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囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚的研究

2020-12-08阅读(958)

囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚的研究

论文摘要

解决器官相关致死性疾病最有效方法是器官移植,但是可被用于移植供体的相应器官来源、数量十分有限,因此提出设想,用囊胚补偿法在动物体内制备出特定的人源化猪器官/组织,用来减缓出现的器官供应短缺的阻碍。由于猪,特别是小型猪和人类在众多生理生化、身体结构等方面相似性十分高,因此利用经基因编辑过的具有发育“空位”的小型猪与可在特定部位进行补偿的囊胚补偿法制备可培育出特定的人源化器官或组织的嵌合体猪,可被使用解决移植用供体器官数量严重不足的问题,同时减缓因为移植出现的免疫排斥反应。1.缺乏延胡索酸乙酰乙酸水解酶（Fumarylacetoacetatehydrolase,FAH）会引起遗传性酪氨酸血症I型（Hereditary tyrosinemia typel,HTI）,致使患者的肝脏细胞出现凋亡现象,进而呈现出肝损伤表现。本研究利用 α-1,3-半乳糖基转移酶基因（α-1,3-galactosyltransferase,GGT41）敲除巴马猪的组织样本作为研究基础材料,利用CRISPR/Cas9和体细胞核移植技术制备FAH基因敲除（FAH+/-、FAH-/-）猪,并分析其健康与繁育状况。采集FAH+/-巴马猪血液,检测其血生化与血常规指标;当F0代FAH+/-巴马猪公猪性成熟后,与野生型（wild type,WT）母猪配种,以其产仔数评价繁育能力状况。通过WestemBlot检测FAH+/-巴马猪FAH蛋白表达量有所下降。此FAH+/-巴马猪的成功获得为后续制备HTI疾病模型猪及人源化器官的研究提供了可靠的数据及材料。2.KITLG（KIT ligand）又称干细胞因子（SCF）,是一种结合CD117（C-kit）的细胞因子,是造血干/祖细胞生存、增生和分化的重要生长因子。由于KITLG基因的敲除会使机体造血系统发育出现障碍,使得该基因敲除猪无法在母体内正常生长发育,因此48d时杀猪取胚胎,10只胚胎中只有一只保持较为完整的形态,其余均退化剩余部分肉糜状组织。提取胚胎基因组DNA鉴定突变类型均为KITLG-/-,KITLG-/-胚胎与相似发育阶段野生型胚胎比较,体型明显小于野生型且肝脏也小于野生型的且呈现出灰白色;HE染色后观察KITLG-/-胚胎肝脏切片中缺少血管内皮血细胞。由于KITLG基因的敲除会造成该基因克隆猪造血功能缺陷使其无法存活,因此获得相关早期胚胎,为后续制备可生产人血液嵌合体猪奠定研究基础。3.本研究通过囊胚补偿法,利用可造成机体特定器官发育受阻的FAH和KITLG基因的敲除胚胎作为实验组,通过显微注射将人类胚胎干细胞注入来填补发育空缺,在理论上增加嵌合体的嵌合成功率与嵌合程度。KITLG-/-胚胎在注射H9-td Tomato细胞后并未像FAH-/-胚胎和孤雌胚胎一样可正常发育到囊胚阶段;在随后观察各组桑椹胚期及囊胚期注射H9-td Tomato细胞胚胎时,发现它们的桑椹胚数及囊胚数与对照组未进行注射的相比,数目均有所下降。由于人、猪之间物种差异极大,通过荧光显微镜观察,猪囊胚与H9-td Tomato细胞嵌合率极低。总之,本研究探索了利用囊胚补偿法制备人-猪嵌合胚,为将来获得人源化器官,推进了异种嵌合体及异种移植的研究并提供了可供参考的有价值基础理论研究数据。本研究将畜牧学与医学相结合,是畜牧学应用于医学的研究。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一部分 文献综述
  •   第一章 嵌合体制备人源化猪器官/组织的研究
  •     1.1 异种移植简介
  •     1.2 嵌合体简介
  •     1.3 嵌合体研究进展
  •     1.4 人-猪嵌合体研究现状
  •       1.4.1 hiPSC的全能性及新干细胞的发现
  •       1.4.2 对宿主猪进行基因改造
  •     1.5 人-猪嵌合体面临的问题
  •       1.5.1 低嵌合效率
  •       1.5.2 嵌合过程中细胞贡献的不可控性
  •       1.5.3 道德问题的进一步开放
  •   第二章 FAH基因及KITLG基因研究进展
  •     2.1 FAH基因相关研究
  •       2.1.1 FAH基因与HTI相关性研究进展
  •       2.1.2 NTBC作用机制研究
  •       2.1.3 遗传性酪氨酸血症1型相关疾病模型研究进展
  •     2.2 KITLG基因相关研究
  • 研究目的及意义
  • 第二部分 实验内容
  •   第一章 FAH基因敲除巴马猪的制备
  •     1.1 材料与方法
  •       1.1.1 实验材料
  •     1.1.1.1 动物性材料
  •     1.1.1.2 相关仪器与耗材
  •       1.1.2 主要试剂
  •       1.1.3 实验方法
  •     1.1.3.1 CRISPR/Case 9载体的设计与构建
  •     1.1.3.2 猪耳成纤维细胞系的建立
  •     1.1.3.3 sgRNA敲除效率检测
  •     1.1.3.4 单细胞克隆的获得及鉴定
  •     1.1.3.5 FAH基因敲除猪的制备及鉴定
  •     1.1.3.6 仔猪血常规与血生化检测
  •     1.1.3.7 Western Blot检测
  • +/-猪繁育能力统计'>    1.1.3.8 FAH+/-猪繁育能力统计
  •     1.1.3.9 数据统计与分析
  •     1.2 实验结果
  •       1.2.1 打靶载体构建及效率检测
  •       1.2.2 单细胞克隆突变类型鉴定
  •       1.2.3 FAH基因敲除猪制备及鉴定
  •       1.2.4 仔猪血液检测
  •       1.2.5 Western Blot检测
  • +/-猪繁育能力分析'>      1.2.6 FAH+/-猪繁育能力分析
  •     1.3 讨论
  •     1.4 小结
  •   第二章 KITLG基因敲除五指山猪胚胎制备
  •     2.1 材料与方法
  •       2.1.1 实验材料
  •     2.1.1.1 动物性材料
  •     2.1.1.2 相关仪器与耗材
  •       2.1.2 主要试剂
  •       2.1.3 实验方法
  •     2.1.3.1 打靶载体设计与构建
  •     2.1.3.2 猪耳成纤维细胞系复苏与转染
  •     2.1.3.4 sgRNA敲除效率检测
  •     2.1.3.5 单细胞克隆的获得及鉴定
  •     2.1.3.6 KITLG基因敲除猪胚胎的制备及鉴定
  •     2.1.3.7 石蜡切片及HE染色观察
  •     2.2 实验结果
  •       2.2.1 sgRNA打靶载体的构建及基因突变效率检测
  •       2.2.2 单细胞克隆鉴定
  •       2.2.3 KITLG基因敲除猪胚胎的制备及鉴定
  •       2.2.4 石蜡切片及HE染色观察
  •     2.3 讨论
  •     2.4 小结
  •   第三章 囊胚补偿法制备人-猪嵌合囊胚
  •     3.1 材料与方法
  •       3.1.1 实验材料
  •     3.1.1.1 动物性材料
  •     3.1.1.2 相关仪器与耗材
  •       3.1.2 主要试剂
  •       3.1.3 实验方法
  •     3.1.3.1 单克隆细胞复苏与培养
  •     3.1.3.2 孤雌囊胚的制备
  • -/-、KITLG-/-体细胞核移植胚胎的制备'>    3.1.3.3 FAH-/-、KITLG-/-体细胞核移植胚胎的制备
  •     3.1.3.4 人胚胎干细胞H9无滋养层培养
  •     3.1.3.5 注射法制备嵌合囊胚
  •     3.2 实验结果
  •       3.2.1 孤雌及重构胚胎制备
  •       3.2.2 人胚胎干细胞H9无滋养层培养
  •       3.2.3 显微注射制备嵌合囊胚
  •     3.3 讨论
  •     3.4 小结
  • 总结论
  • 参考文献
  • 附录 英文缩略词
  • 致谢
  • 攻读硕士期间发表的论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 王莎莎

    导师: 卢晟盛,潘登科

    关键词: 基因,囊胚互补,嵌合体

    来源: 广西大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,生物医学工程

    单位: 广西大学

    分类号: R318;Q813

    总页数: 79

    文件大小: 4727K

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