杨桐伟[1]2011年在《ERK与NO信号通路在神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角内痛觉信号传递中的交互作用》文中进行了进一步梳理疼痛,尤其是神经病理性疼痛外周与中枢神经元可塑性变化是导致其发展为慢性持续状态的关键,脊髓背角神经元在持续刺激后所发生的可塑性变化成为近来研究的热点。细胞外信号调节激酶(extracellular signal- regulate kinase, ERK)是MAPK家族中的一员,介导多种信号的胞内转导,在不同的疼痛模型(辣椒素或完全弗氏佐剂致炎,内脏痛,电刺激等)中发现磷酸化ERK表达增加,用其上游激酶MEK的阻滞剂能减轻模型大鼠的痛敏表现,预示其活性的变化与伤害性刺激的传递及神经敏感化有关。NO是细胞内重要的信使分子和神经递质,它对炎性疼痛的发展和维持起到了重要作用。目的:观察在CCD导致大鼠神经痛模型中应用MEK阻滞剂U0126及NOS阻滞剂对大鼠痛行为的影响和ERK活性及NOS变化,并探讨ERK与NO信号通路在CCD导致的神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角内痛觉信号传递中的交互作用。材料与方法:采用吉林大学实验动物中心提供的200-250gwistar大鼠进行实验研究。鞘内置管和鞘内给药参照Yaksh和Rudy方法进行。CCD动物模型参照song方法建立。分别用热痛刺激仪和斜板实验测定大鼠的热痛阈值与运动功能的变化。pERK阳性神经元表达采用免疫组化方法进行观察,脊髓背角内pERK1与pERK2水平测定采用免疫印迹方法,脊髓背角内nNOS及iNOS免疫阳性神经元采用免疫荧光染色方法和免疫印迹方法进行观察。实验1方法, 122只大鼠随机分成叁部分,32只用于大鼠行为学检测,随机分为假手术组、CCD组、U0126组和DMSO组,每组8只,其余90只大鼠用于假手术组、CCD组、U0126组模型制作后5天、10天、15天免疫组化染色、细胞计数及免疫印迹、蛋白定量分析。在制备CCD模型前一天和CCD后连续叁天鞘内注射U01265μg/10μl,DMSO组注入等容量DMSO作为对照,分别在脊髓背根神经节慢性压迫前连续测定热痛阈3天,3天的平均值为大鼠基础值,然后从压迫后第一天起隔天测定至第15天的热痛阈和运动功能的变化。分别于模型制作后5、10、15天取大鼠L4-5脊髓节段进行免疫组化染色和免疫印迹检测。实验2方法,分假手术组、CCD组及按鞘内注射药物不同分为L-NAME组、AG组、7-NI组、8-Br-cGMP组, 180只大鼠随机分为两部分,48只用于行为学检测,另132只用于免疫荧光染色、细胞计数及免疫印迹检测。热痛阈和运动功能的检测同方法1,分别于CCD后5、10、15天取大鼠L4-5脊髓节段进行免疫荧光染色和CCD后第五天免疫印迹检测。实验3方法,108只大鼠随机分为两部分,48只用于行为学检测,在CCD模型制备5天后按鞘内给药不同随机分为L-NAME组、AG组、8-Br-cGMP组、7-NI组、PBS组、Cremophor组6组;另外60只大鼠用于假手术组、CCD组及按鞘内注射药物不同分为L-NAME组、AG组、8-Br-cGMP组和7-NI组,在鞘内注射后2小时后取材进行免疫组化染色阳性神经元计数及免疫印迹分析。实验4方法, 84只大鼠随机分成两部分,一部分用于行为学检测,共24只,随机分成3组,U0126组、MDSO组和模型对照组,每组8只。另一部分用于免疫荧光染色和免疫印迹分析,共60只,随机分成6个亚组,假手术组、模型对照组、U0126注射后0.5h、2h、12h、24h组,每组10只,其中6只用于免疫荧光染色,4只用于免疫印迹分析。结果1,正常大鼠(CCD模型制作前)鞘内注射U0126与DMSO未见痛阈明显变化,CCD组大鼠于神经压迫后1天出现痛觉过敏,至5天达到高峰并在观察时间内维持稳定,预先鞘内注射U0126能明显减轻CCD所至的痛觉过敏。鞘内注射U0126和MDSO未影响大鼠运动功能。CCD引起同侧脊髓背角内pERK阳性神经元数量明显增加,预先鞘内注射U0126能明显抑制CCD引起的pERK阳性神经元表达。免疫印迹显示CCD大鼠脊髓背角内pERK1与pERK2水平明显增加,鞘内注射U0126能明显抑制CCD引起的pERK水平的增高。结果2,假手术组术前和术后大鼠缩足潜伏期无明显变化,CCD术后第一天开始缩足潜伏期明显缩短,与CCD组相比较7-NI组术后第一天至第十一天缩足潜伏期明显延长, L-NAME组术后第一天至第七天缩足潜伏期明显延长,AG组术后第一天至第五天明显延长,8-Br-cGMP术后第一天缩足潜伏期明显缩短,第叁天开始无明显差异。鞘内注射NOS抑制剂或激动剂对大鼠运动功能未见明显影响。术后第五天假手术组损伤侧脊髓背角内nNOS及iNOS免疫阳性神经元很少,慢性压迫性损伤导致nNOS及iNOS免疫阳性神经元明显增加,与CCD组相比L-NAME组、AG组、7-NI组损伤侧脊髓背角内免疫反应阳性细胞数明显减少。免疫印迹结果显示与假手术相比CCD导致大鼠脊髓背角神经内nNOS及iNOS水平明显增加,鞘内注射非选择性nNOS抑制剂L-NAME和选择性nNOS抑制剂7-NI能够明显抑制CCD大鼠脊髓背角内nNOS的表达,而选择性iNOS抑制剂对nNOS表达未见明显影响。同样鞘内应用非选择性iNOS抑制剂L-NAME和选择性抑制剂AG能明显抑制iNOS的表达,而选择性nNOS抑制剂对iNOS的表达没有影响。8-Br-cGMP能增加CCD大鼠脊髓背角内nNOS和iNOS的表达。结果3,在术后第5天所有进入实验的模型大鼠术侧后肢均产生明显痛敏。与鞘内注射前相比,PBS组和Cremophor组注射后各时间点大鼠痛行为未见明显变化;与PBS组相比,L-NAME组、AG组和7-NI组注射后12、24h大鼠术侧热缩足潜伏期无明显变化,L-NAME组、AG组和7-NI组注射后30min,2h和6h大鼠术侧热缩足潜伏期明显延长;与PBS组相比,8-Br-cGMP组注射后30min和2h大鼠术侧热缩足潜伏期明显缩短。免疫组化结果显示CCD第5天大鼠术侧脊髓背角内pERK免疫反应阳性神经元明显增多,L-NAME组、AG组和7-NI组于鞘内注射2h时术侧脊髓背角内pERK免疫反应阳性神经元数量明显减少,8-Br-cGMP组术侧脊髓背角内pERK免疫反应阳性神经元数量增加。免疫印迹显示CCD导致大鼠脊髓背角神经元内pERK水平明显增加,与CCD组和8-Br-cGMP组相比L-NAME组、AG组、7-NI组背角神经元内pERK含量明显减少。结果4 ,术后第五天,假手术组大鼠损伤侧脊髓背角内nNOS免疫阳性神经元很少,慢性压迫性损伤导致nNOS免疫阳性神经元明显增加。与假手术组相比,模型对照组损伤侧脊髓背角内神经型一氧化氮合酶免疫反应阳性细胞数明显增多;与模型对照组相比,U0126注射后0.5,2和12h组损伤侧脊髓背角内神经型一氧化氮合酶免疫反应阳性细胞数明显减少,U0126注射后24h组损伤侧脊髓背角内神经型一氧化氮合酶免疫反应阳性细胞数没有明显变化。免疫印迹结果显示慢性压迫性损伤导致脊髓背角内nNOS表达水平增加,与假手术组相比,模型对照组,U0126注射后12h组以及U0126注射后24h组损伤侧脊髓背角内神经型一氧化氮合酶表达水平明显增加;与模型对照组相比,U0126注射后0.5,2和12h组损伤侧脊髓背角内神经型一氧化氮合酶表达水平明显降低,而U0126注射后24h组损伤侧脊髓背角内神经型一氧化氮合酶表达水平未见明显变化。结论1、CCD可明显增加损伤侧脊髓背角浅层pERK、NOS阳性神经元表达。2、鞘内注射ERK信号传导通路阻滞剂U0126及NOS抑制剂在减轻大鼠痛行为的同时,能明显抑制损伤侧脊髓背角内pERK1/2和NOS的表达。3、大鼠痛行为及脊髓背角pERK及nNOS和iNOS的表达在时程上相一致。4、在脊髓水平痛觉信号的调制中,脊髓背角神经元胞内ERK信号通路活性的变化能够影响脊髓背角内神经型一氧化氮合酶表达,胞外信号调节激酶参与介导了一氧化氮在神经病理性疼痛中的作用。
陈嘉[2]2001年在《电针对兔急性心肌缺血时脊神经节内NOS和AchE表达的影响》文中研究指明经络学说是中医特有的理论体系，贯穿于中医生理、病理、诊断和治疗各个方面。经络研究在理论上和实践上都有十分重要的意义。目前有关心包经穴与心脏联系的研究，取得了显着的成果。其中在内关与心脏相关性形态学研究方面，主要是从心脏与内关穴的神经支配以及它们之间的联系进行厂研究，并取得了一定的研究结果。 内源性一氧化氮（NO）与经典递质乙酰胆碱（Ach）共存于交感、副交感的节前神经元及副交感节后神经元，脑桥网状结构内乙酰胆碱和一氧化氮合酶（NOS）是共存的，可见NO与Ach和内脏神经的传出活动有关。以往的研究认为脊神经节是感觉传入通道的简单集中和感觉纤维的营养物质储存站，但随着脊神经节中分支投射神经元的发现、及脊神经节中存在化学或电突触的事实，可见脊神经节中有些神经元胞体就是内脏传入和躯体传入神经冲动整合器，它们可能是牵涉性痛和经穴—脏腑相关结构的组成部分。NO与Ach也共存于脊神经节，可能是作为躯体一级传入神经递质，参与痛觉及针感一级传入。本实验旨在观察兔急性心肌缺血时，颈5—胸5（C5—T5）脊神经节内NO与Ach的变化，从而探讨两者是否参与电针“内关”改善心肌缺血的作用，及NO与Ach这两种递质和C5—T5脊神经节在心脏与内关相关联系中的作用。 实验采用32只普通级青紫蓝兔，随机分成对照组、电针组、心肌缺血组、心肌缺血+电针组，共四组，每组8只。 在戊巴比妥钠麻醉下，电针组电针双侧内关穴30分钟。心肌缺血组及心肌缺血+电针组结扎兔冠状动脉左室支，造成急性心肌缺血（AMI）模型，造模前后分别记录心电图Ⅱ导联及avF导联，以T波高耸、ST段移位等作为AMI的指标。两组均在结扎10分钟后松结，心肌缺血+电针组在造模后即予电针双侧内关穴30分钟。在心肌缺血组松结20分钟、电针组及心肌缺血+电针组电针内关穴30分钟后进行灌注、取材，取材范围为左侧C5—T5脊神经节，冰冻切片，切片厚20μm。分别用还原型尼克酚胺腺嘿吟二核昔酸脱氢酶（NADPH—d）法和EL一Badawi对Karnovsky一Roots法的改良法进行NOS、乙酞胆碱酯酶（AUh辽L＊0趴＊巾丑双重显示的组织化学染色，0b＊pU。显微镜观察，统计阳性及强阳性细胞的数日。 本实验观察到：电针组＊6一TI脊神经节内＊＊s、ACbE的强阳性率均比对照组升高，差异有显着意义，提示＊0与ACh可能在外周即参与了针感的传导，即在外周短反射过程中，＊0与ACh有可能是其中的递质；心肌缺血组＊1一＊5脊神经节内＊os、AChE的强阳性率也均比对照组升高，而 NOS、AchE阳性的细胞直径分别在 20－55 P m及 20ed8Pm之间，可见NOS、AchE阳性反应是脊神经节中、小细胞所特有的，而这些中、小型细胞发出传导伤害性刺激信息的C纤维或薄髓As类纤维，表明＊0与ACh参与了心肌缺血信息的传递；心肌缺血十电针组＊6一＊8脊神经节＊＊s、ACh【表达增强，与对照组比较，强阳性率差异有显着性意义，而TI——TS脊神经节NOS、AchE的强阳性率明显低于心肌缺血组，差异有显着性意义，提示电针对脊神经节＊os与ACh日的表达有双向性调节作用。 本实验结果提示了厂0与ACh在电针内关减轻心肌缺血损伤过程中发挥重要作用，可能是内关与心脏相关联系的重要介质；在电针、心肌缺血的情况下，CS——TS各个脊神经节均出现相应的变化，故认为CS一TS脊神经节是内关与心脏之间存在着节内短反射的神经形态学基础。
张丹龙[3]2015年在《脊髓背角iNOS过表达在带状疱疹后遗神经痛大鼠模型中的表达及意义》文中研究表明研究背景及目的疼痛是人类对疾病最难以忍受和最痛苦的体验之一,尤其像带状疱疹后遗神经痛(PHN),主要表现为受损皮区痛觉过敏和异常疼痛,病程较长,迁延不愈,持续约3个月以上。其患病群体主要以老年人为主,而我国正在步入老龄化社会,带状疱疹后遗神经痛将严重威胁着老年人的健康。在临床上,应用抗病毒药物、抗抑郁药物、针灸以及中医中药进行治疗效果均不如意,目前还没一种行之有效的方法对其进行预防和治疗。PHN属于一种特殊的神经病理性痛,其发病机理目前并未搞清楚。经典观点认为,带状疱疹后遗神经痛(PHN)可能是由外周神经和末梢的炎症和变性引起的,近年来越来越多的观点认为其与中枢神经系统也有莫大的联系[1]。脊髓背角是痛觉传导通路的第二级神经元所在部位,是痛觉调控的关键部位。本实验就是以脊髓背角为切入点,从脊髓水平来探索和研究PHN的病理机制。在预实验中,我们发现在大鼠痛觉过敏和异常疼痛形成的时间段,脊髓背角诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的活性和蛋白表达水平也相应地显着升高。那么,我们推测:①iNOS可能与PHN存在密切联系;②它在PHN痛觉过敏和异常疼痛的形成过程中发挥着重要作用;③应用iNOS的抑制剂或清除剂后,应该能达到镇痛效果;④它对临床用药具有重要的指导意义。为了验证这些推测,我们设计了本试验。方法⑴建立带状疱疹后遗神经痛大鼠模型:将大鼠随机分为叁组,分别为vzv接种组,假接种组和阴性对照组(n=10/组)。将水痘-带状疱疹病毒(vzv)感染cv-1细胞,再用磷酸盐缓冲液收集大约有80%被感染的cv-1细胞制成接种溶液。制成的接种溶液接种于sd大鼠双侧后足趾皮下,作为vzv病毒接种组。接种不含vzv病毒的接种液的大鼠作为假接种组(mock组),接种生理盐水的作为对照组(naive组)。vzv组随后形成痛觉过敏和异常疼痛,且经抗病毒药物治疗,观察其痛觉阈值是否发生改变。⑵形态学检测:10%水合氯醛麻醉大鼠,经4%多聚甲醛灌注成功,仔细取大鼠脊髓腰4-6节段,然后分别用20%蔗糖、30%蔗糖脱水,4℃过夜。包埋固定,恒冷机切片机进行切片。用兔抗inosigg,兔抗nnosigg或兔抗enosigg进行免疫组化染色。再用免疫荧光双标染色。显微镜或激光共聚焦显微镜下观察脊髓背角变化,与对照组比较。获取数据,统计学分析。⑶westernblot检测:麻醉大鼠,在冰上快速取出大鼠脊髓背角组织,裂解并提取总蛋白,进行蛋白定量,电泳,转膜,分别以抗inos,nnos或enos的一抗4℃孵育过夜。加入二抗,发光,分析蛋白表达的相对量参数,并与内参β-actin比较,以矫正蛋白定量、上样过程中存在的实验误差,比较各组蛋白样品之间的表达差异。获取数据,统计学分析。⑷鞘内置管给药:对vzv组大鼠进行鞘内置管术。置管成功后,当大鼠机械痛觉阈值降至最低时,我们经鞘内应用ptio(no清除剂,30μg),l-name(nos广谱抑制剂,50μg),l-nil(inos抑制剂,100μg),7-nina(nnos抑制剂,45μg)或l-nio(enos抑制剂,25μg)[2],对照组给予对应量的生理盐水,观察镇痛效果。于给药后0、10、20、30、40、50、60分钟检测其痛觉阈值变化,记录数值,统计分析。结果⑴vzv组在接种病毒溶液后第5天,机械痛觉阈值开始下降(11.4±1.6g),约两周阈值降到最低点(5.8±1.4g),持续至第8周逐渐恢复,12周左右接近正常(25.4±3.6.6g)。与假接种组和阴性对照组相比较,(p<0.05)。受损皮区也没有皮疹,与临床phn患者临床表现相似。建成phn模型后,进行系统抗病毒药物治疗,phn大鼠机械痛觉阈值在给药前后未发生明显变化,这与临床上对phn患者进行抗病毒效果一致。⑵大鼠形成痛觉过敏和异常疼痛相应的时间段,对切片进行染色发现,与对照组相比,inos在vzv组大鼠脊髓背角的染色密度明显增加,并且其免疫阳性结构也主要聚集在脊髓背角的i和ii层。再进行免疫荧光双标染色可以看出,脊髓背角inos免疫阳性结构有且仅表现在胶质原纤维酸性蛋白gfap标记的免疫阳性细胞(可能为胶质细胞)。而ox42或neun标记的免疫阳性细胞并无inos免疫阳性结构。⑶westernblot检测显示,vzv组大鼠在病毒接种后第五天左右,脊髓背角inos的蛋白表达水平出现了明显增加(0.21±0.08)。在接种后两周inos的蛋白表达升到颠峰(0.68±0.13),这种状态将维持着,相应情况下naive组(0.06±0.02)和mock组(0.05±0.01)(n=10/组;p<0.05)。由此可见,vzv组大鼠痛觉阈值的变化与inos的活性表达呈负相关(p<0.001,r=–0.89)[1]。与对照组相比,vzv组脊髓背角nnos或enos的蛋白表达水平在痛觉过敏或异常疼痛形成前后几乎无变化。⑷phn大鼠模型痛觉过敏和异常疼痛最明显的时刻,经鞘内给予ptio(no清除剂,30μg),l-name(nos广谱抑制剂,50μg),l-nil(inos抑制剂,100μg),均能达到镇痛效果。而鞘内给予其它抑制剂对于痛觉阈值并没发生改变。(n=10/组)结论:⑴phn不是简单地由疱疹病毒的急性复制所形成的。带状疱疹后遗神经痛是一种特殊的神经病理性痛,属于慢性痛,虽然由水痘带状疱疹病毒感染引起,但是它的发病机制不是简单地由病毒的急性复制所形成。在实验中,大鼠皮肤未起皮疹,给予抗病毒治疗不能使疼痛缓解也验证了这一点。⑵nos对疼痛的调控主要集中在脊髓背角的i和ii层。位于痛觉传导通路的第二级神经元所在处的正是脊髓背角,其最外层为i层或着称为边缘层。i层中大多数神经元属于特异性疼痛神经元,接受来自皮肤和内脏痛觉信号的aδ纤维;紧靠边缘层为ii层或胶状质,接受c纤维传入。nos就是在这完成对疼痛的调控。⑶nos的表达变化和痛觉阈值的高低呈显着的负相关。inos的启动子结合位点能与nf-κb结合,激活nos,nos的活性升高,产生过量的no,间接地激活c-fos(fos也主要存在于脊髓背角i和ii层)引起广泛的生物学效应,介导了突触可塑性改变和中枢敏化形成痛觉过敏,phn大鼠的痛觉阈值降低了。⑷phn中起调控作用的是inos而不是nnos或者enos。在鞘内应用诱导型一氧化氮合酶inos清除剂或抑制剂,模型大鼠的机械痛觉阈值逐渐恢复至正常水平;在经鞘内应用内皮型eNOS或神经元型一氧化氮合酶nNOS清除剂或抑制剂,模型大鼠的机械痛觉阈值并未发生多大改变。这说明大鼠脊髓背角iNOS的表达活性(而不是nNOS或eNOS)与带状疱疹后遗神经痛即PHN的机械痛觉阈值变化之间可能存在一定的因果关系。本实验研究发现诱导型一氧化氮合酶iNOS参与并在PHN痛觉过敏和异常疼痛的形成过程中扮演了重要角色。这加深了我们对PHN病理发生机制的进一步认知,对于预防和治疗带状疱疹后遗神经痛提供新的更为合理的理论补充。临床上在开发新一代的镇痛药物方面具有实际意义[1]。这无疑对临床患者来说是个好消息。
林宏生[4]2003年在《糖尿病大鼠脑干nNOS免疫阳性神经元的变化》文中进行了进一步梳理目的：观察糖尿病大鼠脑桥被盖背外侧核、蓝斑下核、中央灰质背侧核nNOS免疫阳性神经元的的变化，探讨NO对糖尿病及其中枢神经系统慢性病变的作用机制。 方法：SD大鼠36只，随机分为2组，(1)对照组；(2)糖尿病组：用链脲佐菌素诱导建立胰岛素依赖型糖尿病大鼠模型。建模后2、7、12周末处死、取材。ABC免疫细胞化学方法观察脑桥被盖背外侧核、蓝斑下核、中央灰质背侧核nNOS免疫阳性神经元的变化，并用体视学方法进行定量分析，同时观察血糖、血清NO含量。 结果：(1)糖尿病大鼠脑桥被盖背外侧核nNOS免疫阳性神经元的数量在2周、7周、12周均较对照组明显增多(P＜0.01)并基本保持稳定；其平均光密度(AOD)、体积分光密度(VIOD)在2周、7周、12周均较对照组明显升高(P＜0.01)。(2)糖尿病大鼠蓝斑下核nNOS免疫阳性神经元的数量在2周、7周、12周均较对照组明显增多(P＜0.01)；其AOD、VIOD虽然在7周、12周较2周略下降，但均明显高于对照组(P＜0.01)。(3)糖尿病大鼠中央灰质背侧核nNOS免疫阳性神经元在2周、7周、12周亦均较对照组明显增多(P＜0.01)；其AOD、VIOD在2周、7周、12周的变化与蓝斑下核相似，明显高于对照组(P＜0.01)。(4)糖尿病大鼠血清NO含量在糖尿病2周明显升高(P＜0.01)，在糖尿病7周、12周下降至正常水平。 结论：(1)糖尿病大鼠脑干内nNOS免疫阳性神经元与外周血清NO的变化存在不平行现象，可能是由于外周eNOS催化生成NO出现障碍所致。(2)糖尿病大鼠脑干nNOS免疫阳性神经元的数量以及nNOS免疫阳性物质的含量显着增多，提示增多的NO可能通过其对神经细胞的毒性作用造成脑组织内神经细胞结构和功能的破坏。(3)糖尿病大鼠脑桥被盖背外侧核、蓝斑下核nNOS免疫阳性神经元的数量以及nNOS免疫阳性物质含量的显着增多可能与糖尿病晚期睡眠障碍有关。(4)糖尿病大鼠中央灰质背侧核和蓝斑下核nNOS免疫阳性神经元的数量以及nNOS免疫阳性物质含量的显着增多可能与糖尿病晚期感觉过敏或感觉丧失有关。
夏春梅[5]2008年在《针刺内关穴调节延髓NO/NOS系统及其有关神经递质改善大鼠心肌缺血作用机制探讨》文中进行了进一步梳理目的:观察急性心肌缺血(AMI)大鼠模型心功能、心肌梗死面积的变化及针刺内关穴(Pe 6)对急性心肌缺血的改善作用。通过检测急性心肌缺血和针刺组大鼠心血管调节中枢延髓头端腹外侧区(RVLM)一氧化氮/一氧化氮合酶(NO/NOS)含量及分布变化,以及该部位相关氨基酸递质改变,探讨针刺与中枢NO/NOS及其氨基酸递质在RVLM对AMI大鼠血压和心功能的调节作用。进而探究针刺改善AMI的中枢机制和意义。方法:通过冠状动脉左前降支结扎手术制备AMI大鼠模型;采用针刺大鼠双侧内关穴位观察针刺改善心肌缺血作用,同时监测心率(HR),平均动脉压(MAP),心室内压(IVP);采用氯化四唑(TTC)染色检测梗死心肌面积以及苏木精和伊红(HE)染色观察梗死心肌组织形态;采用放射免疫法(RIA)测定急性心肌缺血大鼠血浆去甲肾上腺素(NE)和脑钠肽(BNP)的含量;采用荧光定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR)、免疫组织化学(IHC)等方法,观察AMI大鼠RVLM神经元型一氧化氮合酶(nNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化:应用中枢核团微量注射方法观察NO及NOS抑制剂在RVLM对针刺作用的影响以及NO/NOS在对AMI大鼠血压和心功能的调节作用;采用微透析结合高效液相色谱-荧光检测研究参与上述过程的氨基酸递质的改变。结果:(1)冠状动脉左前降支结扎后,大鼠立即出现心电图S-T段抬高,结扎线远端心肌发白,运动减弱,说明AMI模型制备成功。冠脉结扎术后5天,TTC及HE染色显示AMI后坏死的心肌组织,心梗组大鼠外周血液中脑钠肽(BNP),去甲肾上腺素(NE)水平较假手术组升高;(2)针刺AMI大鼠内关穴20min,连续5天,可以降低AMI大鼠心肌梗死面积及血液中BNP和NE的水平;(3)针刺组大鼠HR,MAP下降,其它各项心功能指标均有明显改善,包括LVSP,-dp/dt,+dp/dt和LVEDP下降;(4)若电针前于RVLM微量注射NOS非选择性抑制剂左旋硝基精氨酸甲基酯(L-NAME15 nmol/100nl),或者iNOS抑制剂氨基胍(AG,250pmol/100 nl)或者nNNOS抑制剂7-硝基吲唑(7-NI,5 pmol/100 nl),除HR和MAP外,电针改善AMI心功能的作用被取消或减弱;(5)Realtime-PCR结果表明:正常Wistar大鼠iNOS与nNOS在RVLM均有表达。与对照组假手术相比,AMI大鼠RVLM区nNOS mRNA表达明显增加而iNOS mRNA的表达减少;(6)IHC结果显示,在延髓,nNOS和iNOS阳性神经元主要分布在RVLM、中缝核、巨细胞旁外侧核背侧部。舌下神经核和下橄榄核等处也有阳性细胞分布。AMI大鼠RVLM的nNOS阳性细胞明显多于对照大鼠,而iNOS阳性细胞数明显降低,针刺治疗可以降低AMI大鼠nNOS阳性细胞数,升高其iNOS阳性细胞数;(7)在正常和AMI大鼠,微量注射NO供体L-精氨酸(L-arginine 50 nmol,100 nmol/100nl)至RVLM能够在上述2组大鼠产生明显的MAP和HR降低,MAP呈现剂量依赖性降低并且在AMI大鼠更明显。RVLM注射NOS非选择性抑制剂L-NAME(15nmol/100 nl)能够升高血压加快心率。RVLM注射AG(250 pmol/100 nl)能够产生与L-NAME类似效应,血压升高,心率明显加快。与此相反,7-NI(5 pmol/100nl)能够降低血压和心率(8)在引起血压心率变化的同时,在RVLM注射AG后第一,二个10 min RVLM透析液中抑制性氨基酸(IAA)γ—氨基丁酸(GABA),牛磺酸(Tau)释放减少而兴奋性氨基酸(EAA)天门冬氨酸(Asp)释放增加;在RVLM注射7-NI后第一,二个10 min可见RVLM透析液中EAA谷氨酸(Glu)释放减少IAA甘氨酸(Gly)和牛磺酸(Tau)释放增多;(9)AMI大鼠RVLM透析液中EAA:Glu,Asp释放增多而IAA:GABA和Tau释放减少。针刺可以减少Glu,而增加GABA和Tau的释放。结论:(1)采用结扎大鼠左冠状动脉前降支(LAD)的方法,能成功造成AMI大鼠模型,该模型大鼠外周交感活性增高伴随心功能各项指标减弱。(2)针刺AMI组大鼠内关穴,可以降低交感活性,改善大鼠血流动力学指标,改善心功能。NOS抑制剂能够部分取消针刺改善心功能的效应,说明这种效应可能与NO介导有关。(3)针刺内关穴可以调节nNOS和iNOS在RVLM内表达量,同时可以减少AMI大鼠RVLM区EAA递质GLU释放,而增加IAA GABA和Tau释放,这可能与针刺降低AMI大鼠中枢交感活性有关。(4)NO在RVLM能降低正常大鼠及AMI大鼠升高的血压和心率,在AMI大鼠上效果更明显。(5)nNOS来源的NO在RVLM能促进兴奋性GLU释放,而抑制性Gly,Tau释放减少而发挥其升压和加快心率的效应,而iNOS来源的NO在RVLM主要通过增加IAA递质GABA,Tau和减少EAA Asp发挥其降压和减慢心率的作用。(6)针刺改善大鼠AMI作用的中枢机制之一可能是在RVLM通过增加iNOS和减少nNOS的表达而影响NO的生成,从而调节兴奋性/抑制性氨基酸递质的比例,进而减少交感传出,这可能是针刺治疗伴有交感活性升高的AMI大鼠的机制之一。
李元海[6]2004年在《呱氨托美汀镇痛和胃保护作用及其部分机制的研究》文中进行了进一步梳理呱氨托美汀(Amtolmetin guacyl，AMG)是一种新的非甾体抗炎药(Nonsteroidalanti-inflammatory drug，NSAID)，1993年在意大利研制成功并上市，2001年在美国成功上市，目前国内尚未上市。AMG的代谢产物为MED5和托美汀(Tolmetin，TOL)。AMG及其代谢产物MED5，TOL均具有抗炎、镇痛作用。AMG是非选择环氧化酶(Cyclooxygenase，COX)抑制剂，通过抑制前列腺素(Prostaglandins，PGs)合成发挥较强抗炎镇痛作用。 本课题利用不同动物疼痛模型探讨AMG在外周和中枢镇痛作用及其作用机制。研究NO在外周和中枢水平对AMG镇痛作用的影响，AMG对nNOS和c-Fos蛋白表达影响。通过AMG对胃黏膜上皮细胞释放NO影响及其抗氧化作用研究，探讨AMG胃粘膜保护作用及其机制。主要内容如下： 1 AMG镇痛作用 AMG(75，150与300mg·kg~(-1))对小鼠热水缩尾疼痛、热板疼痛、醋酸扭体疼痛、福尔马林疼痛的第二时相具有明显的镇痛作用。AMG(50，100与200mg·kg~(-1))对大鼠福尔马林致痛模型第二时相疼痛具有明显的镇痛作用。AMG(50，100与200mg·kg~(-1))对大鼠慢性坐骨神经结扎(chronic constriction injury，CCI)疼痛有明显镇痛作用，并且随剂量增加AMG镇痛作用增强。提示AMG具有明显外周和中枢镇痛作用且呈剂量依赖性。 2 AMG镇痛作用机制安徽医科大学博士学位论文2.1 AMG的抗氧化作用 枷Gig(75，150，300mg·kg-‘)不仅降低从致痛小鼠升高的血清MDA含量而且提高其下降的血清SOD活性，提示AMG可能通过抗氧化发挥镇痛作用。2.2 NO对AMG镇痛调控作用 热板、FA，AA诱导疼痛模型组的脊髓和脑组织匀浆上清液、血清N02一含量和正常对照组比较明显升高(尸<0.05，尸<0.01)。结果表明热板、FA，AA致痛模型组对NO有显着影响，其中AA致痛模型对NO影响最明显。AMG(150，300mg·k扩)明显降低AA疼痛模型小鼠脊髓和脑组织上清液Nos及NO2.含量。 AMG+L一Aig组与AMG组比较小鼠巧min内扭体次数显着增多(尸<0.05)，而AMG+LNAME组与AMG组比较小鼠15min内扭体次数显着下降(尸<0.05)，提示L-Aig可能存在拮抗，而LNAME有协同作用。LAig和LNAME可能对AMG镇痛作用有一定影响。AMG，LNAME，AMG十L-NAME组明显降低脊髓和脑组织上清液N02一含量，而LAig，AMG+L一Aig+LNAME明显提高脊髓组织上清液NOZ一含量。 与AMG组比较AMG+LNAME组FA致痛第二时相小鼠累计舔足时间显着减少，而AMG+LArg组FA致痛第二时相小鼠累计舔足时间显着延长(尸<0 .05)。表明LAig降低AMG的镇痛作用，而LNAME却增加AMG的镇痛作用，因此AMG可能通过调控中枢和/或外周 NOS活性与NO释放发挥镇痛作用。 免疫组织化学染色显示nNOS阳性神经元为胞浆棕色深染而胞核兰色浅染;c一Fos阳性神经元为胞核呈棕褐色深染与胞浆浅棕色浅染。AMG(100，200 mg .kg一，)组脊髓和脑nNOS与c一FoS阳性神经元明显少于模型组;平均光密度明显降低，AMG明显抑制脊髓和脑组织nNOS与c一Fos阳性表达。提示AMG可能通过抑制脊髓和脊髓上nNOS和c一Fos表达发挥镇痛作用。 RT一pCR表明AMG(50，100，200 mg·kg一‘)明显抑制队致痛大鼠脊髓nNosmRNA表达。westem一blot也提示AMG(50，100，200 mg·kg一，)同样明显抑制FA致痛大鼠脊髓nNOS蛋白表达。进一步提示AMG可能通过抑制脊髓nNOS的活性发挥其脊髓或脊髓上镇痛作用。安徽医科大学博士学位论文2.3 AMG对大鼠CCI血液、脊髓与脑组织TNF一Q的影响 ToL(60 mg·kg-‘)与AMo(50，100，200 mg·kg一‘)明显降低升高的血清翎F-。含量，AMG(100，2 00 mg·k扩)明显降低升高的脊髓和坐骨神经匀浆上清液TNF一a水平。提示AMG可能抑制血清、脊髓和坐骨神经的TNF一Q水平发挥外周和中枢镇痛作用。2.4 AMG对大鼠CCI血液、脊髓与脑组织PGEZ的影响 拍L(60 mg·kg一‘)与AMG(50，100，200 mg·kg‘)明显降低升高的血清PoEZA值，AMG(100，200 mg·ks-l)明显降低升高的脊髓和坐骨神经匀浆上清液PGEZA值。提示AMG可能抑制血清、脊髓和坐骨神经的PGE:的释放发挥外周和中枢镇痛作用。3AMG对胃粘膜保护作用 AMG(75，150，300 mg·k扩)组连续给药7d后体重增加明显。AMG分别以(75，150，300 mg·kg-，)剂量连续给药7d，胃损伤评分结果与正常对照组比较差异无显着性。与模型组比较AMG(75，150，300 mg·kg一，)对乙醇诱导胃损伤指数明显减小(尸<0.05)。整体图象显示AMo(75，150，300 mg·kg一，)组乙醇诱导胃粘膜未见明显出血灶，充血明显减轻。光镜显示AMG(75，150，3 00 mg·kg.，)组乙醇诱导胃粘膜上皮细胞与壁细胞损伤较轻。电镜显示AM以巧0，300 mg·kg一，)组乙醇诱导胃粘膜的微绒毛大部分完整，排列尚整齐，仅少量缺损、短小。表明AMG对胃粘膜损伤有明显保护作用。4AMG胃粘膜保护作用机制 与模型组比较，AMG(75，150，300 mg·k扩)显着提高胃组织匀浆上清液的NOZ一与Nos含量;AMG(150，300 mg·k扩)明显降低升高的胃组织匀浆上清液MDA含量，而显着提高下降的SOD含量。表明AMG可能通过增加胃粘膜上皮细胞NOS活性，促进NO释放和抗氧化作用发挥
参考文献：
[1]. ERK与NO信号通路在神经病理性疼痛模型大鼠脊髓背角内痛觉信号传递中的交互作用[D]. 杨桐伟. 吉林大学. 2011
[2]. 电针对兔急性心肌缺血时脊神经节内NOS和AchE表达的影响[D]. 陈嘉. 广州中医药大学. 2001
[3]. 脊髓背角iNOS过表达在带状疱疹后遗神经痛大鼠模型中的表达及意义[D]. 张丹龙. 第四军医大学. 2015
[4]. 糖尿病大鼠脑干nNOS免疫阳性神经元的变化[D]. 林宏生. 暨南大学. 2003
[5]. 针刺内关穴调节延髓NO/NOS系统及其有关神经递质改善大鼠心肌缺血作用机制探讨[D]. 夏春梅. 复旦大学. 2008
[6]. 呱氨托美汀镇痛和胃保护作用及其部分机制的研究[D]. 李元海. 安徽医科大学. 2004
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