率影响不明显。转带抗生素标记的puc18于优势细菌，回接水稻再分离，在抗生素培养基上初步筛选和PCR鉴定，与原始菌株一致。并通过电子显微镜超薄切片确定了各菌株在水稻体内的存在部位。验证了SR-15、SR-25、SL-37皆为水稻内生细菌。 6 对SR-15、DR-25、SL-37菌株进行光学显微镜和电子显微镜观察、细胞壁化学成分分析以及生理生化特性分析，确定SR一巧为盐敏芽抱杆菌，SR一25为栖息微球菌，SL一37为浅黄金杆菌。 8应用改进的PEG原生质体转化法和新型高效电击转化法，将含杀虫毒性强的苏云金杆菌6一内毒素基因Cry 1 Ac的质粒导入载体菌SR一15，构建杀虫工程内生细菌，并用电镜观察到基因表达后产生的毒蛋白晶体。 9工程菌株的杀虫试验表明，经超声波破碎后工程菌株发酵液(loscfi对ml一1护cfiUml)浸水稻幼苗，并饲养水稻二化螟幼虫，6天后其校正死亡率达80.1%。
刘云霞, 张青文, 周明[2]1997年在《Bt杀虫基因向水稻内生细菌的转化研究》文中研究表明本研究成功地构建以水稻体内定殖的优势细菌巨大芽孢杆菌为载体菌的工程杀虫内生细菌，这一内生工程杀虫细菌的建成是以水稻内生细菌的动态研究，定殖研究以及重组ＤＮＡ和细菌转化方法研究背景为基础，利用杀虫毒性强，表达苏云金芽孢杆菌δ－内毒素较高的重组质粒为供体，通过改进的ＰＥＧ原生质体转化法及新型高效电脉冲穿孔转化法完成。工程菌杀虫晶体蛋白的表达可不通过芽孢的萌发，电镜下可见营养生长期细胞内似苏云金杆菌晶体形状的毒蛋白产生。生测结果表明，工程菌液（１０５～１０６ｃｆｕ·ｍＬ－１）经超声波破碎浸水稻幼苗饲养二化螟幼虫，６天后校正死亡率均达８４．７％。
洪鹏翔[3]2007年在《Bt杀虫基因vip3A（a）转化芽孢杆菌TB2的研究》文中指出根据GenBank上登录的Bacillus subtilis subsp．subtilis str．168(简称BS168)序列(NC000964)，设计出包含两种不同限制性内切酶位点的1对扩增rpsD启动子序列的特异引物RpsF／RpsR，用PCR方法从BS168的总DNA中扩增出rpsD启动子基因，命名为rpsP。并根据已经在GenBank上登录的Bt vip3A(a)基因序列，设计出包含两种不同的限制性内切酶位点的1对特异引物vip-F／vip-R，以含有对鳞翅目夜蛾科害虫具有广谱高效杀虫活性基因vip3A(a)的苏云金芽孢杆菌(B．thuringiensis，Bt)菌株Bt-WB7的总DNA为模板，用PCR方法扩增出vip3A(a)基因。再将rpsP和vip3A(a)基因的PCR产物分别用NdeⅠ单酶切，之后将两个单酶切产物用T4连接酶连接。以连接产物为模板，用RpsF／vip-R为引物，扩增启动子-vip基因序列，将PCR产物直接连接到pMD-18T克隆载体上转入大肠杆菌(Escherichia coli)JM109。挑取阳性克隆，提取重组质粒pMD-p-vip进行酶切与PCR验证后进行测序。将测序验证正确的启动子-vip基因，用EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切从pMD-p-vip重组质粒上切下，回收目的片段与用相同酶切的表达载体Pgfp4412相连，得到重组原核表达质粒pVipgfp。将重组原核表达质粒pVipgfp转化解淀粉链芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)受体菌株TB2中，挑取转化子用PCR检测重组质粒pVipgfp导入情况，最后通过生物测定筛选得到能高效表达Bt vip3A(a)基因的TB2-16工程菌。研究表明TB2-16工程菌株培养液对斜纹夜蛾幼虫的具有很高的毒杀作用；抑菌实验表明TB2-16工程菌株对大豆炭疽病菌、柑橘炭疽病菌、黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌5种病原菌的抑制效果与TB2无明显差异，而且菌落形态基本上保持不变；内生和对植物生长影响研究表明TB2-16具有良好的内生和促生特性。
何玲敏[4]2017年在《吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007工程菌构建及其效应研究》文中研究表明随着我国杨树种植面积的逐年增加,以及在杨树造林过程中林木抚育、管理、保护、防治不当等原因,杨树病虫害的发生日趋严重,同时阻碍了我国林业的生产和发展。我国杨树病虫害的综合治理仍以化学防治为主导,然而化学农药的长期使用不但防治效果变差,而且给自然环境造成一定的污染和残留。因此,利用微生物代替化学农药来防治植物病虫害越来越受林业保护工作者的青睐。植物内生细菌定殖于健康植物体内,与寄主植物在长期进化过程中形成和谐联合关系,并对寄主植物具有抗病、促生、固氮和生物修复等生防潜力,是潜在的天然生物防治资源。此外,内生细菌还可作为外源基因的良好载体,通过基因工程技术将外源抗病、杀虫基因导入内生细菌中,提高植物抗病虫害等能力的同时不改变植物自身的基因组。因此,利用植物有益内生细菌及其工程菌株促进植物生长,并提高植物的抗病虫害能力已成为植物病虫害生物防治的研究热点。课题组前期从杨树干部分离到一株杨树内生细菌吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007,该菌株不仅能促进杨树生长,还对杨树溃疡病具有一定防治效果,是一株安全的杨树溃疡病生防菌株。洋葱伯克氏菌群Burkholderia cepacia complex(Bcc)的许多菌株对多种植物病原真菌具有拮抗作用,并已被广泛应用与植物病害的生物防治,但目前国内外有关Bcc工程菌构建的报道尚不多见。本研究以B.pyrrocinia JK-SH007菌株为研究对象,分别将外源抗病、杀虫基因导入JK-SH007中,构建具有促生、抗病、抗虫多重生防能力的高效生防工程菌。同时,对工程菌株JK-SH007E1在杨树根际产生的微生态效应进行研究,初步评估工程菌株释放到环境后的生物安全性。根据同源重组原理,分别将枯草芽孢杆菌的几丁质酶基因Chi113、苏云金芽孢杆菌的杀虫晶体蛋白基因cry218、苏云金芽孢杆菌的营养期杀虫蛋白基因vip3A和松材线虫的几丁质酶基因Bxchi插入到pHKT2载体上的启动子与gfp报告基因之间,成功构建了四个重组质粒pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi。质粒遗传稳定性试验表明,除重组质粒pHKT2-Bxchi外,其余叁个重组质粒均有较高的遗传稳定性,其中重组质粒pHKT2-Chi113的遗传稳定性最高。利用热激法将pHKT2-Chi113、pHKT2-cry218、pHKT2-vip3A和pHKT2-Bxchi四个重组质粒分别转化JK-SH007感受态细胞,获得了四株工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4。这四株工程菌在荧光显微镜下均观察到较强的绿色荧光信号,并且四个外源基因在mRNA水平均得到过表达,而在蛋白水平只有工程菌JK-SH007E1检测到外源基因的表达。与野生型菌株JK-SH007相比,工程菌JK-SH007E1产生的几丁质酶活性及其对杨树溃疡病菌的抑菌活性和拮抗能力均得到显着提高。通过对工程菌JK-SH007E1在杨树体内的定殖规律研究,发现工程菌JK-SH007E1能够以较快的速度进入杨树体内,并能在杨树体内长期稳定地定殖。GFP标记法观察工程菌JK-SH007E1在杨树无菌苗体内的定殖,发现JK-SH007E1在杨树组织细胞内和细胞间隙均有分布。此外,工程菌JK-SH007E1的引入明显增强了杨树的光合作用能力和加快了杨树的生长速度。对工程菌JK-SH007E1、JK-SH007E2、JK-SH007E3和JK-SH007E4的生长特性进行研究,并与野生菌JK-SH007进行比较,结果表明外源基因的导入并未影响原有的菌落特征及细胞形态,但外源重组质粒的导入在一定程度上减缓了宿主菌的生长速度。作为转基因微生物,工程菌JK-SH007E1释放到自然环境中前,必须对其生物安全性进行充分评估。本研究同时利用生物化学法、Biolog生态板法和16S rRNA高通量测序技术,充分评估工程菌JK-SH007E1的引入对杨树根际土壤产生的微生态效应。通过测定杨树根际四种主要土壤酶活性,发现工程菌JK-SH007E1的引入增强了杨树根际的土壤酶活性,尤其是对土壤脱氢酶活性的促进作用尤为显着;同时提高了土壤的肥力,从而促进杨树生长。Biolog生态板分析结果表明,工程菌JK-SH007E1在一定程度上提高了杨树根际土壤微生物的整体活性,丰富了土壤微生物种群及其功能多样性,但随着接种时间的延长促进作用逐渐减弱。16S rRNA高通量测序结果表明工程菌JK-SH007E1的引入会引起杨树根际微生物群落结构发生变化,但该影响会随接种时间的延长而变弱。以上研究结果均表明,从长期来看工程菌JK-SH007E1的应用对杨树根际微生物多样性和种群结构不构成潜在威胁或威胁较小。因此,将工程菌JK-SH007E1释放到环境中是安全可行的。该研究为杨树溃疡病生物防治提供了高效生防菌株,并为今后工程菌JK-SH007E1的安全应用奠定了理论基础。
邱思鑫[5]2004年在《防病、促生植物内生芽孢杆菌的研究》文中进行了进一步梳理番茄、茄子、烟草和辣椒健康植株内生细菌的分离及拮抗菌的筛选结果表明，不同种、品种及植物的不同部位，内生细菌的数量有所不同。不同作物的平均内生细菌数量为1.17×10~3～11.16×10~3cfu／g.FW：各作物植株不同部位中均以果中内生细菌的数量最少，根和茎中的内生菌数量较多。拮抗测定表明，各植物体内均存在对黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumberinum)和番茄青枯病菌(Ralstonia solanacearum)具有拮抗作用的内生细菌：对番茄青枯病菌具有拮抗作用的植物内生细菌占内生细菌总数的比例较低，只有13.7～18.6％，平均为16.4％；而对黄瓜枯萎病菌具有拮抗作用的内生细菌比例较高，为27.1～30.3％，平均为28.3％。 从植物体内分离筛选出168株对黄瓜枯萎或番茄青枯病菌能形成明显抑菌带或抑菌圈的拮抗细菌，再从中筛选出19株对辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)有较好拮抗作用的菌株，其中2号、13号、20号、TL6、TMS2、TB2和QEL17个菌株对以上叁种病原菌都有一定的拮抗作用。从拮抗辣椒疫病菌的菌株中筛选出20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8等6菌株对番茄有较好促生作用，对辣椒采后果实疫病有一定控制效果，且能进入番茄和辣椒体内的菌株。经鉴定，6株有抑菌、促生作用的内生细菌均为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，16S rRNA基因序列分析表明6株菌株均为枯草芽孢杆菌的近缘种，其中TB2用Biolog系统鉴定为解淀粉链芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，EPL8和22号菌株用VITEK-32鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。 防病试验表明，6株内生细菌对辣椒离体果和幼苗疫病均有一定的防治效果，生防菌菌液处理可延迟发病、抑制病害扩展速度。浸种处理的苗接种辣椒疫病菌后20 d防病效果可达17.8～74.6％；浸种处理的苗接种辣椒疫病菌时再用菌液灌根处理后20 d防病效果可达30.8～80.4％；菌液喷雾处理的果接种病菌后10 d防病效果可达53.5～82.9％。另外，不同菌株对黄瓜枯萎病也有一定的防治作用。多数生防菌菌液处理的果和苗在接种生防菌1～2 d后再接种疫霉病菌的防病效果好。其中TB2菌株对辣椒疫霉引起的辣椒苗和果疫病有良好的防治效果，菌液浸种处理的苗接种病菌后20 d防病效果可达70.0％；菌液浇灌后48 h的苗接种病菌后20 d防病效果可达88.1％：菌液喷雾处理的果接种病菌后14 d防病效果可达65.2％。喷雾或浇灌菌株培养液后间隔24 h以上接种病原菌的防病效果比两者同时接种时高。生防菌菌体及其胞外分泌物均有防病作用，其胞外分泌物的速效性较好，菌体的持效性较好。 盆栽试验测定菌株对植物生长的影响表明，20号、22号、TL6、TB1、TB2和EPL8 6菌株对小白菜均有明显的促进生长作用，其中TB1、TB2对辣椒和烟草也有一定的促生作用。内生细菌可促进植物根和茎叶的生长，增加植株的鲜重和干重。 以抗利福平标记和拮抗病原真菌抗性为标记的内生性测定表明，6株菌株均能进入福建农林大学博_l:学位论文番茄、烟草、辣椒和茄子体内，其中以具有较好防病效果的菌株TBZ、TL6和20号菌株在作物体内定殖菌量较大;不同内生细菌在植物体内的定殖与其宿土来源有一定的关系、多数菌株在原宿主上的定殖菌量相对较多。浸种、灌根及涂抹叶片等方法接种后均能使TBZ菌株进入辣椒、烟草和番茄体内，TBZ菌株在室内和田间测定均能主动进入辣椒和烟草体内定殖，并从根部往茎叶组织传导。 防病机理测定结果表明，TBZ菌株胞外分泌物对病菌菌丝生长、抱子囊形成和游动抱子释放均有明显的抑制作用。菌液可诱导植物O犷及抗性相关酶的变化，在菌液与病菌同时接种于辣椒果时诱导作用可相互影响。疫霉菌处理可使辣椒果的丙二醛(MOA)含量和过氧化物酶(P oD)、超氧化歧化酶(S OD)、过氧化氢酶(CAT)活性出现明显的峰值;菌液处理也可诱导辣椒超氧化歧化酶500、CAT和POD活性增强;但菌液与病菌共同处理后，辣椒果的MOA含量和SOD、POO以及CAT的活性均较低，与清水对照接近，表现出一种相对稳定的状态。菌液处理后辣椒苗体内O犷产生速率及SOD、CAT和POD的活性均会上升，之后又下降，其中O厂产生速率和500的活性在Zd以后均比清水低;而队L酶的活性则在菌液处理后一直比清水对照低。在菌液处理ld后的苗接种病菌后除队L活性快速提高外，O犷产生速率及SOD、CAT、POD的活性及MDA的含量变化均比接种病菌的处理来得较缓和，体现病菌受到抑制作用。 TBZ对辣椒和烟草体内内生微生物种群影响测定表明，TBZ接入植株体内后对植物固有内生细菌种群结构产生了影响，使体内的拮抗细菌比例大大提高，群体的生态功能发生了变化。 抗菌蛋白研究表明，TBZ可以产生多种具有不同抗菌活性的物质，且会产生可诱导辣椒抗疫病的物质，其中对热稳定、抗紫外线的抗菌物质，经SDs一PAGE、高效液相色谱(HPLC)、MALDI一TOF质谱等检测，是分子量为1030一1123Da和分子量为1421一1543Da的两类小分子脂多肤物质。 利用枯草芽抱杆菌表达载体pUS186将绿色荧光蛋白基因转入野生型TBZ菌株中，构建了含加基因的工程菌，工程菌的拮抗作用与野生菌株相当，但尚未检测到荧光。
郑爱萍[6]2003年在《微生物来源的防病、杀虫相关因子的分离与功能解析研究》文中研究指明微生物可作为研究生物学的理想材料，同时由于具有代谢能力强、功能各具特色、产物多种多样，在农业、医学、食品以及许多工业中的应用也历来受到人们的关注。特别是农用微生物资源，可进行微生物农药、微生物肥料的产业化。随着经济的发展，人们对绿色无公害食品的需求越来越大，化学农药的一些高残留、高毒性、破坏生态环境的特点被认识到，基于此种状况，所以有必要探求新型的生物农药，以期能为保持生态平衡，保护人类的健康，为农业可持续发展打下基础。 本研究在四川生态条件下，针对特有的农用微生物资源，进行了防病、杀虫因子的分离以及结构解析研究，希望能为四川生态条件下微生物源农药的产业化提供条件和理论基础。主要结果如下： 一、农用抗生素的研究 1．从土壤中筛选土壤链霉菌，通过反复纯化，以水稻稻瘟病、水稻纹枯病病原菌作为指示菌，在PDA平板上与病原菌进行对峙培养，共获得150株对病原菌有不同程度抑制作用的链霉菌株。根据对病原菌的抑制效果，共获得4株链霉菌菌株，分别编号为S-21、S-25、S-26、S-34。 2．通过生理、生化检测和形态鉴定，S-21、S-25、S34、S-26菌株分别被确定为Streptomyces flavescens、Streptomyces luteogriseus、Streptomyces lavendularectus、Streptomyces fradiae var．Sichuan。 3．抑菌谱、杀虫谱测定结果表明，菌株对14种病原菌具有不同程度的抑制作用，综合抑制效果，S-26对水稻病害和蔬菜病害病原菌具有比较明显的抑制优势，具有广泛的抑菌谱带，发酵菌液的上清液，饲喂害虫，利用发酵原液作为对照，S2-26、S2-25对于供试害虫具有较好的杀虫效果，特别是S-26处理后，草地蝗虫、十八星瓢虫、螨虫的校正死亡率均在82％以上，最高可达98.2％。 4．发酵液有效成分稳定性的检测结果表明，利用S2-26菌株在普通发酵培养基，收集发酵液，经过120℃30min，分别在PH8、PH6的作用，紫外线照射30min，发酵液与水稻纹枯病原菌拮抗作用，仍然具有强拮抗活性，抑菌圈直径为6.0-5.5cm，与对照差异不明显，表明S2-26的有效次生代谢产物具有稳定的特性。 5．发酵配方和发酵条件实验表明，菌株在碳源为10％淀粉、氮源为2％的花生饼粉，培养条件在28℃条件、转速为250r／min、5％接种量、起始PH为5时、加入优化培养基150ml、一级种子的培养时间为72h、发酵时间为144h的条件下，可以获得最好的抑菌效果，且整个发酵过程中以一次性加入各培养基成分为效果最好。 6．田间试验表明，应用上述优化配方进行发酵，收集发酵菌液，进行大田防治水稻纹枯病，田间防效达到50.2％，高出井冈霉素和清水对照，对茄十八星瓢虫试验表明，对瓢虫的防效达到78.5%。高于清水对照，并对平均结实个数和结实率具有促进作用，高于其它对照。针对编号为S一26的菌株并进行了发酵生物学特性的研究，并经过发酵产物的分离、纯化，通过IH一NMR、1 3C一MR、红外、紫外、质谱、H一HCOSY、H一CCOSY、HMBC等测定了asperufoside、pinoresino、eseuletin、magnolioside、52、536种化合物的结构，通过功能测定，52、S3化合物为功能性化合物，结构解析表明，是一类杀虫、防病的大环内醋类抗生素。经过叁维结构模拟和功能预测，该类化合物可能通过阻断虫体神经信号传导而达到杀虫效果的。二、芽抱类杀虫基因的研究1.本研究在四力}生态条件下，对芽抱杆菌进行分离筛选，共获得279株，经过特异引物 对基因型进行分析，结果表明107株菌株具有明显的多态性2.多态性分析表明，所分析的资源含有4种复合基因型的比例高，对鞘翅目有特异作用 的芽抱杆菌资源最多，聚类分析表明，具有十分多样的基因分布特点。3.通过生理生化检测和形态指标的测定，确定了其中为非Bt芽抱杆菌2、4一14、39、D3 菌株分别为刀acizzusfasrs成osus、刀aeszzus刀rmus、刀aeillus cereos、Baeillus me卯terium菌 类，确定了s、sL、不SS菌株分别为Bacillus thringglensis var tolworthi、Bacillus thringiensis var刀nitimus、Baeillus thringiensis var entomocidus、Bacillus rhingiensis var galleriae4类苏云金芽抱杆菌的分类地位。4.对2种D3、39芽饱杆菌基因进行测序分析、比较，结果表明，cry1Ab类基因与报道 的基因一致，cry1Ac、cry1C类基因与报道的基因核昔酸具有一定的同源性，分别为 87%、89%和78%，氨基酸序列比较:同源性分别为76.5%、79.8%、51%，不同菌株 种类之间cry IA。类之间核昔酸同源性为90%，氨基酸的同源性为85%。5.通过PcR克隆方法获得cry1Ab基因的全长序列。6.通过饲喂、小区实验，测定了菌株的杀虫谱和毒力方程。大田防效测定表明，该类与 所报道的cry基因具有一定同源性的菌株具有比很好的防治效果，最高防虫效果可达 到98%，显着高于对照和Bt悬浮制剂，并显示对鳞翅目、鞘翅目害虫较宽的杀虫谱。7.对cry类基因进行了定位和毒性蛋白质的分离、纯化，同时，还进行生物学特性等方 面的研究。叁、抑菌肤研究1.从黄瓜植株的根围土壤中分离到有拮抗性的细菌100多株。通过对峙法?
李阳[7]2017年在《松树体内菌群对松材线虫侵染响应及Burkholderia pyrrocinia JK-SH007杀虫基因工程菌构建》文中研究指明松材线虫病具有易传播、发病速度快和死亡率高等特点,素有松树―“艾滋病之称”。而松材线虫侵染早期,进行疫树的施药治疗,其治愈率可极大提高。因此,通过对松材线虫侵染早期,松树体内菌群的结构变化进行研究,可为松材线虫早期侵染诊断提供素材,为松材线虫病早期诊断及防治等亟待突破的关键科学问题提供依据。生防菌剂集安全环保、病虫兼治、植物促生等优点于一身,特别适用于植物病虫害的早期生态防控。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)分泌表达的Cry系列蛋白杀虫活性高,将其相关基因导入具有防病促生宿主菌,实现异源高效表达,是构建具有杀虫功能的生防工程菌的主要手段。本论文采用PCR-DGGE微生物菌群分析、同源重组等分子生物学技术,分析马尾松体内菌群对松材线虫侵染早期阶段的响应规律,研究Cry系列基因在抗病促生菌Burkholderia pyrrocinia JK-SH007中的异源表达活性和杀虫活性,为最终构建松材线虫病早期诊断和生态防控体系奠定基础。取得的主要成果如下:(1)同一林区,不同胸径健康马尾松体内的菌群图谱无显着性差异;接种清水对照组和空白组,马尾松体内菌群图谱无显着差异,表明取样机械损伤、试验期间野外条件变化对马尾松体内菌群均无显着影响;(2)随着松材线虫侵染时间的增加,不同胸径马尾松体内菌种类和丰度均呈整体增加趋势,其中内生菌Mucilaginibacter sp.M68C4A和Uncultured bacteriumclone OTU2265随松材线虫侵染时间增加呈正相关性,内生菌Uncultured bacteriumclone MA13809b03和Klebsiella sp.Arv-22-2.8随松材线虫侵染时间增加呈负相关性;(3)松材线虫侵染处理,不同胸径马尾松体内菌群结构变化具有同步和相似性,表明马尾松体内菌群对松材线虫侵染早期具有一致性响应规律;响应规律分析发现,松材线虫侵染第40d和前30d的体内菌群NMDS结构分离显着,为松材线虫病的早期诊断技术开发奠定理论依据;(4)成功构建B.pyrrocinia JK-SH007遗传操作体系,实现Cry218和Cry3a蛋白在JK-SH007中的异源高效表达,两者表达载体均为pHKT2,但Cry218基因的启动子是PrPL,而Cry3a基因的启动子需换成T7,表明Cry系列基因在同一表达系统中所需启动子有所差异,后续可通过置换不同启动子,实现其它Cry基因在上述表达体系中高效表达;(5)Cry218蛋白表达最佳条件:将工程菌(pHKT2-Cry218)接种入含TP~r(50μg/mL)的LB培养基,30℃,200r/min,待菌液浓度OD600=0.8,升温至42℃,再发酵12 h,在该条件下,蛋白表达浓度达到最大值0.25 g/L;(6)生测结果表明,工程菌B.pyrrocinia JK-SH007(pHKT2-Cry218)及(pHKT2-Cry3a)分别获得对二龄家蚕及榆蓝叶甲幼虫的毒杀活性LC_(50=)0.77(0.57-1.04)g/L及0.63(0.48-0.82)g/L。同时实验分别验证对松材线虫也具毒杀活性,然因对照组宿主菌B.pyrrocinia JK-SH007亦表现一定松材线虫的毒杀活性,故工程菌对松材线虫的毒杀机制有待进一步探讨。
戴小枫[8]2003年在《中国植物保护科学技术发展战略研究》文中认为中国农业生物灾害每年造成了巨大损害，常年发生灾害面积超过30亿亩次，损失粮食15％、棉花25％以上，严重制约农产品产量与质量的提高，危及粮食安全、食品安全、生物安全、生态环境保护和可持续发展，研究中国植物保护科学技术的发展战略是一个迫切需要解决的重大问题，具有理论和实践意义。这是一个综合性和专业性密切结合的复杂问题。为此，作者综合运用多学科的多种方法，从植物保护科学技术的不同层面和方向，进行了系统的分析与综合研究。 本项研究是第一次比较系统地探讨21世纪农业发展新时期中国植物保护技术的发展战略问题，重点在以下领域进行了创新性的探索： 一是系统的分析了国际植物保护科学技术发展的趋势：论文以我国植物保护科学技术发展战略为重点，从农业减灾、生态安全、可持续发展和现代高新技术农业应用等多角度对我国农作物重大病虫草灾害的预防与控制技术的发展现状、技术研究与应用面临的问题和挑战，中国与国际先进水平的差距等问题进行了系统的综合分析，对与植物保护技术发展战略密切相关的关键技术领域进行了重点的回顾、总结和评述，对当前国际植物保护技术的发展现状和动态进行了深入的探讨，总结提出了生物技术应用空前加速、数字化发展全面渗透、技术的环保性和效益性要求更加严格、GMO安全性和外来生物入侵预防与控制问题异军突起、“一地多灾”综合灾变机理研究已现端倪、区域性多对象多目标可持续控制势在必行等国际植物保护科学技术发展的趋势和方向； 二是首次提出了中国植物保护科学技术的发展模式和道路：在系统回顾、总结分析国际植物保护科学与技术发展历程的基础上，凝练出带头学科交替拉动和科学革命质变起爆的植物保护科学发展模式，需求牵引的单个技术更迭与科学先导的技术体系综合发展等植物保护技术发展规律，给出了未来中国植物保护科学技术发展“生物技术一马当先，高新技术多点起爆，互作机理核心支撑，4部引擎联合驱动，全面推进植物保护科学技术革命，建立为全面建设小康社会宏伟目标提供支撑的新型植物保护科学技术体系”的模式和发展道路。 叁是综合性地提出了我国植物保护科学技术发展的总体战略、发展目标、优先方向和重点研究内容：重点研究和系统阐述了生物农药、环境相容化学农药、农业转基因安全和危险性外来生物预防与控制研究等“4部引擎”的发展思路、战略、目标，以及植物保护科学技术在基础性工作、基础研究、高技术前沿、关键技术等不同技术层次的重点研究内容，提出了新时期我国植物保护科学技术研究发展的优先方向是有害生物一作物互作机理研究、生物农药创制、环境相容化学农药开发、农业转基因安全和危险性外来生物预防与控制研究等五大领域;针对植物保护科学技术自身特点、发展规律和我国现状，提出了在“预防为主、综合防治”植保方针下，未来植物保护科学技术发展中应始终把握和坚持“4个紧密结合”的原则，即宏观与微观紧密结合，生物技术与信息技术紧密结合，关键技术研究与基础研究、基础性工作紧密结合，前沿高技术与传统常规技术紧密结Z‘ 四是创新性地提出了相应的植物保护科学技术发展的对策与建议: 1.从组织制度和体制创新的角度，提出了把农业有害生物灾害预防与控制问题纳入国家生物安全整体战略的发展新观念，提出了成立农业生物灾害国家管理委员会，建立官方植保官制度，改革我国农林动植物有害生物检疫检验管理体制，建立农业生物灾害公共危机应急控制制度和机制，完善动植物有害生物预防控制测报系统，加强动植物有害生物防灾减灾保障系统建设。 2.从依法治国的角度，在完善和建立国家法律法规体系中，提出新建立“植物检疫与植物保护法”、“官方植物保护官试行条例”、“外来入侵生物预防与控制法”、“国家农业生物灾害预防与控制法”等法规，以及修改和补充“农业法”、 “环境保护法”、“对外贸易法”、“国家公共安全法”、“刑法”等法律法规的相关条款，和有法必依、执法必严等政策建议。 3.从国家产业政策和投资政策的角度，研究提出了坚持农业生物灾害的社会公益性质不动摇、农业科研公益性定位不动摇、农业科研基地国家投资主体地位不动摇、农业科学技术的完整体系不动摇、政府为主体的投入渠道和机制不动摇、坚持政府对公共产品实行积极干预的方针，坚持国家目标与市场目标相结合的原则，用好世贸组织的绿箱政策、改革国家财政对农业科技现有的支持方式、增加国家财政对植物保护技术科研与推广应用的投入等政策建议。 4，在国家科技政策建议中，针对一植物保护科学技术创新能力和保障支撑体系建设，提出了建设“一个中心五大基地”(即植物保护基础研究创新中心、外来生物入侵预防与控制基地、农业应用微生物基因资源与基因改良研究基地、农业转基因产品安全性评价研究基地、新型农药创制基地、有害生物可持续控制技术研究基地为核心的学科体系、创新能力建设)的布局和建议，以此为基础建设以国家植物保护科研基地为核心、区域性植物保护技术创新中心为支撑和网络的国家植物保
张琳琳[9]2007年在《蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达》文中研究说明蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是产生具有重要价值的耐高温α-淀粉酶(α-amylase)的优良菌株。通过对两株蜡样芽孢杆菌(B.cereus905和B.cereus904)分泌的α-淀粉酶酶学性质分析,淀粉酶的最适反应温度为90~100℃,最佳pH范围为6.0~10.0,耐热性和酶活都不依赖Ca2+,酶学性质基本一致,但淀粉酶的分子量有明显的不同。PCR方法分别克隆了B.cereus905和B.cereus904耐高温α-淀粉酶的基因全长(amy905和amy904),并在大肠杆菌中诱导表达,结果显示:amy905基因长度为1761bp,其蛋白分子量约为68 KD;amy904基因长度为1362bp,其蛋白分子量约为55 KD。大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭载体pHP14-promp,内含一段来自B.cereus905基因组的启动子序列,将amy904基因插入该载体,获得了蜡样芽孢杆菌淀粉酶表达载体pHP14-amy904,用其转化蜡样芽孢杆菌B.cereus905,并成功在B.cereus905中表达。工程菌株遗传稳定性实验表明菌中质粒pHP14-amy904的稳定性为94%,生长曲线测定显示,野生菌株与工程菌株生长情况基本相同。本试验构建的工程菌,验证了载体pHP14-promp中来自B.cereus905基因组的启动子能在蜡样芽孢杆菌体内有效启动外源基因,并进行转录与表达。这一研究结果不仅为今后深入研究蜡样芽孢杆菌在定殖时外泌蛋白淀粉酶的作用机理打下了良好的基础,也为今后这些菌株进一步改造为更高效的抗病虫基因工程菌提供了一条可借鉴的思路。
葛米红[10]2008年在《利用内生细菌防治水稻白叶枯病的研究》文中研究说明通过植物组织表面消毒的方法,将来自湖北、河南、山东和福建的一些县市种植的健康水稻植株进行内生细菌的分离,共获得细菌分离物1057株。对水稻不同组织的分离结果表明:不同组织中水稻内生细菌出现的频次不同,茎杆(14.2%)＜叶(21.2%)＜叶鞘(29.0%)＜根(35.6%)。经过温室初筛、温室复筛以及室外复筛等过程,得到4个对水稻白叶枯病具有抑制作用的内生细菌菌株,编号为MB-1-6-6、MB-1-6-5、MB-2-2-4和MB-1-1-102。在室外条件下对水稻白叶枯病的防效分别为69.3%、56.2%、42.1%和36.8%。通过观察形态特征和培养性状,以及测定生理生化性状,并结合16S rDNA序列分析,结果为:菌株MB-1-1-102为微杆菌属(Microbacterium sp.),菌株MB-1-6-5为寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.),菌株MB-1-6-6和MB-2-2-4为肠杆菌(Enterobacter sp.)。平板拮抗试验表明:4个内生细菌菌株对9种植物病原真菌没有拮抗作用,菌株MB-1-6-5对水稻白叶枯菌有微弱的拮抗作用,其它3个菌株对水稻白叶枯菌没有任何拮抗作用。菌株MB-1-6-5对水稻有一定的致病作用。菌株MB-1-6-5对水稻不定根数的发育具有促进作用。在室外条件下测定结果表明:4个内生细菌菌株对稻白叶枯病的防效稳定,平均防效分别为73%～87%。四个内生细菌菌株的菌体(无培养液)对稻白叶枯病有显着的防效(32%～84%)。菌株MB-1-1-102和MB-1-6-5的含菌液(菌体+培养液)对稻白叶枯病的防效分别为77.5%和83.4%,其它两个菌株的含菌液则没有防效。菌株MB-1-1-102和MB-1-6-6的去菌液(除去菌体的培养液)对稻白叶枯病有微弱的防效,分别为30.9%和32.8%,而其它2个菌株的去菌液则没有防病效果。除菌株MB-1-6-5和菌株MB-1-6-6混合显示微弱的防效(23.6%)之外,其它两两菌株组合均没有产生防病效果。结果还表明:以4个内生细菌菌株进行种子处理,对稻白叶枯病具有一定的防效(33%～47%)。上述研究结果对于利用植物内生细菌防治水稻白叶枯病奠定了基础。
参考文献：
[1]. 水稻内生细菌的研究及其杀虫工程菌的构建[D]. 孙惠青. 四川农业大学. 2003
[2]. Bt杀虫基因向水稻内生细菌的转化研究[J]. 刘云霞, 张青文, 周明. 农业生物技术学报. 1997
[3]. Bt杀虫基因vip3A（a）转化芽孢杆菌TB2的研究[D]. 洪鹏翔. 福建农林大学. 2007
[4]. 吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007工程菌构建及其效应研究[D]. 何玲敏. 南京林业大学. 2017
[5]. 防病、促生植物内生芽孢杆菌的研究[D]. 邱思鑫. 福建农林大学. 2004
[6]. 微生物来源的防病、杀虫相关因子的分离与功能解析研究[D]. 郑爱萍. 四川农业大学. 2003
[7]. 松树体内菌群对松材线虫侵染响应及Burkholderia pyrrocinia JK-SH007杀虫基因工程菌构建[D]. 李阳. 南京林业大学. 2017
[8]. 中国植物保护科学技术发展战略研究[D]. 戴小枫. 中国农业科学院. 2003
[9]. 蜡样芽孢杆菌工程菌的构建及α-淀粉酶基因的表达[D]. 张琳琳. 内蒙古农业大学. 2007
[10]. 利用内生细菌防治水稻白叶枯病的研究[D]. 葛米红. 华中农业大学. 2008