（云南省第二人民医院云南昆明650021）
【摘要】目的：观察糖尿病SD大鼠在12、16、20、24周病程中，肾脏早期损伤指标变化、VEGF和mTOR基因表达及与肾脏损伤间的关系。方法：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，链脲佐菌素（STZ）造模，糖尿病（DM）成模后第12、16、20、24周，选取DM组分别为7、6、6、9只和NDM组各5只，测定晨尿白蛋白/肌酐比值(UACR)；肾脏肥大指数(KW/BW)；光学显微镜下观察肾小球及肾小管病理改变程度半定量评分(HS)；电子显微镜下测定GBM厚度；免疫组化(IHC)测定VEGF、VEGFR2、mTOR抗体在左肾中半定量评分基因蛋白的表达；实时定量PCR（RT-Q-PCR）荧光染料法检测VEGF、VEGFR2、mTOR基因在右肾中mRNA表达，用标准化后基因的标化值(SCt)半定量PCR产物。结果：UACR在DM组高于NDM组；KW/BW比值、光镜下HS在总的DM组及各病程DM组均高于同期NDM组，20、24周DM组较12周明显升高，P<0.01，KW/BW比值与光镜下HS在总的DM组正相关；GBM厚度在总的DM组明显高于NDM组，与UACR在总的DM组及24周DM组正相关。VEGF、VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组及各病程DM组均高于NDM组，二者在总的DM组中正相关，均与光镜下HS正相关，P值均<0.05。VEGF、VEGFR2基因SCt值在总的DM组均明显高于NDM组，VEGF基因SCt值在DM组间12周表达最高，24周次之，较16、20周明显升高，P<0.01；VEGFR2基因SCt值在DM组间随病程延长逐渐降低，24周最低。VEGF基因SCt值与VEGFR2基因SCt值在总的DM组明显正相关，P<0.01，与GBM厚度在总的DM组正相关。mTOR基因IHC半定量评分及SCt值在总的DM组及各病程DM组与NDM组比较，统计学均未见明显差异，但mTOR基因与VEGF、VEGFR2基因三者的IHC半定量评分在总的DM组中均互相正相关，均与光镜下HS正相关，P值均<0.05。结论：UACR、KW/BW比值、光镜下HS及GBM厚度在糖尿病SD大鼠中升高，反应肾脏损伤，其中24w病程变化更显著，KW/BW比值与光镜下HS正相关，GBM厚度与UACR正相关。VEGF、VEGFR2基因蛋白及mRNA在DMSD大鼠中肾脏中表达，且随着DM病程增长表达协同增高；VEGFmRNA表达与DNGBM厚度正相关；mTOR基因蛋白表达可能与VEGF、VEGFR2基因在糖尿病SD大鼠DN有协同相关作用，但不排外不同病程、不同动物样本量表达结果及实验条件可能存在结果差异。
【关键词】糖尿病SD大鼠；肾脏损伤；VEGF与mTOR基因间关系
【中图分类号】R725【文献标识码】A【文章编号】1004-6194（2015）02-0166-03
EvaluationstudyindiabeticratsoftherelationshipbetweenVEGFandmTORgeneonnephropathyindicators
TAOWen-yuLiYi-ping
DepartmentofEndocrinologyTheSecondHospitalofYunnanProvinceKunming650021,China
【Abstract】Objective：TostudytherelationshipbetweenVEGFandmTORgeneonnephropathyindicatorsindiabeticrats.Methods：Forty-eightmaleSprague-Dawley（SD）ratswerepidedintodiabetesmellitusgroup(DM=28)andcontrolgroup(NDM=20).Diabeticmodelswereproducedbyinjectionofstreptozotocin.Inthecourseof12,16,20,24week,nephropathyindicatorsincludingfastingurinaryalbuminandcreatinineratio(UACR)，renalhypertrophyindex(kidneyandbodyweightration,KW/BW)，thehistologyscores(HS)andtheglomerularbasementmembrane(GBM)thicknesswerecollected.TheproteinandmRNAexpressionofthegeneofVEGF,VEGFR2,mTORwereobservedbyImmunohistochemical(IHC)andreal-timequantitativepolymerasechainreaction（RT-Q-PCR）bySYBRGreen.AndtheStandardizedCycleofthreshold（SCt）wasregardedastheindicatorsofthemRNAexpression.Results：UACRwashigherinDMratsthanthoseofNDMrats.KW/BWandHSwerehigherinDMratsthanthoseofNDMrats,especiallyhighinDMratsofthecourseof20,24w(P<0.01).KW/BWwaspositivecorrelationtoHSintotalDMrats.ThethicknessofGBMwashigherintotalDMratsandwaspositivecorrelationtotheUACRintotalDMratsandthecourseof24winDMrats.TheIHCscoresofthegeneofVEGF,VEGFR2werehigherintotalDMratsandwerepositivecorrelationeachother,werepositivecorrelationtotheHSintotalDMrats(P<0.05).TheSCtofthegeneofVEGF,VEGFR2weresignificantlyhighintotalDMratsandwaspositivecorrelationeachotherintotalDMrats(P<0.01).TheSCtofVEGFwaspositivecorrelationtothethicknessofGBMintotalDMrats.TheSCtofVEGFwashighestinthecourseof12wDMrats.TheSCtofVEGFR2graduallydecreasedfollowingbythediabeticcourse.TheIHCscoresandSCtofmTORwerenotsignificantlydifferenceinDMratsthanthoseofNDMrats.ButtheIHCscoresofthegeneofmTOR,VEGF,VEGFR2werepositivecorrelationeachother,werepositivecorrelationtotheHSintotalDMrats(P<0.05).Conclusion：UACR，KW/BW，HSandthethicknessofGBMwerehighindiabeticSDrats,especiallyinthediabeticcourseof24w,whichcanreflecttheinjuryofnephropathy.InDMrats,KW/BWwaspositivecorrelationtotheHS,thethicknessofGBMwaspositivecorrelationtotheUACR.TheproteinandmRNAofthegeneofVEGF,VEGFR2werehighexpressedinDNoftheDMratsandincreasedfollowedbytheincreasingofdiabeticcourse.ThemRNAexpressionofthegeneofVEGFwaspositivecorrelationtothethicknessofGBMinDN.TheproteinexpressionofthegeneofmTOR,VEGF,VEGFR2mightcollaborativemakinginDNinDMrats.Buttheresulscouldbedistinguishedtotheotherdiabeticcourse,samplesize,experimentalerror.
【Keywords】diabeticSDrats;nephropathyindicators;relationshipbetweenVEGFandmTORgene
糖尿病肾病(diabeticnephropathy,DN)是引起终末期肾病的主要原因，也是糖尿病（Diabetesmellitus,DM）患者逐渐增加的死亡终点之一。多种因子包括血管内皮生长因子（Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）及其主要效应的靶受体之一VEGFR2（Vascularendothelialgrowthfactorreceptor2）与DN的发生发展机制近几年正在被了解。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalsTargetofRapamycinmTOR），是一种细胞质激酶，调节细胞生长代谢及细胞对促细胞有丝分裂物（如胰岛素样生长因子IGF-I、血管内皮生长因子）、营养物（氨基酸、葡萄糖、脂肪酸）、激素（包括胰岛素、细胞因子）等的应答【1-3】。营养相关的mTOR途径是新生组织生长发育的基础，代谢综合征和衰老的基质增加了癌症风险【4-6】，故mTOR近年来主要在肿瘤相关疾病研究中备受关注。DM属于一常见的代谢综合征，mTOR与DM并发症之间的关系研究报道不多，故本课题设计观察糖尿病SD大鼠在12、16、20、24周病程中，肾脏早期损伤指标变化、VEGF和mTOR基因表达及与肾脏损伤间的关系。
1资料与方法
1.1糖尿病模型的建立昆明医科大学实验动物中心提供雄性约6周龄的Sprague-Dawley（SD）大鼠，共60只，体重（335.83±27.65）g，清洁级，实验专员正常鼠料及垫料饲养8周后，进行糖尿病大鼠造模，予链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（美国Sigma公司）20-60mg/kg溶于柠檬酸缓冲液（上海国药集团化学试剂有限公司）（PH4.4，0.1%）专人一次性腹腔注射，注药后5天、8天、13天监测尾静脉晨间微量血糖（美国强生稳豪血糖仪及血糖试纸），未造模成功者补打STZ，直到血糖均达到造模成功标准（均>16.7mmol/L）。
1.2实验资料收集及检测分别在DM成模后12、16、20、24周，每阶段随机抽取DM组分别为7、6、6、9只和同期非糖尿病组对照（NDM)各5只，处死前用标准动物实验代谢笼收集晨尿送检，测定尿白蛋白/肌酐比值(urinaryalbuminandcreatinineratio，UACR)，（离心3千转5分钟，提取上清液，日立7600全自动生化分析仪，免疫放射比浊法测定）。
1.3肾脏标本制作处死标本解剖后由同一位实验员立即摘取双肾，分别记录左、右肾质量，计算肾脏肥大指数（renalhypertrophyindex）即双侧肾脏质量之和/体质量(kidneyandbodyweightration,KW/BW)；统一取每只大鼠的左肾，用10%中性缓冲甲醛固定，送病理科由固定专业人员取材后进行脱水、透明、浸蜡、包埋，制作切片厚度3-4um，光学显微镜（日本奥林巴斯BX50，x100，x200）下由专业人员HE染色观察肾小球及肾小管形态，每只肾脏标本至少3张切片置于显微镜下观察,每张切片随机计数5个不同视野的肾小球和肾小管，以肾小球、肾小管改变的明显程度,-为无明显异常、+为<25%、++为25%-50%、+++为50%-75%、++++为>75%，取其平均值，进行光镜下病理改变(histologyscores，HS)半定量评分；每只肾脏标本至少取3块组织在电子显微镜(美国FEI，Quanta200，x20000)下测定肾小球基底膜（theglomerularbasementmembrane，GBM)厚度，取平均数值；脱蜡、水化，根据第一抗体（美国Thermo公司，摸索条件后适合稀释浓度为VEGF1：100、VEGFR21：100、mTOR1：800）的要求，对组织进行相应的抗原修复（柠檬酸修复PH6.0），采用免疫组化MaxVision2/HRP染色，光学显微镜（x100，x200）观察每只切片随机计数5个不同视野的肾小球和肾小管，呈阳性反应的肾小球或肾小管细胞数占细胞总数的百分比,取其平均值，显色愈深代表阳性表达愈强,根据染色面积和强度按下列计数进行免疫组化(immunohistochemical，IHC)半定量评分,1=无染色或微弱染色面积<25%;2=染色面积在25%-50%之间;3=染色面积在50%-75%之间;4=染色面积>75%。
1.4检测VEGF、VEGFR2、mTOR基因的mRNA表达统一取每只大鼠的右肾加Trizol保存后，立即予液氮冻存标本，分批在我院分子实验中心由专业人员提取冻存管中的肾脏样本总RAN，采用实时定量PCR（real-timequantitativepolymerasechainreaction，RT-Q-PCR）荧光染料（SYBRGreen）方法，对目标基因VEGF、VEGFR2、mTOR和ΒACTIN（引物由美国ABI公司软件PrimerExpress3.0设计，上海生工生物技术服务公司合成）半定量分析PCR产物表达，PCR结束后采用溶解曲线确定产物特异性（美国ABI7300随机软件自动计算出每个样本的目标基因和管家基因ΒACTIN的Ct值(Cycleofthreshold)，数据经处理后得到经ΒACTIN标准化后的基因的标化值(SCt)，该标化值反映样本中基因的真实表达情况。
1.5统计学方法用SPSS统计软件(19.0版)进行处理,计量资料以均数±标准差(x±s)表示，组内比较用独立样本t检验，组间比较用单因素方差分析，ANOVA分析法。病理半定量评分采用秩和检验分析。相关性分析采用线性相关分析（Pearson/Spearman）法。P<0.05示差别有统计学意义，P<0.01差别有显著统计学意义。
2结果
2.1不同病程的SD大鼠肾脏损伤指标（见表1）
IHC半定量评分秩均值SCt
DM组与NDM组比较中：*P<0.05，**P<0.01。在第12周、16周、20周、24周DM组的组间比较中：与12w比较，ΟP<0.05，ΟΟP<0.01；与16w比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与20w比较，◇P<0.05，◇◇P<0.01。
2.2镜下病理改变光学显微镜下NDM组（见图1示）肾脏结构基本正常，DM组中（见图2示），肾小球部分肥大、瘀血，球袢结构不清，毛细血管腔变窄，基质增多，系膜增厚，系膜细胞增多，近曲小管水肿，有的可见局灶性炎性细胞分布，有的还可见小部分肾小球萎缩。电镜下DM组GBM不规则增厚，足细胞连续性中断、结构不清晰。免疫组化中肾小球及肾小管染色情况，正常细胞核呈蓝色（见图3示）,阳性反应细胞核呈棕褐色，VEGF及VEGFR-2的免疫复合物主要在肾小球毛细血管壁胞浆内见棕褐色颗粒沉积（见图4示），VEGF的免疫复合物有部分还在肾小管上皮细胞胞浆内见棕褐色颗粒沉积，mTOR的免疫复合物（见图5示）部分在近端肾小管上皮细胞胞浆内见棕褐色颗粒沉积，极少数见远端肾小管上皮细胞胞浆内棕褐色颗粒沉积。
图6图7
2.4各指标间相关性肾脏肥大指数：与光镜下HS在总的DM组正相关，r=0.387，P=0.042；与GBM厚度12周DM组中明显正相关，r=0.955，p=0.003。GBM厚度：与UACR在总的DM组及24周DM组正相关，分别的r=0.420、0.753，P=0.026、0.019。VEGF基因IHC半定量评分与光镜下HS在总的DM组及16周DM组正相关，分别r=0.605、0.894，p=0.001、0.016。VEGFR2基因IHC半定量评分：与光镜下HS在总的DM组明显正相关，r=0.543，p=0.003，与VEGF基因IHC半定量评分在总的DM组及16、24周DM组均正相关，分别r=0.618、0.853、0.704，p=0.000、0.031、0.034。mTOR基因IHC半定量评分：与光镜下HS在总的DM组及16周DM组正相关，分别r=0.443、0.953，p=0.018、0.003；与VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组及20周DM组正相关，分别r=0.502、0.876，p=0.006、0.022；与VEGF基因IHC半定量评分在总的DM组及16、24周DM组均正相关，分别r=0.480、0.826、0.857，p=0.010、0.043、0.003。mTOR基因SCt值：与UACR在总的DM组负相关r=-0.421，p=0.026；与GBM厚度16周DM组明显正相关r=0.963，p=0.002；与mTOR及VEGF基因IHC半定量评分均负相关，分别r=-0.897、-0.732，p=0.001、0.025。VEGFR2基因SCt值：与VEGF基因SCt值在总的DM组明显正相关，r=0.511，p=0.005；与光镜下HS在总的DM组负相关r=-0.466，p=0.012；与肾脏肥大指数在总的DM组明显负相关r=-0.508，p=0.006，而在24周DM组正相关，r=0.709，p=0.032。VEGF基因SCt值：与GBM厚度在总的DM组正相关，r=0.397，p=0.036。
3讨论
中国调查社区糖尿病患者DN患病率高达63.3%【7】，但我国目前尚未统一DN的诊断【8】，尿蛋白升高和肾脏病理损伤改变多年来均被推荐为DN评估的主要指标【9】。相比之下，UACR相对稳定，随机UACR与24小时尿蛋白有良好的相关性【10】，标本简便，只需检测随机时间点尿即可，故多推荐【11】UACR为临床糖尿病肾损伤的早期筛查及肾损伤程度的主要监测指标。本实验UACR在总的DM组及12、16、20、24周DM组均高于同期NDM组，其中12、24周DM组明显高于同期NDM组，但该实验不同病程DM组间比较未见统计学差异；有实验【12】DM大鼠病程4周KW/BW比值显著升高，显微镜下即可见肾小球体积增大，基底膜增厚、胞膜基质多。本实验SD大鼠KW/BW比值、光镜下HS在总的DM组及各病程DM组均明显高于同期NDM组，20、24周病程DM组较12周明显升高，而且KW/BW比值与光镜下HS在总的DM组正相关；GBM厚度在总的DM组明显高于NDM组，DM组24周明显高于16及20周，而且与UACR在总的DM组及24周DM组成正相关。上述结果提示尿UACR、KW/BW比值、光镜下HS及GBM厚度在糖尿病SD大鼠中升高，反应肾脏损伤，其中24周病程变化更显著。
自发现有促进血管内皮细胞生长的作用后，血管内皮生长因子正式被命名【13】。有报道【14】转基因小鼠模型中，VEGF表达上调引起蛋白尿、肾小球肥大，并证实了DN中VEGFR2在肾脏足细胞中表达，其与肾素间的相互作用及VEGF作用诱导了体内蛋白质的磷酸化。当VEGFR2与VEGF特异性结合后，刺激磷酸化肌球蛋白轻链激酶，导致肌球蛋白细胞骨架重构，内皮细胞间孔隙加大，大分子物质通透增加。这些正是DN血管系统和肾小球病理生理早期改变的角色之一。该实验VEGF、VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组均明显高于NDM组，其中VEGF基因IHC半定量评分在12、20、24周DM组明显高于NDM组，P<0.01，16周DM组高于NDM组，DM组间20周高于12周，P<0.05；VEGFR2基因IHC半定量评分16周、24周DM组高于NDM组，分别P<0.05及0.01，DM组间20周高于12周，P<0.05。VEGF与VEGFR2基因IHC半定量评分在总的DM组中明显正相关，均与光镜下HS明显正相关，P均<0.01。以上提示VEGF、VEGFR2基因蛋白在DMSD大鼠中肾脏中表达，且随着DM病程增长表达协同增高。
发生在糖尿病进程中的高血糖、胰岛素抵抗、高血压、血脂紊乱、中心性肥胖和一氧化氮（NO）合成受损等因素影响了血管中的血流及引起组织缺氧。有实验利用小鼠模型观察了NO缺乏在VEGFR2介导的内皮细胞增殖反应【15】，结果表明VEGFR2信号增强能够诱导异常的血管再生，进一步证实了内皮一氧化氮合成酶（eNOS）在糖尿病肾脏中缺乏。缺氧是诱导血管再生和许多基因(如VEGF和VEGFR2)表达的信号，由于它们表达的增加，继而产生糖尿病并发症的进展【16】，如文献提示VEGF和VEGFR2的表达明显增加了糖尿病肾病和视网膜病变的病理生理进程【17，18】。该实验VEGF、VEGFR2基因SCt值在总的DM组均明显高于NDM组，VEGF基因SCt值在12、16、20、24周DM组均明显高于NDM组，P<0.01，尤其DM组间12周表达最高，24周次之，较16、20周明显升高，P<0.01；VEGFR2基因SCt值在12、16、20周DM组均明显高于NDM组，P<0.01，DM组间SCt值随病程延长逐渐降低，24周最低。VEGF基因SCt值与VEGFR2基因SCt值在总的DM组明显正相关，P<0.01，与GBM厚度在总的DM组正相关。以上说明VEGF基因、VEGFR2基因mRNA在DMSD大鼠肾脏中协同表达，VEGFmRNA表达与DNGBM增殖病变正相关。
VEGF刺激血管形成，引起血-视网膜屏障损伤，有研究胰岛素/mTOR途径刺激了视网膜色素上皮细胞VEGF的合成【19】。在研究mTOR途径抑制DN进展的药物干预实验中，有数据显示DM组大鼠mTOR蛋白在肾小球水平较正常对照组增加12%（p<0.05）【20】，说明mTOR蛋白可能参与DN的发病过程。该实验mTOR基因IHC半定量评分及SCt值在总的DM组及各病程DM组与NDM组比较，统计学均未见明显差异；mTOR基因SCt值：与UACR在总的DM组负相关，与mTOR及VEGF基因IHC半定量评分均负相关，p<0.05。但mTOR基因与VEGF、VEGFR2基因三者的IHC半定量评分在总的DM组中均互相正相关，均与光镜下HS正相关，P值均<0.05，说明mTOR基因蛋白表达也可能与VEGF、VEGFR2基因在糖尿病SD大鼠DN有协同相关作用，亦不排外不同病程、不同动物样本量表达结果及实验条件可能存在结果差异。
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基金项目：
云南省应用基础研究基金资助项目（2013FZ193）