冯春芝[1]2004年在《乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制影响的实验研究》文中研究说明探索以基因治疗为主要手段的抗HBV感染治疗的研究是研究热点之一。目前应用于HBV感染基因治疗方案主要有DNA疫苗、核酶、反义核酸、干扰肽及干扰蛋白、Dominant negative突变体(DN突变体)、RNAi等，体外或体内模型上均显示出有效性。但由于病毒变异，上述方法需要不断重复给药，载体的安全性、特异性、高效性和可控性等问题，上述疗法临床应用还有相当一段距离。本研究拟构建一个具有生命体特征的HBV缺陷病毒，以其干扰和抑制HBV的体内复制状况，并通过调节机体对二种病毒的免疫反应，阻断HBV在体内的复制以达到抗HBV感染的目的。 所要构建的HBV缺陷病毒的特征是：其包膜和核衣壳与HBV完全相同，基因组结构中缺失HBV基因组的S基因和Pol基因，保留HBV基因组复制和包装所需的DR1、DR2、C基因和HBV 3’末端序列，并在缺失的部位引入人免疫调节基因表达盒和增强基因组复制的肝特异性增强子序列。 具体实施过程为：制备高表达HBV S基因和Pol基因的包装细胞，为乙肝缺陷病毒的制备作准备；构建含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体，共转染HepG2细胞，ELISA、PCR方法和斑点杂交初步研究乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的影响。 本研究分为叁个部分：一、乙肝缺陷病毒包装细胞制备的初步研究；二、含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体的构建；叁、乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制影响的实验研究。 一 乙肝缺陷病毒包装细胞制备的初步研究 将HBV的Pol基因克隆到逆转录病毒载体pMSCV(neo)和pLNCX2中，将HBV的S基因克隆到逆转录病毒载体pLNCX2中，转染HepG2细胞，G418和Hyg筛选出的高表达Pol基因和S基因的细胞株为制备乙肝缺陷病毒的包装细胞作准备。Western Blot检测到单转染HBV S／pLHCX和共转染HBV S／pLHCX、HBV Pol／pMSCVneo抗性细胞中HBV S基因的表达。RT-PCR检测到HBV Pol基因的表达，SDS-PAGE电泳结果未显示阳性细胞与空载体转染及未转染的人肝癌细胞SMMC7721相比有阳性表达条带。P蛋白克隆表达的难度阻碍了筛选出的高表达Pol基因的细胞株为制备乙肝缺陷病毒的第二军医大学硕士学位论文中文摘要包装细胞作准备的工作。因此我们改变了策略，依然利用缺陷抑制这一思路探索乙肝病毒的基因治疗。构建含乙肝缺陷病毒基因组的逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体，来研究乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的影响。 二含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体和含乙肝病毒基因组的重组逆转录病毒载体的构建 Z‘肝缺陷病毒基因组(1550~2550+850~2050)包含HBVC基因片段(包含HBV基因组复制和包装所需的序列DRI、DRZ)和HBVX基因片段(HBV3’末端序列)而缺失了S基因(2848~3215~837)和Pol基因(2390~3215~1625)。 扩增能转录出HBVC基因片段(包含HBV基因组复制和包装所需的序列DRI、DRZ)和HBvx基因片段(HBv3’末端序列)，本别克隆到pMD18一T为中间载体二EeoRI/Salx消化HBvC/P MD一1 ST，Sall/Hpal消化HBV X/pMD一1 ST，回收HBV基因片段与EcoR 1/ Hpal酶切的pMscVne。载体连接，构建含乙肝缺陷病毒基因组的重组逆转录病毒载体HBV CX/PMSCVneo。 设计引物，扩增HBv基因组中1 550一2050~3210~2050的3700bP片段(长于HBv全长基因soobp(1550~2050一3210一1550))，以pMnls一T为中间载体，克隆到逆转录病毒载体pMscvneo，构建重组逆转录病毒载体HBv/P MSCVne。。在HBV全长基因500bp处的移码突变通过重迭PCR来纠正。 叁乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制影响的实验研究 将HBVC刀pMSCVneo和HBV/pMsevneo共转染HepoZ细胞，并设立空白对照，转染空载体和单转染HBv/P MSCvneo细胞对照，初步研究乙肝缺陷病毒基因组对HBv复制的影响。ELISA检测到转染细胞及上清中存在HBsAg，但单转染组与共转染组中的HBsAg量无显着性差异。抽提单转染组与共转染组细胞上清液中的病毒DNA，严格设置对照，半定量PCR结果显示乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的抑制率为0.461;斑点杂交结果显示乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制的抑制率分别为0.3 12、0.404、0 .232。第二军医人学硕_I:学位论文中文摘要 本研究表明乙肝缺陷病毒基因组对HBV复制存在抑制作用。构建乙肝缺陷病毒的工作虽然存在难度，但通过制备乙肝缺陷病毒治疗HBV感染的构想是可行的。为下一步制备乙肝缺陷病毒及研究乙肝缺陷病毒对HBV复制的影响打下了基础。
胡纯彰[2]2010年在《泽泻醇B乙酸酯抗乙肝作用及机理研究》文中指出由乙型肝炎病毒引起的肝炎是一种严重危害人体健康的病毒性传染病。据世界卫生组织报道,全球有超过20亿人为乙型肝炎病毒携带者,其中约3亿人为慢性终身感染者。而我国的乙肝患者就约占了一半,直到2008年我国乙肝表面抗原携带者约有9300万人。于此同时每年仍约有200万新发肝炎病人,其中乙型肝炎占20%。与非乙肝病毒携带者相比,慢性肝炎感染患者面临较高的肝硬化或癌变的风险。目前在尚未找到能彻底根治乙肝的方法同时,由于近年HBV免疫疫苗、各种抗病毒药物的应用而导致HBV变异株的出现,使HBeAg阴性慢性乙型病毒性肝炎患者(CHBV)增多。而在最新的科学研究中,研究人员发现在感染病毒的肝细胞核内存在的病毒共价闭合环状DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA),是病毒持续感染久治不愈的重要原因。因此科学研究者在研制不同类型的临床治疗药物的项目上着重研究药物对乙肝病毒cccDNA的影响,希望能够找到直接可以清除病毒cccDNA的药物,让乙肝病人痊愈成为现实。HBV复制大约分别四个阶段：(1)乙肝病毒颗粒首先与细胞膜上的受体羧肽酶D结合,脱去外膜进入细胞内；(2)在经衣壳蛋白的磷酸化作用后脱去衣壳,乙肝病毒进入细胞内,并在细胞内转变成超螺旋DNA结构(cccDNA)。超螺旋DNA是HBV的转录模板,它可转录mRNA,也是造成乙肝病毒无法清除的重要原因之一；(3)在mRNA指导作用下病毒先合成前基因RNA,并在细胞核外被衣壳包裹,然后再以前基因RNA为模板,在细胞核外经逆转录合成乙肝病毒DNA负链,随后合成乙肝病毒正链；(4)衣壳中的乙肝病毒由膜包裹后分泌到细胞外以完整的病毒颗粒进入到其它细胞,也可重新脱去衣壳进入细胞核内,以维持细胞核内病毒超螺旋DNA(cccDNA)的数量。因此每个病毒复制的步骤都是研究抗乙肝病毒的关键,只要阻断病毒的复制过程就可以有效地抑制病毒的增殖。经过大量的研究,乙肝病毒对肝细胞并无直接致病性。相反由乙肝病毒所引发的肝细胞损害的机制主要是由细胞免疫反应所引起的。在HBV感染过程中,先由单核巨噬细胞摄取病毒抗原并加工,然后提呈给Th细胞。然后在单核巨噬细胞释放的白细胞介素1(IL-1)协助下,促使Th细胞活化增殖而释放白细胞介素2(IL-2)。IL-2刺激已被HBV抗原致敏的Tc细胞发生克隆性增殖,形成大量效应性T细胞,攻击受HBV感染的肝细胞,最后导致肝细胞变性坏死。目前认为, Tc细胞攻击靶细胞需依赖所谓“双识别”,即只有表达靶抗原和Ⅰ类MHC抗原的肝细胞,才可能被Tc细胞识别、攻击和破坏。而肝细胞凋亡、HBV感染等多种因素所致的肝细胞损害,其最终表现也是肝细胞死亡。本实验以乙肝病毒感染机制、慢性乙肝与cccDNA关系的研究为基础,研究实验药物泽泻醇B乙酸酯对乙肝病毒HBV的抑制作用及其作用机制。泽泻为泽泻科植物泽泻的块茎,性味甘、淡、寒,归肾、膀胱经,是利水渗湿用药,主要用于小便不利、水肿胀满、泄泻、尿少、痰饮、眩晕、热淋涩痛等症。泽泻的化学成分比较复杂,而泽泻醇B乙酸酯属于叁萜化类合物。在有关泽泻醇B乙酸酯的研究中,学者们发现泽泻醇B乙酸酯具有多种生物活性：(1)诱导多种肿瘤细胞凋亡；(2)逆转P糖蛋白过表达癌细胞的多药耐药性,提高细胞对抗肿瘤药物的敏感性；(3)抑制抗体过敏性反应；(4)抑制细胞中氮氧化物(NO)的合成反应；(5)抑制乙肝病毒抗原活性,等等。因此泽泻醇B乙酸酯在抗病毒方面具有很大的潜力。在本实验过程中,通过体外、体内实验平行检测泽泻醇B对病毒DNA的影响、对病毒cccDNA的影响从而探索泽泻醇B乙酸酯抗乙肝病毒的机制。在实验中,泽泻醇B乙酸酯在2.215细胞和鸭胚肝细胞上的对病毒的抑制作用并不一致。在2.215细胞上,泽泻醇B乙酸酯的TC50为23.71mmol/L,而在鸭胚肝细胞上的TC50为25.62mmol/L。泽泻醇B乙酸酯在HepG2.215细胞上对病毒两抗分泌的治疗指数分别为1.15、0.74,提示在HepG2.215上泽泻醇B乙酸酯对乙型肝炎病毒表面抗原分泌的抑制作用是在对细胞的毒性作用基础上发挥的,而对病毒的e抗原则无抑制作用。在先天DHBV感染鸭胚原代肝细胞上,泽泻醇B乙酸酯对病毒DNA的治疗指数可达到4.08,则显示出较好的抗病毒作用。在体内实验中,泽泻醇B乙酸酯对病毒的DNA和肝组织中的cccDNA也有一定的抑制作用。通过本实验的初步结果间接提示了泽泻醇B乙酸酯需要经过体内代谢的活化作用才能发挥药物的抗病毒作用。
李玉佳[3]2017年在《ISG15/USP18信号通路在乙肝病毒耐受干扰素中的作用及机制研究》文中研究指明研究背景和目的:由乙肝病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染引起的乙型肝炎是严重的世界性公共卫生问题之一。目前全球范围内约有2.4亿慢性HBV感染者,每年有近70万人死于HBV感染相关的疾病。在抗乙肝病毒治疗中,I型干扰素是各肝病研究学会推荐的一线药物之一,但仍然存在着病毒耐药等亟待解决的问题,而其具体耐药机制尚不完全明确。1型干扰素作为固有免疫系统的重要成员,具有广谱抗病毒作用和重要的免疫调节功能,干扰素刺激基因是其发挥作用的最终效应分子。本团队前期研究表明,干扰素治疗前慢性乙肝患者肝组织内位于同一信号路上的两个干扰素刺激基因 ISG15(Interferon stimulated gene 15)和 USP18(Ubiquitin specific peptidase 18)的细胞表达特异性与疗效有关:治疗有效者中,ISG15/USP18主要在肝脏巨噬细胞(Kupffer细胞)中高表达,而治疗无效者中则主要在肝细胞中表达。在慢性丙肝患者中也有类似现象。动物实验显示,USP18敲除小鼠巨噬细胞主要为M2型,与野生型小鼠体内巨噬细胞主要为M1型截然不同。ISG15敲除小鼠巨噬细胞吞噬功能受到抑制,提示ISG15/USP18信号通路与巨噬细胞表型和功能密切相关。这些研究结果表明该信号通路在调节宿主固有免疫(影响干扰素抗病毒活性及巨噬细胞极化和功能)及肝炎病毒耐受干扰素导致持续感染中发挥着重要作用。本课题旨在从如下几个方面明确ISG15/USP18信号通路在乙肝病毒感染中的作用:1)ISG15/USP18信号通路对乙肝病毒复制的影响;2)ISG15/USP18对巨噬细胞极化和功能的影响;3))不同表型巨噬细胞(MI/M2)对肝细胞中干扰素信号通路的影响。为进一步阐明乙肝病毒慢性化过程及其耐受干扰素的机制寻找证据,并为筛选潜在的新型乙型肝炎治疗药物靶点提供理论支持。实验方法:1.通过转染高表达质粒,在能够产生感染性乙肝病毒颗粒的HepG2.2.15细胞中高表达ISG15、USP18或无酶活性的USP18-C64S,通过real-time PCR,western blot及ELISA等方法检测HBV复制情况;2.通过转染高表达质粒,在THP-1来源的M0巨噬细胞中高表达ISG15或USP18,然后诱导细胞极化。通过real-time PCR,流式细胞术,乳胶微粒吞噬实验,中性红摄取实验等,检测ISG15/USP18对巨噬细胞标志物(细胞因子、酶及表面分子等)表达、活性氧化物产生、吞噬功能以及胞饮功能的影响。3.(1)将从USP18基因敲除小鼠及野生型小鼠分离到的腹腔渗出巨噬细胞(M1型和M2型)分别与野生型小鼠的原代肝细胞通过transwell系统进行共培养,在共培养后不同的时间点收集培养基上清,ELISA检测上清液中代表性M1/M2型细胞因子的表达情况。同时使用干扰素刺激肝细胞,real-time PCR检测肝细胞中干扰素刺激基因的表达情况,评价肝细胞对干扰素刺激的反应(敏感性)。(2)使用氯膦酸二钠脂质体特异性地清除野生型小鼠体内的巨噬细胞(M1型),然后通过尾静脉注射的方式用从USP18基因敲除小鼠分离到的腹腔渗出巨噬细胞(M2型)对其进行外源性巨噬细胞置换。通过LPS制造炎性微环境激活置换的巨噬细胞,然后经由腹腔注射干扰素,评价小鼠肝组织对干扰素刺激的反应:ELISA检测小鼠血清中代表性M1/M2型细胞因子的表达;real-time PCR检测肝细胞中干扰素刺激基因的表达;HE染色及血清酶学检测评价小鼠肝脏炎症水平。结果:1.高表达ISG15或USP18以剂量依赖的方式促进HepG2.2.15细胞培养基中HBVDNA的表达,但对细胞内总HBVDNA、cccDNA、pgRNA、HBcAg及培养基中的HBeAg和HBsAg没有明显影响。siRNA抑制ISGylation所必需的E1激活酶UBE1L的表达之后,ISGylation水平明显下降,ISG15对HBV的这种促进作用也随着消失;而与野生型USP18相比,无酶活性的USP18C64S对HBV有着类似的作用。高表达ISG15或USP18能够促进部分干扰素刺激基因的表达,但是对内源性Ⅰ型干扰素的表达没有明显影响。2.在PMA诱导分化的MO THP-1巨噬细胞中高表达ISG15或USP18都能够促进M1型巨噬细胞标志物的表达、抑制M2型标志物的表达,降低巨噬细胞对中性红溶液的摄取、降低ROS的表达,并抑制巨噬细胞对荧光标记乳胶微粒的吞噬。3.(1)USP18基因敲除小鼠腹腔渗出巨噬细胞主要表达M2型细胞因子(GM-CSF以及IL-10),而野生型小鼠腹腔渗出巨噬细胞主要表达M1型细胞因子(TNF-α及IL-12)。I型干扰素刺激后,与USP18基因敲除小鼠腹巨噬细胞共培养的肝细胞中干扰素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表达明显高于对照组。(2)与对照组相比,进行了 USP18基因敲除小鼠巨噬细胞置换的野生型小鼠血清中M2型细胞因子表达水平更高;在Ⅰ型干扰素刺激下,实验组小鼠肝组织中干扰素刺激基因Mx1、ISG15及USP18表达明显更高;HE染色显示,LPS处理并不导致严重炎症反应,但血清酶学显示,LPS处理会对肝脏功能造成一定损伤,而巨噬细胞置换能够逆转LPS引起的小鼠ALT和AST的升高。结论:1.ISG15/USP18的高表达对HepG2.2.15细胞中HBV的产生有促进作用,这种作用与ISGylation有关,而不依赖于USP18的酶活性及内源性干扰素信号通路。2.高表达ISG15或USP18能够促进PMA诱导分化的MO THP-1巨噬细胞向M1型极化,抑制巨噬细胞吞噬、胞饮及ROS产生等功能。3.M2型巨噬细胞很可能通过释放细胞因子、调节炎症微环境的方式提高肝细胞对Ⅰ型干扰素的敏感性。综上所述,ISG15/USP18信号通路至少可能通过两种不同的机制造成HBV耐受干扰素,并有利于HBV持续感染:1)ISG15/USP18在肝细胞中高表达时,以不依赖于内源性干扰素信号通路的方式促进肝细胞中HBV的产生(释放);2)ISG15/USP18在巨噬细胞中相对低表达时,巨噬细胞主要为M2样表型,以分泌细胞因子调节肝细胞周围微环境的方式,造成在干扰素治疗前便出现Ⅰ型干扰素信号通路的过度激活,导致对干扰素治疗的耐受;反之,ISG15/USP18在巨噬细胞中相对高表达时,巨噬细胞主要为M1样表型,不会造成I型干扰素信号通路的过度激活,表现为对干扰素治疗敏感。
生春雨[4]2017年在《利用腺相关病毒介导CRISPR-Cas9抑制HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制的研究》文中进行了进一步梳理乙型肝炎是由乙肝病毒(HBV)感染引起的一种传染性疾病。根据世界卫生组织的报道,全球约有2.4亿的乙型肝炎慢性感染者(乙肝表面抗原阳性持续至少6个月),每年有超过68.8万人死于慢性乙肝的并发症,包括肝癌和肝硬化。乙肝疫苗的应用虽能预防乙型肝炎病毒的传播,但对于乙型肝炎的治疗仍然面临诸多问题。一般认为,彻底清除宿主细胞内乙肝病毒共价闭合环状DNA(HBV cccDNA)是治愈乙肝的标准,然而目前常用的各种抗病毒疗法均未能实现这一目的。最近出现的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9系统,因可以对任何物种基因组进行DNA的定点编辑且较先前的基因编辑技术更为简单、快捷、高效,已为诸多难以实现根治的病毒性感染、遗传病以及染色体缺陷等疾病的治疗带来了曙光。截至目前,包括本课题组在内的前期研究均已成功利用CRISPR-Cas9系统在HBV细胞模型及HBV高压水动力小鼠模型中实现了对HBV复制与表达的高效抑制,从理论上证明了CRISPR-Cas9在清除乙肝病毒感染上的巨大应用价值。然而在对于相比以上模型更接近临床患者的体内模型HBV转基因小鼠来说,已有的方法均未取得明显的效果,主要是由于缺乏高效安全的基因转运载体。目前广泛使用的CRISPR-Cas9系统为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-SpCas9,这种CRISPR-SpCas9系统虽能利用慢病毒或腺病毒作为基因转运载体,但这些载体病毒过高的免疫原性及易整合至宿主细胞基因组等缺陷大大限制了CRISPR-Cas9技术在基因治疗上的应用。新型重组腺相关病毒载体(Recombinant adeno-associated virus,rAAV)虽然被认为是最理想的基因治疗载体,但CRISPR-Cas9系统中的SpCas9及必需控制元件的体积(7kbp)超过了rAAV的容量(4.5kbp),并不能利用rAAV包装完整的CRISPR-Cas9系统。2015年5月,美国麻省理工大学的张峰实验室发现了一种小型化的产自金黄色葡萄球菌的CRISPR-SaCas9(Staphylococcus aureus Cas9)系统,并成功利用rAAV介导该系统在体内对相应基因进行编辑。本次研究旨在利用重组腺相关病毒(rAAV)介导CRISPR-SaCas9系统(rAAV::CRISPR-SaCas9)实现对HBV转基因小鼠体内HBV的复制与表达的高效抑制。同时进一步探究rAAV8::CRISPR-SaCas9系统在HBV转基因小鼠体内抑制HBV复制与表达过程中的有效剂量、持续时间、抑制效果、对HBV DNA的剪切效率、脱靶效应以及对动物可能造成的相关损伤等方面的问题。1.筛选适用于CRISPR-SaCas9系统的高效HBV靶点本课题组在前期的研究中成功利用CRISPR-SpCas9抑制了HBV细胞模型及HBV高压水动力小鼠模型中HBV的复制与表达。然而,与CRISPR-SpCas9靶点需要的PAM限制基序“NGG”不同,CRISPR-SaCas9靶点需要的PAM基序为“NNGRRT”。在缺乏gRNA靶点预测工具的情况下,我们需要对靶向HBV的靶点进行设计筛选。(1)建立新的HBV靶点设计方法为了得到适用于不同HBV基因型的SaCas9高效靶点,我们首先选取了26种不同基因型不同地区来源的HBV(A-G),并对这些不同类型HBV的基因组进行序列比对。再利用Vector NTI Advance 11.5.1软件在高度保守基因区域的正负双链查找出含PAM基序“NNGRRT”的位点。通过以上步骤,我们共找到21个符合要求的靶点。(2)靶向HBV高效靶点的筛选我们根据筛选出的靶点分别构建了21套相应的CRISPR-SaCas9表达载体,并将这些载体与含有HBV基因组的表达载体共转入293T细胞中,通过对细胞上清中的HBV抗原及HBV DNA的含量的检测及细胞活性的测定,分别评估带有不同靶点的CRISPR-SaCas9系统对HBV的抑制效率及对细胞活性的影响。经过上述筛选,我们得到了对HBV抑制效率最高且对细胞活性没有影响的gRNASa4系统。此外我们通过T7EI酶切证实了含有该系统对细胞内HBV DNA的剪切。2.利用rAAV8::CRISPR-SaCas9系统高效抑制HBV转基因小鼠体内HBV的复制与表达(1)利用VIII型重组腺相关病毒包装CRISPR-SaCas9系统不同血清型别的腺相关病毒具有不同的组织嗜性,其中VIII型重组腺相关病毒(rAAV8)可以特异地感染肝组织,对其他组织脏器的感染效率较低。为尽可能减少CRISPR-SaCas9系统对小鼠体内其他器官的影响,本研究选择VIII型重组腺相关病毒(rAAV8)对CRISPR-SaCas9系统进行包装。我们通过向HEK293细胞中同时转染CRISPR-SaCas9表达载体、包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper,成功将带有高效靶向HBV靶点的CRISPR-SaCas9系统包装入rAAV8病毒中。用氯仿纯化法提纯收集到的病毒,根据点杂交实验结果,纯化后的病毒滴度达1×1012v.g./mL以上。(2)HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制的评估经DNA测序及血清学检测,本研究所用的HBV转基因小鼠体内整合有1.28倍HBV全长基因组,血清中HBsAg的含量达到4,000-6,000 IU/m L,HBe Ag的含量达到800-1,000 S/CO,HBV DNA含量超过108v.g./m L,并且可以在肝组织中检测到HBcAg的表达。(3)低剂量rAAV8::CRISPR-SaCas9的抑制效果评估根据已有文献,我们首先测试了低剂量rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒(5×1010v.g./只)对4-6周龄雄性HBV转基因小鼠体内HBV的抑制效果。通过对病毒复制和表达的各项指标进行连续的监测结果显示,该剂量的rAAV8::CRISPRSaCas9病毒并不能有效抑制HBV转基因小鼠体内HBV的复制和表达。(4)高剂量rAAV8::CRISPR-SaCas9抑制了小鼠体内的HBV的复制与表达在我们将rAAV8::CRISPR-SaCas9病毒剂量提高至2×1011v.g./只后,实验组小鼠血清中HBV标志物的含量出现持续下降:在连续两次注射后的第38天,实验组小鼠血清中HBsAg、HBe Ag的含量相比对照组分别下降62.96±7.59%和65.18±3.08%;血清中HBV DNA的含量相比对照组下降92.82±3.67%;通过对肝脏切片HBcAg免疫荧光结果的分析,我们发现全景扫描照片可以看出实验组HBcAg的荧光强度显着低于对照组,实验组肝组织中HBcAg的含量相比对照组下降76.88±18.39%,;通过肝组织病理学检测,我们在对照组小鼠肝组织中观察到了明显的炎性浸润和肝细胞肿大,然而实验组小鼠肝组织中却未观察到相应的炎性病理改变。通过T7EI酶切以及深度测序,我们证实了rAAV8::CRISPR-SaCas9对HBV转基因小鼠肝脏中HBV基因组相应区域的剪切作用。此外,小鼠其他脏器的病理学检测均未出现任何病理改变。本次研究也未能检测到rAAV8::CRISPR-SaCas9的脱靶效应。综上所述,我们筛选出了适用于小型化CRISPR-SaCas9系统的HBV高效靶点,并首次利用CRISPR-SaCas9系统实现了对HBV转基因小鼠体内HBV DNA复制与表达的高效抑制。本次研究扩展了CRISPR-Cas9技术在抗病毒领域的应用范围,也为今后利用CRISPR-Cas9基因编辑技术开展慢性乙肝的基因治疗提供理论依据和技术支持。
赵翎皓[5]2016年在《乙肝病毒（HBV）对于肝癌宿主基因组的插入整合及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在全世界范围内均位居发病率最为普遍的恶性实体肿瘤前列,其在全球范围内的癌症发病率中高居第五,并且其肿瘤导致的相关死亡率在所有肿瘤相关致死率相关统计中高居第叁。在许多发展中国家,原发性肝癌往往在晚期才被诊断出来并且此时的切除手术的疗效极其有限。原发性肝癌的发生率在全球范围内具有显着的地理分布及人种差异,并且还具有显着的性别差异存在。相比于白色人种,原发性肝癌的发病率及死亡率在亚洲人尤其的高。为我们所熟知的是,在世界范围内尤其在某些特定地区慢性乙型肝炎病毒(HBV)的感染是密切参与并推进原发性肝癌发生及进一步恶性发展的主要危险因素,在中国,超过80%的肝癌患者均同时伴有乙型肝炎病毒的感染。研究证实,乙型肝炎病毒的基因组DNA可以整合到宿主基因组中并且被认为是乙肝病毒诱发肝癌的主要原因之一。最近有越来越多的研究证据提示乙肝病毒对于宿主基因组的整合作用密切参与肝脏肿瘤的发生。这些乙肝病毒的整合能够诱导宿主基因拷贝数变化(CNV),染色体变化,亦或是宿主基因的表达变化。有研究报道乙型肝炎病毒更为倾向于整合入宿主肿瘤基因组中的热点靶向基因TERT,FAR2,MLL4之中。而与此同时也有其他的研究报道称乙型肝炎病毒往往更倾向于整合入相邻非肿瘤组织基因组的靶向基因FN1和SMAD5之中。.可见之前多篇关于乙肝病毒整合的研究报道之间存在较大的争议,而目前我们也并不知道造成这种差异的内在原因是什么。但是,通过比较我们发现既往相关研究还是存在较大的不足,其研究队列的肝癌样本数目较为有限,同时其检测乙肝病毒整合的技术也不够理想,并且我们认为目前发现的乙型肝炎病毒相关性肝癌关键基因的检测还远远没有系统完成。因此,我们认为针对乙肝病毒整合这个研究方向有必要采取进一步努力和探索,不仅为了确认既往的调查结果,更重要的是,更深入的探索那些重要的乙型肝炎病毒整合易感基因位点。相较于女性,男性患者原发性肝细胞癌的发生率显着更高。最近,大量的研究将重点放在研究性别因素和肝癌发病率以及其临床特征之间的内在关系上。Huang et al报道,乙型肝炎病毒相关的肝癌中男性比女性具有更高的发病风险并且男女患者会显示出不同临床特点。Hou et al报道,原发性肝癌不同的性别差异会使得肿瘤内部在分子水平上也各不相同,最终导致截然不同的分子表型。乙型肝炎病毒整合入人类基因组目前被认为是原发性肝癌癌变过程的一种早期事件。然而,目前没有一项研究报告将重点关注在乙肝病毒整合与性别因素的内在联系上。目前乙型肝炎病毒(HBV)已被鉴定出具有八种基因亚型(A-H)。多个研究小组报告,乙肝病毒不同的基因亚型其感染流行分布有明显的地理差异,并已被证明在临床疗效、患者预后生存及抗病毒治疗反应性等多个方面均存在显着的不同。在亚洲,最流行的乙型肝炎病毒基因亚型是基因亚型B和C。然而,目前没有一项研究报告将重点关注不同乙肝病毒亚型其基因组整合特性的差异。原发性肝癌患者绝大多数均伴有肝脏的肝硬化,但同时也有一部分肝癌患者并不经过长期的肝硬化阶段而直接进展成瘤。在全球,至少叁分之一的肝硬化是由于慢性乙型肝炎所致,并且慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染的患者中显着一部分最终会进展成为原发性肝癌。大量研究表明肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之间存在着显着的临床和病毒学特征差异。然而,我们发现以往的大多数研究并没有特别区分肝癌患者的肝硬化和非肝硬化情况,此外,肝硬化肝癌和非肝硬化肝癌之间的乙型肝炎病毒整合特性差异目前仍然未知。以往关于乙肝病毒整合的研究多采用southern blot或是传统PCR技术,其技术局限性也很大程度上制约了以往研究的发现,使其无法系统全面的解析宿主基因组中乙肝病毒的整合断点。在乙型肝炎病毒基因组中含有大量的突变,这会导致PCR检测失败。即便使用全基因组测序技术(WGS),乙型肝炎病毒整合断点的检测的灵敏度其实也远远达不到理想的程度。为了解决实际的技术问题,我们的研究参与人员已经开发了一种全新的实验和计算方法,即高通量乙肝病毒整合靶向检测技术(HIVID)。通过实验已经证明,对于识别乙肝病毒整合位点这种全新的靶向检测技术比全基因组测序方法(WGS)更为灵敏。为了解决上述种种关于乙肝病毒整合的科学问题并进一步理解乙肝病毒整合参与肝癌发生发展的具体影响机制,我们系统收集了在我院进行肝癌切除手术的426例病人的配对肿瘤和相邻非肿瘤对照组织,提取其基因组后进行了HIVID的检测。研究入组的426例病毒均经过严格的临床和病理学验证证实其为原发性肝癌肝细胞型。并且我们随机选择12个肿瘤样本进行了转录组测序(RNA seq),以进一步研究其转录水平的变化。本研究旨在探讨乙肝病毒整合在原发性肝癌发生发展中的具体作用及机制,加深我们对于乙肝病毒整合作为肝癌恶性转化及浸润重要作用的了解,为今后乙肝病毒整合研究成果向临床进一步应用转化提供重要的理论依据。实验方法:(1)我们系统了收集426例临床肝癌病人的肝癌及癌旁组织样本进行HIVID检测,以系统全面研究乙肝病毒HBV在肝癌及癌旁组织基因组中的整合特性及其分布。(2)HIVID技术方法验证:通过随机方法挑选出了检测到的60个整合断点进行PCR以及Sanger测序验证。(3)通过肝癌肿瘤及癌旁组织分组进行断点整合谱差异比较。(4)研究全新发现的高频乙肝病毒整合基因转录组水平功能变化:实时定量聚合酶链反应实验(realtime-PCR)。(5)研究全新发现的高频乙肝病毒整合基因蛋白水平功能变化:免疫组化染色实验(IHC)。(6)研究在肿瘤组织中乙肝病毒整合对于其特异性富集信号通路m TOR signaling pathway蛋白水平功能变化:免疫组化染色实验(IHC)。(7)研究肿瘤组织内乙肝病毒整合在转录组水平上的保留及其功能变化:随机挑选了12个含有HBV病毒整合的肿瘤组织进行转录组测序(RNA-seq)实验。(8)研究HBV-DNA在体内的复制与其整合特性内在相关性:HBV-DNA检测试剂COBAS。(9)研究病毒整合的克隆性问题以及验证HIVID检测出的HBV整合断点的可靠性及灵敏性:选取了10个同时具备HIVID及RNA-seq数据的患者的肿瘤组织进行了全基因组测序(WGS)。(10)研究乙肝病毒整合与原发性肝癌临床特征之间的内在相关性及差异:HBV B型VS HBV C型乙肝病毒整合差异,肝硬化肝癌VS非肝硬化肝癌乙肝病毒整合差异,男性患者肝癌VS女性患者肝癌乙肝病毒整合差异。实验结果:(1)在肿瘤组织中一共发现了3486个HBV病毒整合断点,而在对应的癌旁组织中739个HBV病毒整合断点。HBV病毒的总体整合率为76.9%。配对的癌旁对照组织中,HBV病毒的整合率则仅为37.3%。(2)在60个随机挑选的断点中成功验证出52个整合断点存在,并且序列一致,总体验证率为86.7%。(3)HBV病毒在肝癌宿主的肿瘤组织及癌旁组织基因组中的整合分布及整合特性是具有较为显着的差异。在肿瘤组织中,HBV病毒可见高频整合于TERT,KMT2B,CCNE1等一系列基因,在癌旁对照组织中,HBV病毒则高频整合于FN1,PTPRN2及TERT等一系列基因中。(4)在肿瘤组织中,HBV病毒整合靶向基因在m TOR signaling pathway癌症相关通路上有所富集。免疫组化结果进一步证实,HBV病毒的整合可以影响m TOR信号通路在蛋白水平的激活状态。(5)针对肿瘤及癌旁组织中发现全新的高频HBV病毒靶向整合基因包括:PTPRD、UNC5D、NRG3、CTNND2、AHRR,通过IHC及realtime-PCR实验证实,HBV病毒整合可以影响这些靶向基因m RNA及蛋白水平表达。(6)在转录组水平,HBV整合片段在RNA水平在位于1500---1900bp的区域呈现出显着的富集现象,此区域与DNA水平所发现的现象一致。(7)HBV B型及HBV C型乙肝病毒在样本整合率等一系列整合特性上具有显着差异。(8)患者血清中HBV-DNA滴度与其基因组中的发现的整合断点数之间并未发现明显的相关性。(9)单一患者同一瘤体内的多数肝癌细胞均为单克隆起源。多数HBV病毒片段在宿主肝细胞癌细胞中的整合发生在肿瘤形成的早期阶段。(10)男性及女性原发性肝癌患者肿瘤组织中乙肝病毒整合特性上具有显着的性别差异。(11)肝硬化肝癌与非肝硬化肝癌中乙肝病毒整合谱具有显着差异。结论:通过本研究,我们首次采用大样本量队列以及更为灵敏的技术方法系统深入的解析了乙肝相关原发性肝癌肿瘤及癌旁组织中乙肝病毒的整合特性。我们的研究发现,在宿主基因组的基因富集区等特定重要区域以及一部分基因组重要关键位点上,乙肝病毒具有显着的整合偏好性。我们认为,乙肝病毒在宿主基因组上关键位点的整合使得肝细胞具有恶性转化的潜能,密切参与原发性肝癌发生发展的过程。
赵克开[6]2007年在《血清中嗜肝DNA病毒共价闭合环状DNA动态检测的实验和临床研究》文中指出【研究背景】乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科的原型(prototype),与包括鸭乙型肝炎病毒(DHBV)在内的其它嗜肝DNA病毒具有相似的生物学特性。共价闭合环状DNA(cccDNA)是嗜肝DNA病毒复制过程中在宿主细胞核内形成的第一个复制中间体,它的形成标志着病毒在宿主细胞内感染状态的建立和复制循环的开始,同时它还是病毒在细胞内复制过程的初始模板。由于其在肝细胞核内形成含量相对稳定的cccDNA池,而目前绝大多数临床上应用的抗HBV药物难以清除细胞内的cccDNA,因而在停止抗病毒治疗后乙型肝炎容易复发。HBV cccDNA的监测对抗HBV药物的研发和应用评价,以及慢性乙型肝炎(CHB)患者的病情监测和抗病毒疗效评估等具有十分重要的临床意义。但由于HBV cccDNA只存在于被感染细胞的细胞核内, HBV cccDNA检测需要通过肝组织活检等手段取得足量的肝组织标本才能进行,患者对此的依从性较差,导致HBV cccDNA检测在临床中的开展和推广应用受到限制。近年来有文献报道在慢性乙型肝炎患者的血清中检测到了cccDNA,并发现血清HBV cccDNA的水平与血清HBV载量和ALT水平显着相关,血清中是否出现cccDNA还与肝组织中的总HBV DNA和cccDNA水平的高低有关,还有学者发现乙肝患者拉米夫定治疗后血清HBV cccDNA呈动态下降。以上研究结果表明血清HBV cccDNA检测似乎也可以用于评价乙肝患者的病情以及抗病毒的疗效,因而给HBV cccDNA检测从实验室研究进入临床应用带来新的希望。但他们的研究结果因检测方法特异性的缺陷而倍受争议,需要通过深入的研究进行验证。本研究以我们实验室建立的一套特异、灵敏的HBV cccDNA检测技术为基础,分别以不同程度肝损伤的DHBV感染上海麻鸭和乙型肝炎患者为研究对象,探讨在外周血中检测cccDNA的可能性及相关的影响因素。本研究共分为叁个部分:(一)乙肝病毒与cccDNA在血液中的清除动力学和稳定性比较研究;(二)鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测;(叁)乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的动态检测。第一部分乙肝病毒与cccDNA在血液中的清除动力学和稳定性比较研究目的以HBV为对照观察HBV cccDNA在外周血中的血液动力学特征和稳定性,探讨在外周血中检测cccDNA的可行性。材料与方法①将12只1周龄上海麻鸭随机分为A、B两组,A组和B组每只鸭分别以1.2×109 copies/ml的HBV携带者血清和含1.2×109 copies/ml pBS HBV 3.6Ⅱ质粒(模拟cccDNA)的人血清1 ml颈静脉注射。在注射后0.25 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h和32 h,分别采静脉血进行HBV DNA定量检测。②将1.2×108copies/ml的HBV携带者血浆和含有1.2×108copies/ml的pBS HBV3.6Ⅱ质粒(模拟cccDNA)人血浆各50μl,分别用5 U的RQ1 DNase酶处理37℃1 h,并以未加酶处理的相应血浆为对照,观察核酸酶处理前后血浆中HBV DNA的变化。③将1.2×108 copies/ml的HBV携带者新鲜血浆和含1.2×108 copies/ml pBS HBV 3.6Ⅱ质粒(模拟cccDNA)的正常人新鲜血浆各1.5 ml分别置于37℃水浴,在水浴后4h、8h、12h、16h、24h、2d、3d、4d、5d、6d和7d,每管分别取100μl血浆进行HBV DNA定量检测。结果①HBV和pBS HBV 3.6Ⅱ质粒在鸭血液中载量的动态变化均符合单相指数衰减曲线模型。在注射后0.25～24 h内血液中均可检测到HBV和质粒(cccDNA),32 h后则未能检出。HBV和质粒(cccDNA)在鸭血液中的平均半衰期分别为4.536±0.769 h和4.511±0.791 h,二者无统计学差异(P=0.9593);②在核酸酶处理前后,血浆中的HBV颗粒无明显变化,而质粒含量则下降了两个数量级(log10)。但相同量的HBV颗粒和pBS HBV 3.6Ⅱ质粒在体外水浴4h～7d,各时点血浆中HBV颗粒和质粒(cccDNA)的量无明显变化(变异系数分别为1.05%和1.73%),同一时点血浆HBV和质粒(cccDNA)的量配对t检验也无显着统计学差异(P=0.8568)。结论HBV cccDNA在血液中的清除动力学特征和稳定性均与HBV相似,血清HBV cccDNA检测在技术上具有可行性。第二部分鸭肝损伤模型血清中鸭乙肝病毒cccDNA的动态检测目的探讨在不同程度肝损伤的DHBV感染上海麻鸭外周血中是否能检测出DHBV cccDNA。材料与方法①建立由一对跨缺口的引物和Taqman荧光探针组成的选择性DHBV cccDNA荧光定量PCR检测系统,用不同浓度的DHBV质粒(cccDNA)和纯化DHBV rcDNA验证该系统区分cccDNA和rcDNA的效率;并进一步结合PDS(十二烷基硫酸钾)-蛋白质沉淀法和不降解质粒的ATP依赖DNA酶(PSAD)的酶切法降低模板中的rcDNA背景而实现DHBV cccDNA的特异性扩增。②用DHBV强阳性鸭血清注射40只1日龄上海麻鸭,并在注射后2个月选择持续感染DHBV的上海麻鸭中的24只随机分为4组,分别以:A)D-氨基半乳糖(D-GalN)2.2 g/kg+脂多糖(LPS)100μg/kg;B)D-GalN+LPS+10 ml/kg的CCl4灌胃2次;C)D-GalN+LPS+15 ml/kg的CCl4灌胃2次,并用生理盐水处理另一组动物作为正常对照组(NC组)。在处理后不同时间点静脉抽血1ml,分别检测血清中的ALT、DHBV载量和DHBV cccDNA,最后处死动物取肝组织评价肝损伤程度,并检测肝组织中的总DHBV DNA和DHBV cccDNA。结果①选择性DHBV cccDNA荧光定量PCR检测系统能扩增103～108copies/ml的DHBV质粒(cccDNA),而以DHBV rcDNA为模板时,只有107 copies/ml以上的DHBV rcDNA才会出现弱荧光信号,该系统扩增cccDNA的效率是扩增rcDNA效率的104倍;PDS-蛋白质沉淀法抽提和PSAD酶切纯化可分别使待测样品中的rcDNA背景降低1个数量级(log10)而保持cccDNA的含量不变,二者与选择性荧光定量PCR结合检测108copies/ml以上的rcDNA均无阳性信号。②NC组鸭无明显病理改变,A组、B组和C组鸭则分别出现点状坏死至大片肝坏死的肝损伤,3组的肝损伤程度分级具有显着的统计学差异(P<0.0001)。B组和C组在实验结束时分别有1只和4只鸭死亡。NC组和A组各检测时点血清中均未检测到DHBV cccDNA;B组和C组在初次CCl4处理后12 h分别有2只和3只鸭血清中检测到DHBV cccDNA,含量在3.17×103～1.72×104copies/ml之间,在初次CCl4处理后24 h两组各有1只鸭血清中仍可以检测出DHBV cccDNA。Logistic逐步回归分析显示血清中DHBV cccDNA的检出率与肝损伤程度评分有关(P=0.0029),而与血清DHBV载量、ALT水平以及肝组织中的总HBV DNA和DHBV cccDNA含量无关。结论①由PDS-蛋白质沉淀法抽提、PASD酶切纯化和选择性实时荧光定量PCR组成的DHBV cccDNA检测方法灵敏度高,特异性好;②在肝组织发生严重损伤时,血清中可以出现DHBV cccDNA。血清中DHBV cccDNA的出现与肝组织损伤程度有关,而与血清中的ALT水平、血清DHBV载量以及肝组织中总DHBV DNA和cccDNA水平无关。第叁部分乙型肝炎患者血清中乙肝病毒cccDNA的动态检测目的观察在不同肝脏病变程度的乙型肝炎外周血中能否检测HBV cccDNA。对象与方法以57例住院的乙型肝炎患者为研究对象,其中轻度慢性乙型肝炎患者(MCHB)26例,重型乙型肝炎(SHB)患者31例。MCHB组每位患者采集血清标本1次共获得26份血清标本,SHB组每位患者在病程中的不同时间采集血清1～5次共获得60份血清标本。每份血清标本分别进行HBV载量检测和HBV cccDNA检测,并同时记录各血清标本采集时间点患者的凝血酶原时间(PT)和肝脏生化学指标检测结果。结果①MCHB组有1份血清标本HBV cccDNA为阳性,SHB组有13例患者的13份血清标本HBV cccDNA为阳性,血清HBV cccDNA的含量1.25×103～4.88×104 copies/ml之间,两组患者血清HBV cccDNA的检出率有显着统计学差异(P=0.0014),但血清HBV cccDNA检测诊断SHB的灵敏度仅为41.94%,准确度仅为66.67%。②Logistic逐步回归分析显示,血清HBV cccDNA的检出率与凝血酶原时间的长短有关(P=0.0072),而与患者的年龄、性别、血清HBV载量和ALT水平无显着相关性。结论乙型肝炎患者外周血中可以检测出HBV cccDNA,它的检出率与患者肝脏病变的严重程度有关,但血清HBV cccDNA检测不是一项恰当的判断患者肝脏病变程度、发展和预后的指标,不能取代肝组织HBV cccDNA检测。
姜利彬[7]2016年在《HBV感染者宿主细胞α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调及其影响的实验研究》文中指出研究背景据报道全球约20亿人有既往或现症乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的血清学证据,其中2.4亿人为慢性HBV感染者。慢性HBV感染往往会进展为终末期肝病、肝硬化以及原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC),年死亡人数可达65万人。HBV感染持续存在的原因是多方面的,包括抗原加工和提呈受到抑制、免疫抑制微环境(IL-10,TGF-p).CD4 T细胞反应低下、细胞因子分泌抑制、负性调控(PD-1/CTLA-4/Tim-3)、T细胞和B细胞抗原表位逃逸突变、免疫细胞缺失或耗竭(由于高病毒载体或负性调节)等。其中,树突状细胞(dendritic cells,DCs)提呈HBV抗原功能缺陷和共刺激分子表达低下,是造成HBV感染持续存在的一个重要原因。作为一种Ⅱ型跨膜蛋白,DC-SIGN(DC-specific ICAM-3 grabbing non-integrin)是含有外源性甘露糖结合位点的C型凝集素(C-type lectin,CLR)结构域。其主要表达于淋巴组织成熟DCs与外周组织未成熟IDCs表面,在DCs识别病原体相关分子模式、激活初始T细胞及启动免疫应答,以及病原体的免疫逃逸中发挥重要作用。有研究显示DC-SIGN可以识别多种含有高甘露糖寡糖的病毒(例如丙型肝炎病毒,人类免疫缺陷病毒和埃博拉病毒)。HBV是一种DNA病毒,它的包膜蛋白包括大表面抗原、中表面抗原和小表面抗原,均含有丰富的甘露糖寡糖,因此DC-SIGN很可能参与对HBV的识别。N-糖基化是蛋白质翻译后的一种重要修饰,α-甘露糖苷酶Ⅰ特异性地作用于甘露糖a-1,2糖苷键,可以剪切N-寡糖中的甘露糖残基,使糖蛋白发生去甘露聚糖修饰,由高甘露糖型变为杂合型或复杂型。而M. L. Op den Brouw等人的研究揭示了HBV在一定情况下可以被DC-SIGN识别：尽管天然HBV不能与DC-SIGN结合,但用α-甘露糖苷酶Ⅰ抑制剂基夫碱处理产HBV颗粒和乙肝表面抗原的HepG2.2.15细胞,由此产生的高甘露糖HBV和乙肝表面抗原则可被DC-SIGN识别。我们之前体外研究的结果显示,与Hep G2细胞相比,Hep G2.2.15细胞MAN1A1、MAN1A2的表达明显上调。尽管HBV DNA在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)中的存在形式、传染性和致病性存在争议,但PBMC无疑是HBV肝外感染的重要靶器官。本研究首先通过收集处于不同临床病程的HBV感染者的外周血,比较和分析不同临床病程α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达水平,及其与临床病程、细胞免疫应答之间的关系。另外通过构建a-甘露糖苷酶Ⅰ亚型MAN1A1的过表达和干扰重组腺病毒载体,观察MAN1A1的表达水平与乙肝表面抗原甘露糖修饰之间的关系,初步探讨a-甘露糖苷酶Ⅰ表达水平对HBV感染的影响。研究目的在前期研究工作基础上,比较和分析α-甘露糖苷酶Ⅰ在不同临床病程HBV感染中的表达水平,并初步探讨α-甘露糖苷酶Ⅰ表达水平对HBV感染的影响。实验方法1.收集90名HBV感染者和30名健康对照者的外周血,其中HBV感染者根据临床病程分为免疫耐受组、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)组、非活动性HBsAg携带组；2.Western Blot法检测a-甘露糖苷酶Ⅰ叁个亚型MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1蛋白的表达水平,ELISA法检测血清白介素-12(interleukin 12, IL-12)和丫-干扰素(IFN-γ)水平以及乙肝血清学标志物,RT-PCR方法检测HBV DNA;3.使用SPSS 22.0软件进行统计学分析,比较和分析a-甘露糖苷酶Ⅰ在不同阶段HBV感染中的表达水平,及其与IL-12、IFN-γ、HBV DNA的关系：4.根据Genebank中查询获得的人MAN1A1基因设计并合成特异的shRNA序列,然后通过分子克隆的方法构建MAN1A1的干扰穿梭载体pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA,酶切和测序鉴定：5.根据Genebank查询获取MAN1A1基因的编码序列,人工合成含有目的基因片段的质粒pUC57-MAN1A1,将其与pYr-adshuttle-4穿梭质粒连接,构建MAN1A1基因的过表达穿梭载体pYr-MAN1A1,酶切和测序鉴定；6.将上述干扰载体pBSilence1.1-MAN1A1-shRNA和过表达载体pYr-MAN1A1通过LR体外同源重组分别与pAd/PL-DEST腺病毒骨架质粒构建重组腺病毒载体pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1,酶切和测序鉴定正确后转染至HEK 293细胞进行病毒的包装和扩增,获得MAN1A1干扰和过表达重组腺病毒。7.分别将MAN1A1干扰和过表达重组腺病毒感染HepG2.2.15细胞细胞,同时设置对应的对照组和基夫碱处理组。感染48h后用Western Blot和RT-PCR法检测各处理组MAN1A1基因和蛋白的表达水平,并收集不同处理组的上清,植物凝集素ELISA检测乙肝表面抗原的甘露糖修饰程度。实验结果1.收集到了叁个组(免疫耐受组、慢性乙型肝炎组、非活动性HBsAg携带组)共90名HBV感染者和30名健康对照者的外周血,并完成各项指标的检测；2.和健康对照组相比,叁个HBV感染者组MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表达均出现明显的上调,其中免疫耐受组的患者上调幅度最大(分别为0.66±0.19、0.66±0.18和0.56±0.15,p<0.05), CHB组次之。叁个HBV感染者组IL-12和IFN-γ水平显著高于健康对照组(p<0.05),其中以CHB组最高(IL-12:59.08±13.38 pg/ml, IFN-γ:43.66±12.50pg/ml,p<0.05),其次为免疫耐受组：3.对于处于免疫耐受期的患者,MAN1A1、MAN1A2均与HBeAg滴度和HBV DNA水平呈线性正相关,而MAN1C1仅与HBeAg滴度相关。CHB组的相关性分析显示,MAN1A1、MAN1A2和MAN1C1的表达与ALT无相关性(p>0.05),而与HBeAg和HBV DNA均呈正相关(r>0.05,p<0.01)；4.构建了针对MAN1A1的干扰穿梭载体pBSilence 1.1-MAN 1A1-shRNA和过表达穿梭载体pYr-MAN1A1,酶切和测序结果显示构建成功；5.重组腺病毒载体pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1构建成功,酶切和测序鉴定正确,并通过HEK 293细胞包装和扩增成功获得了足够的重组腺病毒：6.重组腺病毒pAd-MAN1A1-shRNA和pAd-MAN1A1感染HepG2.2.15细胞后,MAN1A1基因的表达水平分别出现下降和上调,同时植物凝集素ELISA检测发现HepG2.2.15上清中HBsAg分别出现高甘露糖和去甘露糖修饰。结论1.不同临床阶段慢性HBV感染者的PBMC普遍存在α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调,这种上调在免疫耐受期的患者最高。而且,免疫耐受组和CHB组α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达水平与HBeAg滴度和HBVDNA水平均呈正相关。这些结果说明PBMC中α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调可能在HBV的免疫逃逸中发挥重要作用,而且表达水平与病毒复制的活跃程度密切相关：2.干扰和过表达α-甘露糖苷酶Ⅰ亚型MAN1A1的表达,可导致宿主细胞分泌HBsAg的甘露聚糖修饰发生变化,这进一步证实HBV可能通过影响宿主细胞a-甘露糖苷酶Ⅰ的表达,使乙肝表面抗原发生去甘露聚糖修饰,进而逃逸DC-SIGN的免疫识别。
赵东贤[8]2010年在《福寿螺多糖的提取及抗乙肝病毒实验研究》文中研究说明目的：研究福寿螺多糖提取工艺以及其体内外抗乙肝病毒的作用。方法：在多糖提取实验中,采用碱浸醇沉法,以多糖含量为指标,利用正交试验法对提取过程中的醇沉浓度、浸提温度、浸提酸碱度及浸提时间4个因素进行优选研究。并将提取的福寿螺多糖分离、除杂、备用。在体外实验中,以HBV-DNA克隆转染人肝癌细胞(HepG2)的2.2.15细胞系为细胞模型,采用MTT比色法检测福寿多糖对HepG2.2.15细胞生长的抑制作用。在其安全浓度范围内,选择含有五种不同浓度的福寿螺多糖及阳性对照药物3TC的培养基,对此细胞系进行培养。每3d更换相同培养基,第9d收集细胞培养上清液,同时设阴性对照组。采用时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)法检测HepG2.2.15细胞分泌HBsAg和HBeAg的水平；以实时荧光定量PCR技术检测培养液中的HBV-DNA含量。以此综合评价福寿螺多糖体外抗乙肝病毒的活性作用。在体内实验中,以转基因小鼠为动物模型,随机分为5组(每组8只)：福寿螺多糖低、中、高3个剂量组,拉米呋啶组和阴性对照组,腹腔注射给药,观察用药前与用药后5d、10d、15d、20d及停药后5d小鼠HBV-DNA的表达,从而评价福寿螺多糖体内抗HBV作用。结果：优化的多糖提取工艺为：加无水酒精至醇沉浓度为75%、溶液的pH=9.0、浸提温度50℃、浸提时间8h。体外实验结果表明福寿螺多糖在1mg·mL-1浓度以下对细胞无毒性；在5个浓度下,对HBsAg、HBeAg均有抑制作用,最大抑制率分别为50.57%和21.12%；对HBsAg的治疗指数为12.35；对HBV-DNA的复制也有一定的抑制作用(P<0.05),但抑制效果不及3TC。体内实验结果表明福寿螺多糖中、高剂量组在给药第15、20d,低剂量组在给药第20d, HBV-DNA拷贝量对比给药前均有下降,有显着性差异(1)P<0.05,2)p<0.01)。但各剂量组福寿螺多糖的抑制率低于同时段的拉米呋啶对照组,也具有显着差异性(7)P<0.05)。高剂量组在停药5d后HBV-DNA抑制率为15.76%与拉米呋啶组相比无差异性。结论：优化的福寿螺多糖提取工艺经济,有效,可行。福寿螺多糖在体内外具有一定的抗HBV作用,毒副作用小,安全范围大。图[7]表[9]参[76]
于洗河[9]2008年在《新型多酸化合物（代号POM-2）抗乙肝病毒的实验研究》文中提出慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)是一种全球性广泛传播的传染病,它以持续性HBV复制所致的不同严重程度的肝脏炎性病变为特征,其中部分患者最终可能发展为肝硬化、肝细胞肝癌或肝功能衰竭。乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染对全球的公共健康是极大的挑战。因此研发治疗慢性乙型肝炎的有效药物具有重要意义。本课题利用无机合成方法合成了小分子含钒的化合物POM-2,并利用单晶X-射线衍射方法对其结构进行表征;采用细胞生物学、分子生物学及毒理学实验方法,分别检测了POM-2的体内和体外抗HBV的活性及毒性,并探讨POM-2的药物作用机制。在体外研究中以Hep G2.2.15细胞为模型,检测了POM-2对HBeAg和HBsAg分泌的抑制作用、对mRNA和细胞内以及细胞外DNA合成的活性。体内药物活性研究中以1日龄北京鸭为实验模型,检测了POM-2对DHBV DNA合成的抑制作用和POM-2对减轻肝脏炎症的作用。按照新药毒理学评价方法,检测POM-2体内和体外毒性。研究结果显示新型多酸化合物POM-2细胞毒性较低,能够有效降低细胞培养上清液中HBeAg和HBsAg的含量,对细胞内和细胞外的DNA合成均有抑制作用,对HBV mRNA也有一定的抑制作用。体内实验结果显示,POM-2明显降低了鸭血清中的乙肝病毒载量,抑制了病毒的合成。病理实验结果表明POM-2减轻了肝脏炎症反应。体内毒理学实验结果显示POM-2属低毒化合物。本研究是在本课题组对多酸化合物抗病毒研究基础上,发现含5价钒离子多酸化合物具有抗HBV的活性,为新型非核苷类抗乙型肝炎药物开发和进一步的研究提供了实验依据。
虞瑛姿[10]2011年在《胞嘧啶脱氨酶APOBEC3DE和APOBEC3B对乙型肝炎病毒抑制研究》文中研究表明慢性乙肝病毒(HBV)的感染是个全球性的健康卫生问题,世界卫生组织(WHO)统计全球有近4亿人为慢性乙肝病毒携带者,许多慢性HBV感染者最终发生严重的肝脏疾病包括慢性肝炎、肝硬变和肝细胞肝癌,这些疾病每年导致约近一百万人死亡。APOBEC3s具有针对多种逆转录病毒和内源性逆转录元件的强大的天然免疫功能,近年来陆续有报道多个APOBEC3s蛋白具有抑制HBV复制的作用,并且其表达能被IFN、IL-2和TNF等细胞因子诱导,并且有报道APOBEC3s对HBV的抑制作用并不完全依赖于脱氨酶活性。本课题组早期研究发现A3B能抑制HBV s基因启动子的活性并能通过与hnRNPK的结合抑制HBV的复制。综合先前的研究,我们用多种分子生物学技术探究A3DE对HBV是否具有抑制作用；该抑制作用是否依赖于脱氨酶活性；其表达能否被细胞因子诱导上调;并对A3B对HBV的抑制机制作补充。本研究分为以下叁个部分：第一部分体外细胞系中APOBEC3DE对HBV的抑制作用及其机制研究本部分旨在了解APOBEC3s家族中哪些成员对HBV HBsAg和HBeAg水平具有抑制作用,同时对被选出的A3DE进一步探索其抑制HBV的作用机制。我们做了APOBEC3s蛋白对HBV HBsAg和HBeAg表达水平的影响的一系列研究。通过体外瞬时共转染实验,分别将HBV表达质粒与A3s真核表达质粒或对照空载体pcDNA3.1共转染人肝癌细胞系HepG2中,应用电化学发光法(ECLIA)测定转染48h后细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示,A3B和A3DE对HBsAg和HBeAg的抑制作用最为显着,HBsAg和HBeAg的表达分别为对照组的18.48%±1.88%和28.37%±1.18%以及11.06%±0.44%和22.87%±0.9%；与A3B和A3DE相比,A3F.A3G和A3H对转染后HepG2细胞培养上清中HBsAg和HBeAg水平的抑制作用要弱得多,分别为对照组的39.53±5.97%和40.44%±1.05%,44.34±3.23%和52.74%±0.81%以及65.52±11.96%和57.1%±5.72%；A3A对HBsAg和HBeAg抑制作用很弱,为86.38±7.38%和91.82%±4.94%；而A3C对其无抑制作用,两蛋白表达水平分别为110.4±5.3%和91.82±4.94%。我们用PCR突变技术构建了A3DE酶活性中心的点突变体,以观察A3DE对HBV HBsAg和HBeAg表达抑制是否依赖于脱氨酶活性,结果显示A3DE对其的抑制并未受到酶活性中心突变的影响。进一步分析A3DE及其叁个突变体对HIV-1病毒感染力的影响,与HBV不同的是,A3DE对Vif缺陷的HIV-1病毒感染力为对照组的2.94%±0.12%,而E80K、E80/264K和E264K分别为42.84%±6.78%,38.76%±8.92%和13.59%±3.12%,即对HIV-1感染率的抑制分别下降了大约39%,35%和10%,并且只有野生型A3DE包被在人HIV-1病毒中。为揭示A3DE能否抑制HBV基因表达,我们分析了上述转染细胞中HBV s基因的mRNA表达。提取上述共转染48h后HepG2细胞总RNA,通过半定量RT-PCR方法检测HBV s基因的mRNA水平,结果显示,共转染A3DE和HBV表达质粒的HepG2细胞中s基因mRNA水平与对照相比明显降低,提示A3DE能抑制s基因mRNA的表达。并且其突变体也能抑制其表达，上述两个结果表明A3DE既能抑制HBsAg蛋白的表达,又能抑制s基因mRNA表达。接着观察A3DE蛋白对HBV core DNA合成的影响。将HBV质粒与A3DE表达载体或对照空载体VR1012共转染HepG2细胞,提取和纯化转染48h后细胞内的HBV core相关DNA,并应用定量PCR方法对其定量,用3D-PCR技术检测A3DE能否突变HBV基因组。结果显示A3DE不能抑制HBV core相关DNA的合成,但是能突变HBV X基因DNA。第二部分A3DE在细胞内的表达及其调控研究这部分研究检测了A3DE在外周血单个核细胞、多株人肝细胞系和白血病细胞系、及肝组织中的表达情况,观察IFN和TNF刺激对A3DE表达的影响,旨在揭示ADE在体内表达的调控和作用。应用半定量RT-PCR方法检测了原代标本和细胞系A3DE的表达情况。7例健康成人外周血单个核白细胞中均有A3DE表达。表达存在着个体差异,其中有一例标本A3DE的表达呈较低水平,其余6例表达较强。HepG2.2.15由HepG2细胞稳定转染HBV表达质粒构建而成,前者的A3DE表达高于后者约1.5倍,这表明HBV的感染激发了细胞内A3DE的增高。在5株肝细胞肝癌细胞系和2株人正常肝细胞系中,A3DE有一定的表达,其中Huh-7细胞中的A3DE表达相对最高,但是这些细胞系细胞中的本底表达并不高,远远不及外周血单个核细胞。但人白血病细胞系中A3DE的表达水平不低于外周血单个核细胞。为探讨A3DE在肝组织中的表达我们分析了16对配对人肝癌和癌旁肝组织中A3DE基因的表达情况。结果显示在16对肝癌或癌旁组织中均有A3DE的表达,表达水平各有高低,对A3DE与GAPDH电泳条带的灰度比值进行统计分析发现肝癌和癌旁A3DE的表达并无统计学差异(P=0.1219)。接着检测了IFN和TNF刺激肝细胞系对A3DE表达的效应。结果显示4株人肝细胞肝癌细胞系和1株人正常肝细胞系细胞中的A3DE表达均能被IFN和TNF上调,以QGY-7703的上调最为显着,不同细胞株上调的程度和时间点的持续各有不同。综合第一二部分结果我们认为A3DE具有抗HBV复制能力,其表达和调控对HBV感染的预后和治疗有积极的提示意义。第叁部分A3B对HBV复制的抑制不依赖于N端和C端的胞嘧啶脱氨酶本部分的实验方法与第一部分类似。我们先前研究发现A3B能抑制HBV s基因的启动子活性并能通过与hnRNPK的结合来抑制HBV Enh II的作用,为进一步补充其抑制机制,构建了A3B两端的酶活性中心点突变体,用共转染和免疫沉淀技术验证A3B酶活性失活后仍能抑制HBV复制并与hnRNP K的结合不受影响。实验结果显示,以对照组中HBsAg和HBeAg的表达为100%, A3B、C100S、C289S和C100/289S中HBsAg的表达分别为对照组的18.98%±1.81%、17%±0.84%、20.89%±0.65%和19.39%±1.22%；HBeAg的表达为对照组的30%±2.8%27.45%±0.58%、33.05%±±2.54%和32.39%±±4.24%,突变体对HBV的抑制并不低于野生型A3B。通过RT-PCR方法检测HBVs基因mRNA水平,与对照相比,A3B和其突变体的HepG2细胞中的s基因mRNA水平明显降低。最后免疫共沉淀(IP)方法证实A3B叁个突变体蛋白与野生型A3B相比,与hnRNP K的结合能力未受影响。这部分实验进一步证实了脱氨基作用并非A3B抑制HBV复制的主要手段,为APOBEC3s抑制HBV研究提供了新的方向。综合前两部分研究得出结论：A3DE具有不依赖于胞嘧啶脱氨酶活性的强大的抗HBV复制的能力；与A3B不同,A3DE的表达与人肝细胞肝癌发生无关,其表达能被IFN和TNF等细胞因子诱导上调；A3B和A3DE对HBV复制的抑制都不依赖于两端的脱氨酶活性,说明脱氨基作用并非A3B和A3DE抑制HBV的主要手段;这些结果为APOBEC3s蛋白抗HBV病毒机制研究提供了新的思路并为人类乙型肝炎病毒的治疗提供了新的方向。
参考文献：
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[4]. 利用腺相关病毒介导CRISPR-Cas9抑制HBV转基因小鼠体内乙肝病毒复制的研究[D]. 生春雨. 中国人民解放军军事医学科学院. 2017
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[7]. HBV感染者宿主细胞α-甘露糖苷酶Ⅰ的表达上调及其影响的实验研究[D]. 姜利彬. 华中科技大学. 2016
[8]. 福寿螺多糖的提取及抗乙肝病毒实验研究[D]. 赵东贤. 安徽理工大学. 2010
[9]. 新型多酸化合物（代号POM-2）抗乙肝病毒的实验研究[D]. 于洗河. 吉林大学. 2008
[10]. 胞嘧啶脱氨酶APOBEC3DE和APOBEC3B对乙型肝炎病毒抑制研究[D]. 虞瑛姿. 浙江大学. 2011
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