解脂耶氏酵母赤藓糖还原酶基因的克隆与功能鉴定及利用代谢工程手段提高其合成赤藓糖醇

论文摘要

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种非常规酵母（Nonconventional yeast）,是国际上工业生产赤藓糖醇的常用菌之一,也是我国企业生产赤藓糖醇唯一使用的菌株。赤藓糖醇因其不致龋齿性和低热量,被认为是一种优良的蔗糖替代品。合成赤藓糖醇的出发原料为葡萄糖,经过磷酸戊糖途径,生成中间产物D-赤藓糖,赤藓糖还原酶（ER）在辅因子NADPH的辅助作用下,能够催化D-赤藓糖为赤藓糖醇,该酶是赤藓糖醇合成途径中的一种关键酶。然而在产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母中,ER基因仍未被克隆鉴定,因此克隆鉴定该基因对于进一步提高解脂耶氏酵母合成赤藓糖醇的性能具有重要的价值。本次研究总共从产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母中鉴定了三种赤藓糖还原酶基因,分别是ER10、ER25、ER27,并将它们在大肠杆菌中异源表达。三种赤藓糖还原酶之间的氨基酸同源性小于35%,且都以NADPH作为辅因子。此外表征这三种赤藓糖还原酶的酶学性质,ER25酶催化速率最大,酸性环境对于酶活性更有利。敲除ER10、ER25、ER27基因的菌株依然能够利用葡萄糖合成赤藓糖醇,但其生产率和转化率都显著降低。同时敲除三种ER基因,可使酵母的赤藓糖醇生产率降低61%,转化率降低37%。将这三种ER基因分别在解脂耶氏酵母中过表达,相对于野生型对照酵母在生产率和转化率上分别会有15.6%和31.2%的提高。基于ER基因合成赤藓糖醇的重要性,又构建一个同时过表达ER10、ER25、ER27以及6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因（ZWF1）和6-磷酸-葡萄糖酸脱氢酶基因（GND1）的更高效的赤藓糖醇生产菌株。该菌株由葡萄糖合成赤藓糖醇的转化率达到63%（每克葡萄糖可产0.63克赤藓糖醇）,比对照组高了23.5%,在已有文献中是最高转化率。

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文章来源

类型: 硕士论文

作者: 程慧玲

导师: 程海荣

关键词: 解脂耶氏酵母,赤藓糖还原酶,赤藓糖,赤藓糖醇

来源: 上海交通大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,轻工业手工业

单位: 上海交通大学

分类号: Q78;TS202.3

DOI: 10.27307/d.cnki.gsjtu.2019.002769

总页数: 76

文件大小: 2716K

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