任可[1]2014年在《3-二辛硫基-1，1，1-叁氟-2-丙烷（OTFP）与农药对小菜蛾（Plutella xylostella）的联合作用》文中进行了进一步梳理小菜蛾(Plutella xylostella (Linn.))是十字花科蔬菜最重要害虫,每年为害与防治费用累计超过40-50亿美元,其中农药防治特别是化学农药防治一直是主要防治手段。但是小菜蛾对农药抗性发生快、水平高,防治难度不断加大,急需新的防治思路。本研究测定了几种常用农药及3-二辛硫基-1,1,1-叁氟-2-丙酮(OTFP)对小菜蛾的毒力；考察了OTFP对小菜蛾取食及生长发育的影响；探讨了OTFP预处理或与农药混配对小菜蛾的联合作用。主要研究结果如下：1.农药对小菜蛾的毒力丁醚脲、茚虫威、高效氯氰菊酯、阿维菌素、多杀菌素、氯虫苯甲酰胺、Bt和印楝素8种农药对小菜蛾3龄幼虫致死中浓度(LC50)分别为134.48mg·L-1、4.17mg·L-1、7601.73mg·L-1、23.61mg·L-1、1.82mg·L-1、4.4mg·L-1、0.14×106IU·L-1、54.02mg·L-1。4种农药丁醚脲、茚虫威、Bt、印楝素对小菜蛾4龄幼虫致死中浓度(LC50)分别为78.49mg·L-1、54.97mg·L-1、0.23×106IU·L-1、7.48mg·L-1。2.OTFP对小菜蛾的毒力OTFP对小菜蛾毒力很小,即便在5300mg·L-1浓度下,也未导致试虫死亡率明显提高(P>0.05)。3. OTFP对小菜蛾取食及生长发育的影响在所设定的2650mg-L-1与5300mg·L-1两个浓度下,试虫取食量没有显着改变。但OTFP处理后,3龄至4龄间隔延长、4龄幼虫化蛹推迟,影响随OTFP浓度的升高加剧。4.OTFP与农药对小菜蛾的联合作用OTFP预处理或与农药混配对小菜蛾联合作用结果表现为增效、相加和拮抗叁种类型,具体与农药种类、农药浓度、试虫龄期、联合作用方式有关。
王龙[2]2016年在《四氯虫酰胺对小菜蛾的亚致死效应研究》文中研究表明小菜蛾Plutella xylostella,是世界性害虫,对十字花科植物有严重危害。而在中国各地区的普遍发生,造成了全国范围内蔬菜产业的严重损失。从现有研究来看,对于小菜蛾的危害,主要以化学防治为主,但化学农药的频繁大量使用,会使小菜蛾对大部分使用过的或正在使用的杀虫剂产生抗药性,且这种抗药性相当强烈。本文所要研究的杀虫剂四氨虫酰胺是一种新型的双酰胺类杀虫剂,且与其他作用方式的杀虫剂没有产生交互抗性,具有独特的杀虫机制并对鳞翅目害虫具有良好的防治效果,因此有广泛的应用前景。本文研究了不同浓度的四氯虫酰胺对小菜蛾生存、化蛹和羽化的影响,四氯虫酰胺亚致死浓度对小菜蛾生物学特性和解毒酶系的影响，以及3种增效剂对四氯虫酰胺防治小菜蛾的增效作用。相关研究结果如下：(1)四氯虫酰胺不同浓度对小菜蛾3龄幼虫生存、化蛹和羽化的影响随着各处理中四氯虫酰胺浓度的增加和时间的推移,四氯虫酰胺对试虫的影响逐渐增强,死亡率不断升高,化蛹率、羽化率和蛹重都不断降低。其中CK经48h其死亡率为2%,蛹前累计死亡率为28%、化蛹率为72%、羽化率为64%,蛹重4.825mg,而浓度为0.00625mg/L的处理中,48h其死亡率为0%,但蛹前累计死亡率可达46%,羽化率也下降到了44%,死亡率明显升高。而浓度为0.8mg/L的处理,死亡率则在48h已达到82%,至化蛹时全部死亡,这都说明随着药剂浓度增加蛹前累计死亡率明显有上升的趋势,呈现出明显的剂量效应。(2)四氯虫酰胺亚致死浓度LC_(10)和LC_(25)对小菜蛾亲代和子代生物学特性的影响用四氯虫酰胺的LC_(10)和LC_(25)两个浓度处理小菜蛾亲代3龄幼虫后,发育历期、各阶段存活率等都受到了一定的影响,但对蛹重、成虫寿命和繁殖力没有影响。总体来说LC_(25)处理对小菜蛾的影响较强,LC_(25)处理组与对照组相比发育历期延长了1.78d,而LC_(10)处理组相比对照组只延长了0.43d。LC_(25)处理组与对照组相比成虫存活率减少了27.7%,LC_(10)处理组与对照组相比成虫存活率减少了15.2%。四氯虫酰胺LC_(10)和LC_(25)浓度处理小菜蛾亲代3龄幼虫后,对其子代仍然有一定的影响,但这些生物学参数在子代有所恢复。子代LC_(25)处理组与对照组相比成虫存活率只减少了6%,与亲代LC_(25)处理组相比增加了42%,单雌产卵量与对照组相比减少了35.2粒,与亲代LC_(25)处理组相比增加了17.7粒。子代LC_(10)处理组与对照组相比成虫存活率减仅少了4%,与亲代LC_(10)处理组相比增加了30.5%,单雌产卵量与对照组相比减少了39.0粒,与亲代LC_(10)处理组相比增加了16.9粒。LC_(10)和LC_(25)浓度的四氯虫酰胺处理小菜蛾后,其内禀增长率(r_(m))、净增长率(R_(0))和内周限增长率(λ)都低于对照,其中净增长率(R_(0))下降明显,其中LC_(10)和LC_(25)处理组净增长率分别比对照组低8.73%和8.16%,世代平均历期分别比对照延长了0.86d和0.79d。这些说明亚致死浓度的四氯虫酰胺对小菜蛾有一定的致死作用,而在子代,对繁殖力具有较强的抑制作用,从而达到抑制小菜蛾种群发展的目的,只是随着小菜蛾代数的增加对其生物学特性的影响可能会逐渐减弱。(3)3种增效剂对四氯虫酰胺防治小菜蛾的增效作用为了提升四氯虫酰胺对小菜蛾的防治效果,降低农药用量,采用浸叶法测定了DEM、DEF、PBO等3种增效剂对四氯虫酰胺防治小菜蛾的毒效比与增效比。结果显示,3种增效剂均不同程度提高四氯虫酰胺防治小菜蛾的毒效比,当四氯虫酰胺与DEM, DEF、PBO在最佳配比分别为1：5、1：3、1：4时毒效比最高,分别为2.55、3.30、3.18;DEM、DEF、PBO等3种增效剂与四氯虫酰胺在最佳配比时,对四氯虫酰胺防治小菜蛾均有增效作用,增效比分别为3.67、3.20、5.80。(4)四氯虫酰胺亚致死浓度对小菜蛾解毒酶系的影响。用四氯虫酰胺LC_(10)和LC_(25)浓度处理小菜蛾3龄幼虫,分别在1、6、12、24、48、和72h后测定酯酶(EST)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和多功能氧化酶(MFOs)的活性。总体上,处理组EST活性都低于对照组,LC_(25)处理组的活性低于LC_(10)处理组，说明亚致死浓度四氯虫酰胺对小菜蛾的EST活性具有一定的抑制作用。GST活性总体上都高于对照组,说明亚致死浓度的四氯虫酰胺对小菜蛾的GST活性具有一定的诱导作用。对于MFOs,随着药剂处理时间的增长,LC_(10)处理组和LC_(25)处理组MFOs活性相比对照出现显着下降,这说明LC_(10)和LC_(25)浓度下四氯虫酰胺处理小菜蛾，对MFOs活力具有明显的抑制作用。
邱浩[3]2012年在《华中地区小菜蛾抗药性监测及小菜蛾对丁醚脲抗性机制研究》文中研究指明小菜蛾是一种世界性十字花科蔬菜重要害虫,对蔬菜产量和质量影响较大,虽然化学防治可以有效控制小菜蛾,但由于抗药性间题,小菜蛾成为近50年来世界上难以控制的害虫之一。另外,我国十字花科蔬菜种植面积广阔,地理区域分布多样,这些都为小菜蛾防控带来了挑战。为了科学治理小菜蛾,本文监测了华中地区小菜蛾抗药性水平,筛选了防治小菜蛾的杀虫剂增效剂,研究了丁醚脲对小菜蛾的亚致死效应和对ATPase活力的影响,研究结果如下。1华中地区小菜蛾抗药性监测2010-2011年,采集华中地区(岳阳、洛阳、宜昌、武穴、云梦)小菜蛾田间种群,采用浸叶法测定其对常用杀虫剂的敏感性。结果表明,小菜蛾田间种群对杀虫剂抗药性呈现多样性。华中地区小菜蛾田间种群对阿维菌素抗性呈上升趋势,从中等水平抗性上升到高水平抗性；对Bt、高效氯氰菊酯抗性水平有所下降,但仍处于高水平抗性；对氟啶脲处于中等至高水平抗性,总体呈上升趋势；对氯虫苯甲酰胺、多杀菌素抗性有所上升,但仍处于低水平至中等水平抗性；对茚虫威抗性水平有所上升,由低水平上升到中等水平抗性；对溴虫腈、丁醚脲抗性水平低,处于敏感或敏感性下降水平。2增效剂对丁醚脲防治小菜蛾的增效作用为提高丁醚脲的防治效果,降低有效成分用量,采用浸叶法测定了DEM、TPP、PBO等3种增效剂对丁醚脲防治小菜蛾的毒效比与增效比,结果表明,3种增效剂均不同程度提高丁醚脲防治小菜蛾的毒效比,当丁醚脲与DEM、TPP、PBO在最佳配比分别为1：5,1：5,1：3时毒效比最高,分别为1.86、2.29、2.43：DEM、TPP、PBO等3种增效剂与丁醚脲在最佳配比时,对丁醚脲防治小菜蛾均有增效作用,增效比分别为1.41、1.36、1.42。3丁醚脲对小菜蛾的亚致死效应研究结果表明,亲代生长发育、繁殖力,子一代生长发育等生物学特征都受到亚致死剂量丁醚脲一定影响。小菜蛾亲代化蛹时间、蛹期整体上随丁醚脲浓度上升而延长,亲代化蛹率、羽化率、单对产卵量随丁醚脲浓度上升而降低,亲代雌雄蛹重处理之间无显着差异(p<0.05),小菜蛾亲代卵孵化率总体比较高,均在90%以上。小菜蛾子一代蛹期随丁醚脲浓度上升而延长,子一代化蛹率、羽化率随丁醚脲浓度上升而降低,子一代各处理间雌蛹重无显着性差异(p<0.05),而雄蛹重各处理间差异显着(p<0.05)。4丁醚脲对小菜蛾ATPase活性影响丁醚脲抗性小菜蛾Na-K-ATPase、Ca-Mg-ATPase活力较敏感小菜蛾高,而Ca-ATPase活力却比敏感小菜蛾低,表明丁醚脲抗性小菜蛾Na-K-ATPase、Ca-Mg-ATPase活性受到抑制。丁醚脲处理后,Na-K-ATPase、Ca-ATPase、Ca-Mg-ATPase活力均受到显着抑制,抑制率随丁醚脲浓度升高而增高,且对敏感小菜蛾抑制率大于抗性小菜蛾。在100mg/L浓度下抑制率最高,对敏感和抗性小菜蛾Na-K-ATPase活力抑制率分别为40.10%、28.62%,且呈显着差异；对敏感和抗性小菜蛾Ca-ATPase活力抑制率,分别为47.87%、27.55%,且呈显着差异；对敏感和抗性小菜蛾Ca-Mg-ATPase活力抑制率,分别为39.32%、36.36%。
汪宽福[4]2010年在《小菜蛾hsp70基因的克隆及其在抗、敏品系中热激表达差异研究》文中研究表明小菜蛾是世界性十字花科的重要害虫,也是重要的模式昆虫。本文以小菜蛾为研究对象,进行热休克蛋白70基因的克隆及其mRNA表达的初步研究,为以后的小菜蛾抗逆性和HSP70功能研究奠定基础。本研究利用RT-PCR和RACE技术,以小菜蛾四龄幼虫和成虫为材料,成功克隆了多条hsp70基因片段序列,并最终获得8条hsp70基因全长序列；然后利用荧光定量PCR技术检测1条已知hsp70基因和其中3条hsp70基因在小菜蛾抗性和敏感品系中mRNA水平的热激表达差异。本研究的结果如下：(1)分别以福州和日本小菜蛾经热激四龄幼虫和成虫及未经热激的成虫为材料,利用RT-PCR和RACE技术进行hsp70基因的同源克隆,共得到18个片段序列,经NCBI网站Blast比对,均属于hsp70基因的片段。(2)上述hsp70基因的片段可对应拼接处6条hsp70基因全长序列,经NCBI网站Blast比对,与亲缘关系较近物种的hsp70基因序列的同源性基本上都在80%以上。其中以福州小菜蛾为材料获得的3条序列均可翻译为629aa长度的蛋白,以日本小菜蛾为材料获得的3条序列均可翻译为664aa长度的蛋白,它们与已登录小菜蛾HSP70序列的同源性分别为91%-94%和98%以上。(3)根据hsp70基因全长序列设计5'端ORF外的两条引物,分别以福州小菜蛾经热激四龄幼虫和成虫为材料,利用RACE技术成功克隆了2条包括ORF的hsp70基因序列,分别可翻译669aa和667aa长度的蛋白,它们与已登录小菜蛾HSP70序列的同源性分别为98.8%和98.6%。(4)根据已登录小菜蛾hsp70基因序列和以福州小菜蛾为材料获得的3条hsp70基因序列分别设计特异性引物,利用荧光定量PCR技术检测它们在小菜蛾抗性和敏感品系中mRNA水平的热激表达差异。结果表明：经过热激后,hsp70基因的mRNA表达量均显着提高,且42℃热激的诱导幅度远大于37℃热激的诱导幅度；25℃时,hsp70基因mRNA表达量成虫多高于四龄幼虫,经过热激后,除个别例外,hsp70基因mRNA表达量成虫显着高于四龄幼虫；在小菜蛾雌雄之间,hsp70基因mRNA表达量在整体上并未表现出明显的差异；敏感品系小菜蛾的hsp70基因mRNA表达量显着高于抗性品系小菜蛾。
王兴亮[5]2012年在《小菜蛾对多杀霉素和氯虫苯甲酰胺抗性的特征及机理》文中认为小菜蛾Plutella xylostella (Lepidoptera:Yponomeutidae)属于鳞翅目菜蛾科,是世界范围内的一种重要害虫,每年造成的经济损失达40～50亿美元。小菜蛾寄主植物种类达40多种,主要为害十字花科蔬菜。由于生活周期短、繁殖能力强、世代重迭严重及田间不合理用药,使小菜蛾几乎对所有的防控用药(至少涉及84种杀虫剂)产生了不同程度的抗性。小菜蛾抗药性问题给十字花科蔬菜生产带来严重威胁和巨大挑战,抗性治理形势严峻。多杀霉素是一种作用于烟碱型乙酰胆碱受体的抗生素类药剂,氯虫苯甲酰胺是作用于昆虫鱼尼丁受体的二酰胺类杀虫剂。这两种新型杀虫剂均对鳞翅目等靶标害虫具有优异的防治效果,并具备良好的环境安全性。本文系统研究了小菜蛾对多杀霉素和氯虫苯甲酰胺抗性的特征(包括抗性筛选、抗性稳定性、交互抗性谱及抗性遗传方式等)以及抗性机理,研究结果对于了解小菜蛾对新型杀虫剂抗性演化的分子机理及制订抗性治理对策具有重要意义。1.小菜蛾对多杀霉素抗性特征的分析利用浸叶法对小菜蛾SZ-Spin56品系进行26代连续筛选,获得多杀霉素高抗品系SZ-Spin83。与室内敏感品系Roth和室内对照品系SZ相比,SZ-Spin83品系对多杀霉素的抗性分别达到10,000倍和4,000倍。对该高抗品系用多杀霉素继续筛选或停止筛选,抗性均无显着变化,表明小菜蛾SZ-Spin83品系对多杀霉素抗性稳定(抗性基因已经纯合)。交互抗性测定结果显示,SZ-Spin83品系对阿维菌素和乙基多杀菌素存在高水平交互抗性(交互抗性分别为468倍和2396倍),对茚虫威、高效氯氰菊酯、氟虫腈、溴虫腈、巴丹、啶虫隆、丁醚脲、虫酰肼、氰氟虫腙和氯虫苯甲酰胺均没有明显交互抗性。抗性遗传方式分析表明,小菜蛾SZ-Spin83品系对多杀霉素的抗性受位于常染色体、共显性遗传的两个或两个以上基因控制。2.小菜蛾对多杀霉素的抗性机制叁种解毒酶抑制剂(PBO、DEM和DEF)在室内敏感品系Roth、室内对照品系SZ和抗性品系SZ-Spin83中对多杀霉素均不存在显着的增效作用(增效比<2倍)。SZ-Spin83品系多功能氧化酶、酯酶和谷胱甘肽S-转移酶活性相对于敏感品系Roth有所升高(<2倍),但与其初始种群SZ品系水平相当(<1.2倍)。因此,代谢酶介导的解毒作用与SZ-Spin83品系对多杀霉素的抗性关系不大,其主导抗性机理可能为靶标变异。通过RT-PCR和RACE技术克隆了小菜蛾烟碱型乙酰胆碱受体Pxa2基因,该基因在多杀霉素抗性品系和敏感品系间不存在保守的氨基酸突变位点,并且该基因mRNA表达水平在抗性品系SZ-Spin83与其初始种群SZ之间没有显着差异。另外,对已报道的多杀霉素抗性基因Pxa6进行了研究。通过对敏感品系Roth55个和抗性品系SZ-Spin8358个阳性克隆的测序,检测到Pxa6亚基的6种转录本,其中3种类型为本研究首次发现。Pxa6基因在抗性和敏感品系间不存在保守的氨基酸突变位点,同时SZ-Spin83品系与其初始种群SZ相比,Pxa6的mRNA表达量没有差异。因此,我们认为小菜蛾对多杀霉素的抗性机理以靶标抗性为主,但与烟碱型乙酰胆碱受体a6亚基(Pxa6)和α2亚基(Pxa2)无关,或为nAChR其它亚基突变所致,亦不排除其它靶标基因参与抗性演化的可能性。3.小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感毒力基线和抗性监测利用浸叶法测定了2007-2009年间采集自我国11个地区的16个田间种群和7个室内饲养品系对氯虫苯甲酰胺的敏感性。16个田间种群的LC50值介于0.221-1.104mg/L之间,敏感性波动幅度在5倍以内；7个室内饲养品系基于LC50值的敏感性波动范围小于10倍。同时,利用16个田间种群的毒理学数据确定了15mg/L的诊断剂量,7个室内品系和5个田间小菜蛾种群在该剂量下的平均死亡率为99.75%(98%-100%)。该结果表明我国小菜蛾田间种群对尚未用于蔬菜害虫防控的氯虫苯甲酰胺具有较高的敏感性。本研究建立的小菜蛾对氯虫苯甲酰胺敏感毒力基线对于抗性监测与预警具有重要价值。在2010-2011年间,监测了我国12个地点采集的20个小菜蛾种群对氯虫苯甲酰胺敏感性的变化。结果表明,采自北部地区的14个田间种群对氯虫苯甲酰胺仍然敏感,LC50值在0.226-0.71mg/L,波动范围仅3倍。采自广东省的6个田间种群对该药剂的抗性水平差异很大,LC50值在0.343-256.2mg/L之间,波动幅度达770倍。与敏感品系Roth相比,广东珠海(ZH)和增城(ZC)种群分别具有150倍和2,140倍的抗性。该结果表明,必须合理使用氯虫苯甲酰胺防治小菜蛾以延缓抗性；同时,加强小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的监测,在高抗地区必须停止使用氯虫苯甲酰胺。4.小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性特征的分析2011年秋季采集的对氯虫苯甲酰胺具有抗性的PY、ZH和ZC种群(F3测定抗性倍数为18-1,150倍),对氟虫双酰胺表现出相近的抗性水平(15-800倍),说明二酰胺类的两种药剂之间存在着交互抗性。药剂选择压力移除以后,ZC种群对氯虫苯甲酰胺的抗性表现出不稳定性,由2,040倍下降至25倍仅用6代时间。抗性遗传方式分析表明,小菜蛾ZC高抗种群对氯虫苯甲酰胺的抗性为常染色体、不完全隐性遗传。由ZC分离一部分建立ZC-R品系,对其进行的增效实验表明PBO、DEF和DEM对氯虫苯甲酰胺毒力具微弱的增效作用(增效比为2.2～2.9),表明代谢酶介导的解毒作用在氯虫苯甲酰胺的抗性形成中作用有限,靶标抗性可能为小菜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性的主要机理。5.小菜蛾鱼尼丁受体的变异与氯虫苯甲酰胺抗性的关系昆虫鱼尼丁受体是二酰胺类杀虫剂的作用靶标。我们克隆了小菜蛾的鱼尼丁受体基因(PxRyR)cDNA全长,从而为研究靶标抗性奠定基础。PxRyR由15,495bp的ORF框、267bp的5'-UTR区和351bp的3'-UTR区组成,编码5164个氨基酸,分子量约为583.7KDao PxRyR具备鱼尼丁受体的普遍特征：保守的羧基端结构,此区域含6个跨膜结构域可形成功能性的Ca2+通道,胞浆区为大的氧基端结构域。PxRyR与昆虫RyR在氨基酸水平上的一致性很高,为78%-80%. PxRyR全长cDNA存在10个缺失多态性位点,说明单个PxRyR基因可以产生多种类型的转录本。同时,PxRyR基因在小菜蛾卵期、幼虫期和成虫期mRNA表达量分别是蛹期的1.36、2.47和1.40倍,幼虫期表达量显着高于蛹期；在幼虫不同组织部位中的表达量相对一致,没有显着差异。分别以氯虫苯甲酰胺抗性小菜蛾品系ZC-R和室内敏感品系Roth为材料,利用PxRyR碱基13,349位存在的保守替换位点作为抗性、敏感个体的分子标记,通过遗传分析发现氯虫苯甲酰胺抗性与PxRyR基因连锁。对抗性和敏感品系PxRyR基因羧基端1691个氨基酸序列进行了比对分析,发现抗性品系ZC-R在氨基酸4790(I到K)和4946(G到E)位存在50%和41%的突变频率,遗传分析结果表明G4946E点突变与氯虫苯甲酰胺抗性具有相关性。以β-actin和EF-1α基因为内参的定量PCR分析表明,ZC-R品系PxRyR基因mRNA表达量仅为室内敏感品系Roth和室内对照品系SZ的41-46%。上述研究结果表明,小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性与鱼尼丁受体基因连锁,该基因可能通过氨基酸点突变、mRNA表达下调或两者协同作用导致高水平抗性的形成。
邓振洲[6]2013年在《毒死蜱对小菜娥(Plutella xylostella)毒物兴奋效应的研究》文中进行了进一步梳理毒物兴奋效应具有广泛性,但如何将其纳入评价标准却有不少争议。我国是农药生产大国,也是农药消费大国,有机磷农药长期服务于我国的农林生产,大量有机磷类农药的使用,由此产生的农药残留问题,正使我国的农业安全生产面临重大问题。由于毒死蜱曾在有机磷农药使用中占有重要地位,其环境测定其在土壤、水资源与大棚等的农药残留情况不容乐观。本论文选用有机磷农药原药含量为95%的毒死蜱,并用本实验室长期饲养的小菜蛾作为试验材料。从毒物剂量效应、短时高温、亚致死剂量等方面研究了毒死蜱对小菜蛾的毒物兴奋效应的影响。本研究可望为低剂量兴奋效应对小菜蛾生长的影响提供一些基础数据,为加深认识有机磷农药毒死蜱在自然生态圈里农药残留中产生的生态影响规律提供理论依据,也为其他有机磷农药使用及残留存在的风险提供参照。(1)依据文献资料,对小菜蛾的AChE和GSTs的酶比活力测定,建立了本试验采信的酶标仪200μ1测定体系。(2)测定了毒死蜱对抗性品系和敏感品系小菜蛾的毒力曲线。(3)选取采集从福州上街镇商业用菜地的田间的小菜蛾,再转入在学校温室田间长期饲养。敏感品系小菜蛾(S)和使用毒死蜱长期筛选的抗性品系小菜蛾(R)和作为材料。以丙酮为对照,以适用于敏感品系小菜蛾的低剂量兴奋浓度的毒死蜱浓度(A1)预处理敏感品系(S)小菜蛾叁龄初期小菜蛾24h,再用敏感品系毒力测定出的LC10在25℃、33.5℃、38℃、40℃下对敏感品系S处理(4h、8h、12h、18h、24h),并测定AChE和GSTs酶比活力。以丙酮为对照,再用适用于抗性小菜蛾的低剂量兴奋浓度毒死蜱浓度(A2)预处理抗性品系小菜蛾叁龄小菜蛾24h,再用抗性品系毒力测定出的LC1o在25℃、33.5℃、38℃、40℃下对敏感品系(S)或抗性品系小菜蛾(R)处理(4h、8h、12h、18h、24h),并测定AChE和GSTs酶比活力。结果表明：同一品系的小菜蛾,经筛选的毒死蜱低剂量兴奋浓度处理后,对于经低剂量预处理24h的小菜蛾相对于丙酮对照处理的小菜蛾,经LC10处理后,在短时高温下(25℃、33.5℃、38℃、40℃)均表现出不同程度的兴奋率。(4)选取同上的小菜蛾敏感品系(S)和抗性品系(R)的叁龄为材料。以丙酮为对照,先用A1预处理敏感品系(S)叁龄小菜蛾24h,再同时用敏感品系毒力测定得到的LC50在25℃下对敏感品系S处理(4h、8h、12h、18h、24h),并测定AChE和GSTs酶比活力；以丙酮为对照,先用A2预处理抗性品系(R)叁龄小菜蛾24h,再同时用抗性品系毒力测定的LC50在25℃下对抗性品系(R)处理(4h、8h、12h、18h、24h),并测定AChE和GSTs酶比活力。结果表明：小菜蛾敏感品系(S)和抗性品系(R)的叁龄在不同处理时间,低剂量浓度预处理24h的AChE酶比活力也均高于丙酮对照处理24h的AChE酶比活力。另外,LC50处理后的抗性品系的小菜蛾比敏感品系的小菜蛾的兴奋率明显偏大。
符伟[7]2013年在《小菜蛾对Bt抗性机理及湖南地区综合治理研究》文中提出小菜蛾Plutella xylostella (L.),属于鳞翅目菜蛾科,是世界性的重要农业害虫。由于杀虫剂的广泛使用,小菜蛾几乎对所有防治药剂均产生了抗药性,极大增加了防治难度。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前使用范围最广的生物杀虫剂,小菜蛾在田间亦对其产生了抗药性,严重影响了其在防治小菜蛾方面的应用价值。本文一方面通过构建两性生命表研究了小菜蛾Bt抗性种群的生物学特性,利用实时荧光定量PCR技术研究了小菜蛾可能受体基因的基因表达水平,经分子克隆得到小菜蛾Bt毒素可能受体氨肽酶N (Aminopeptidase N4, APN4)基因全长,分析和预测了其分子结构和功能位点。另一方面,以小菜蛾田间抗性监测为基础,结合其它防治措施对小菜蛾抗性进行治理,以达到湖南地区小菜蛾综合治理(Integreted Pest Management, IPM)的目的。本文主要研究内容及结论如下：1小菜蛾荧光定量PCR内参基因的筛选本文首次系统评价了小菜蛾荧光定量PCR内参基因的筛选。选用了8个候选内参基因,试验条件分为生物因子(发育阶段、组织和品系)和非生物因子(温度、光周期、药剂和机械伤害),应用内参分析软件geNorm、Normfinder、Bestkeeper和RefFinder进行各候选内参基因稳定性分析。结果表明,不同试验条件下应选择的内参基因有所不同,相比而言,EFl和RPL32在大多数试验条件下均表现出良好的稳定性。该研究为小菜蛾基因表达相关研究奠定了良好的基础。2小菜蛾抗敏品系APN4基因全长克隆及结构和功能预测分析经分子克隆得到小菜蛾APN4基因全长序列,结果表明其开发阅读框包括2835bp,编码944个氨基酸残基。SignalP软件预测APN4在N端有一个长为16个氨基酸左右的信号肽结构。Big-PI Predictor软件预测APN4第496位氨基酸谷氨酰胺(Gln)为潜在的C端GPI修饰位点。ScanProsit软件预测APN4有13个N端酰基化位点、9个酪氨酸蛋白激酶2磷酸化位点、4个N端糖基化位点、9个蛋白激酶C磷酸化位点和2个酪氨酸激酶磷酸化位点。比对分析小菜蛾Cry1Ac抗敏品系氨基酸序列,抗性品系相对于敏感品系有5个氨基酸的改变。该研究为明确小菜蛾APN4基因的结构和功能及其在小菜蛾Bt抗性中的作用奠定了一定的基础。3小菜蛾Bt毒素可能受体基因的基因表达水平分析系统研究了Bt毒素小菜蛾敏感和抗性品系中3种Bt可能受体基因(钙粘蛋白、氨肽酶和碱性磷酸酶)的基因表达水平差异分析。结果显示,钙粘蛋白基因除1龄幼虫外,其余各龄期幼虫和中肠组织中敏感品系的基因表达量均显着高于抗性品系。APN1和APN2基因在敏感品系中的表达量一般要高于抗性品系,但APN3基因除3和4龄幼虫外,其余各龄期敏幼虫感品系表达量均显着低于抗性品系,但中肠组织中敏感品系高于抗性品系,而抗敏品系APN4基因各龄期和中肠组织表达量均无显着性差异。碱性磷酸酶基因各龄期幼虫敏感品系和抗性品系均无显着差异,但中肠组织敏感品系基因表达量显着高于抗性品系。该研究为小菜蛾Bt受体的确定及阐明其分子抗性机制提供了一定的依据。4小菜蛾Bt抗敏品系生物学特性研究通过分别构建小菜蛾Bt抗性和敏感品系的两性生命表,结果表明,小菜蛾敏感品系的内禀增长率、种群增长率和净殖长率均要高于抗性品系,而世代周期短于抗性品系。抗性品系相对于敏感品系种群适合度代价为0.78。通过抗性品系对不同Bt毒素蛋白的室内活性测定,发现其对Cry1Ab和Cry1Ac有较高的抗性水平,抗性倍数分别为59.68和67.68,而对Cry1Ca和Cry1Ah保持较高的敏感性,抗性倍数分别为3.32和1.64倍。该研究有助于明确小菜蛾Bt抗性品系的生物学特性及小菜蛾对Bt毒素不同蛋白的药剂敏感性。5湖南地区小菜蛾发生规律和抗药性监测通过湖南长沙和怀化地区小菜蛾种群动态调查发现,湖南平原代表地长沙地区小菜蛾发生一年中有两个高峰期,一个是4月中下旬和11月上旬,而湖南丘陵山区代表地怀化小菜蛾高峰期分别为5月上旬和10月中旬。在建立了小菜蛾对9药剂敏感基线的基础上,分别监测了长沙和怀化2011和2012年春秋两季的9种药剂田间抗性水平。结果发现,Bt、氯虫苯甲酰胺和丁醚脲处于中等水平抗性,多杀菌素、定虫隆和溴虫腈达到高抗水平,而阿维菌素、高效氯氰菊酯和茚虫威达到极高抗水平。该研究明确了湖南不同地区的小菜蛾种群动态规律和田间抗药性水平现状,为小菜蛾的抗性治理和综合防治奠定了基础。6湖南地区小菜蛾综合防控体系研究小菜蛾在甘蓝上的防治指标的研究结果表明：苗期、莲座期、结球时期和结球中后期的防治指标分别为53.65、90.84、67.21和607.51头每百株。通过联合毒力测定表明,甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和氟啶脲不同配比的联合毒力的共毒系数均大于100,表现出相加作用,其中甲维盐：氟啶脲=1：10时,其共毒系数最大(154.58),为最佳配比。整合各单项小菜蛾防控技术,建立了湖南地区小菜蛾综合防治体系,通过经济效益评价,结果表明,综防区投资效益比为1：17.39,显着高于化防区(1：9.06)。该研究为湖南地区小菜蛾综合治理提供了参考模式。
牛燕琴[8]2014年在《太白县小菜蛾的发生，种群遗传结构和越冬问题的研究》文中研究表明小菜蛾Plutella xylostella (L.)是分布最广,最普遍的鳞翅目害虫。我们的研究地点太白县(34°03'E,107°18'N)是一个十字花科生产基地,太白县是一个高原盆地,冬季最低气温在-20℃。在这个相对孤立的环境中,我们在实验室和野外的条件下得到了以下结果：1.生物学测定。我们研究了小菜蛾在16中寄主植物上的选择,发育,存活,繁殖和生命参数的情况。包括八种中国常见的作物：白菜,油菜,花椰菜,萝卜,青菜,球茎甘蓝,甘蓝,西兰花；和八种野生寄主植物分别：蔊菜,碎米荠,播娘蒿,荠菜,白花碎米荠,诸葛菜,菥莫,大叶碎米荠。在选择实验中,作物寄主的产卵指数都小于1,最大为0.94(油菜),最小为0.28(球茎甘蓝)；野生寄主中产卵指数有叁种作物超过1,分别为1.40(蔊菜),1.32(大叶碎米荠),1.11(荠菜),最小为0.61(播娘蒿)。小菜蛾在作物寄主上发育时间最短为15.5天(白菜)和15.7天(油菜),最长是22.3天(西兰花);在野生寄主上发育时间最短的是蔊菜(15.8天),发育时间最长的是在大叶碎米荠寄主上,为20.8天。作物寄主中,小菜蛾种群最高的内禀增长率rm为0.2753(油菜),野生寄主中,内禀增长率rm最高为0.2402(碎米荠),所以油菜和碎米荠分别是小菜蛾最适宜的作物寄主和野生寄主。这些结果可以用来掌握小菜蛾在作物寄主和野生寄主上的行为和种群动态。2.不同地点种群差异性检测。为了研究太白县小菜蛾种群与周围其他地区小菜蛾种群是否具有差异,我们研究了太白县与秦岭周围七个地点,以及广州和北京的小菜蛾种群的线粒体COl基因。这十个小菜蛾种群的COI基因多样性非常高,我们在这十个种群149个小菜蛾成虫个体中共检测到了32个单倍型。平均单倍型差异性为1.7%(0.04-4.1%)。十个地区单倍型多样性最小为0.571(AK,安康),最大为0.885(HZ,汉中)。核苷酸多样性最小为0.00286(AK,安康),最大为0.0117(HZ,汉中)。Mantal test结果表明,基因分化和地理距离之间没有相关性。每代的迁移个体数量(Nm)从1.43到无穷大,表明小菜蛾种群之间存在着基因交流。但是,主因素分析(PCA)表明TB(太白县)和TC(铜川)种群与其他八个种群有一定区别,说明高山阻挡可能对小菜蛾迁移和基因交流造成一定阻碍。3.抗寒性和越冬。为了测试小菜蛾的抗寒能力和在太白县越冬的情况,一系列的实验在实验室和太白县进行。我们测试了小菜蛾蛹和四龄幼虫的过冷却点和结冰点,田间初冬小菜蛾四龄幼虫的过冷却点和结冰点为-11.26℃和-9.97℃,蛹的过冷却点和结冰点为-21.06℃和-18.96℃。当小菜蛾在0,-1,-3,-5,-7,-9,-11,-13,-15,-17,-20℃条件下放置3小时,当置于0℃条件下时,幼虫和蛹的死亡率为零；温度为-20℃时,幼虫和蛹的死亡率都是百分之百。当把小菜蛾幼虫和蛹放在0℃条件下,一个月后四龄幼虫的存活率为60.4%,蛹的存活率为79.5%,两个月后所有的幼虫和蛹都死亡。在田间实验中,初冬掩埋在实验田中的小菜蛾一个月后30～40%的幼虫变成了蛹,10～20%的蛹发育成了成虫,但是两个月以后,所有的幼虫和蛹都已经死亡。我们在田间得到了四个直接的证据可以证明小菜蛾可以在太白县成功越冬。(1)我们从2012年4月到2014年3月常年监测小菜蛾成虫的动态,除了2013年2月和3月,2014年3月没有诱集到成虫以外,其余每个月份都能诱集到小菜蛾,包括最冷的月份12月和1月。更重要的是,2014年1月,我们在田间收集到一头交配过的小菜蛾雌虫并且在实验室的条件下从这一头小菜蛾得到了58粒卵。(2)在11月份田间的十字花科蔬菜收获之后,田间遗落的白菜和甘蓝的菜心内部依旧新鲜,每个白菜菜心的小菜蛾数量最多达到50头,在2013年到2014年的冬天,白菜菜心最低温度比太白县最低气温高2℃,白菜菜心为小菜蛾提供了较为温暖的小生境。(3)在网罩实验中,每年11月每个笼子里放置50头小菜蛾幼虫,2013年平均收集到0.8头小菜蛾；2014年平均每个笼子收集到6头小菜蛾。(4)太白县冬季的温室也为小菜蛾提供了另外一个越冬场所,每个月平均每个诱捕器上收集到了0.6～1.6头小菜蛾。小菜蛾抗寒实验和越冬实验说明了实验室数据并不能真正推断田间小菜蛾的死亡率。太白县平均温度0℃以下的时间超过四个月,冬季最低气温到达-20℃,但是小菜蛾种群可以在这里成功越冬。此外,小菜蛾在太白县越冬的种群为春天最初种群贡献比例为多少尚未可知。
朱勋[9]2014年在《抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白近等基因系小菜蛾中肠蛋白质基因组学研究》文中研究指明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是目前世界上用途最广、产量最大的微生物杀虫剂,其编码Bt杀虫毒蛋白基因作为主要的杀虫基因转入到多种作物中,在害虫防治中成效显着。但与此同时,Bt制剂的大量使用和转Bt作物的广泛种植,使得Bt的抗性问题越来越严重。十字花科重要害虫小菜蛾Plutella xylostella (L.)是最早被发现且目前仅有的6种在田间对Bt产生抗性的害虫之一。但到目前为止,Bt对小菜蛾的杀虫作用过程和小菜蛾对Bt的抗性机理,研究的仍不是完全清楚。在本研究中,我们建立了对Cry1Ac有高于5000倍抗性的近等基因系小菜蛾种群,同时研究了其相关生物学特性。同时,我们首次利用shotgun HPLC-ESI-MS/MS技术对小菜蛾幼虫中肠蛋白质进行了蛋白质基因组分析。同时为了更好的揭示小菜蛾抗Cry1Ac的分子机理,我们利用iTRAQ和MRM两种蛋白质组分析技术,对两个种群的中肠蛋白质组进行了定量分析,发现了大量差异表达蛋白质和可能的Bt受体。结果如下：1.小菜蛾抗CrylAc近等基因系种群的构建我们利用弗罗里达Florida抗Cry1Ac小菜蛾DBMlAc-R与纽约日内瓦Geneva敏感种群DBM1Ac-S,建立了两套近等基因系种群。经ISSR分子标记技术对其近等性进行评估发现,利用高世代回交法构建的近等基因系抗性种群BC7F3(更名为NIL-R),与轮回亲本敏感种群DBM1Ac-S之间的遗传相似度达到98.24%,具有较高的相似度,且其对Cry1Ac毒蛋白的抗性倍数保持在5000倍以上,是理想的实验材料。2.抗CrylAc近等基因系小菜蛾的抗性相关生物学研究我们利用以上建立的抗CrylAc小菜蛾近等基因系种群NIL-R开展相关生物学研究。我们通过3次生命表对NIL-R种群的抗性适合度研究发现：在卵的大小、寿命、幼虫发育、成虫寿命和产卵量上,抗性种群NIL-R与敏感种群DBM1Ac-S相比没有显着差别,说明NIL-R没有出现发育的延迟；利用两种群的内禀增长率(Ro)计算相对适合度,叁次生命表结果分别为1.016、0.940和0.932,说明抗Cry1Ac小菜蛾近等基因系种群NIL-R没有抗性适合度代价。根据交互抗性谱分析发现：NIL-R对CrylAb毒蛋白和Cry1Ah蛋白具有一定的交互抗性,对Cry1Ca毒蛋白和Cry1Ie毒蛋白没有交互抗性,由此我们可以推断小菜蛾对CrylA类毒蛋白可能具有共同的受体位点,而与Cry1Ca毒蛋白和Cry1Ie毒蛋白的受体位点不同。利用单对杂交实验和剂量对数-期望死亡机率曲线两种方法研究其遗传方式发现：抗性近等基因系种群NIL-R对Cry1Ac的抗性由一个常染色体、不完全隐形的基因位点决定。3.利用shotgun ESI-MS对小菜蛾幼虫中肠进行蛋白质基因组研究我们利用shotgun HPLC-ESI-MS/MS对小菜蛾幼虫中肠蛋白质进行测定,结合其基因组数据,完成了首个小菜蛾中肠蛋白质基因组分析。通过研究,一共得到了876,341张质谱图,将这些质谱图与小菜蛾基因组的蛋白质数据库及全基因组6框翻译的蛋白数据相比对,共鉴定出15,887条肽段。其中,12,004条肽段与已经发表的小菜蛾基因组中的预测蛋白质信息相匹配,同时发现了2113新肽段。利用这些发现的新肽段鉴定得到491个新基因,修正了202个小菜蛾基因组注释基因。通过对小菜蛾中肠蛋白质组的功能注释分析我们发现脂质消化作用相关酶和基因在小菜蛾中肠蛋白质中占据了重要地位,这可能是小菜蛾与其主要寄主十字花科作物的共进化的又一证据。同时我们从这些蛋白质数据鉴定到了大量与小菜蛾杀虫剂抗性相关的蛋白质,为小菜蛾适应性及广泛抗药性等的分子机理、功能基因组研究供了必要的数据支持。4.抗CrylAc近等基因系小菜蛾的比较蛋白质组研究我们利用iTRAQ技术,对NIL-R和DBM1Ac-S两个种群的中肠BBMV进行蛋白质定量比较研究,共筛选出了128个差异表达蛋白质。其中发现了氨肽酶和ABC转运蛋白质两个已报道的Bt受体蛋白质,在抗性种群中的表达量显着低于敏感种群。这可能说明这两个蛋白质也是Cry1Ac在小菜蛾中的受体。我们还发现了一个葡糖基转移酶的显着升高。另外,我们还发现了细胞色素P450解毒酶和谷胱甘肽转移酶两个解毒酶在抗性种群中显着升高的现象。随后,我们利用MRM技术对找出的差异蛋白质及已报道的Bt受体进行质谱定量检测,比较以上蛋白质在两个种群的中肠样品的表达量差异情况。MRM技术检测的结果与iTRAQ结果基本一致。另外,我们还发现氨肽酶、ABC转运蛋白质、碱性磷酸酶、钙黏蛋白以及鞘糖脂等潜在受体蛋白质在抗性小菜蛾中都有显着的降低。这个结果说明在本研究的小菜蛾种群抗Cry1Ac过程中,这些潜在受体蛋白质可能都不同程度的发挥着作用。
王俊华[10]2012年在《小菜蛾Cry1Ac靶标受体氨肽酶N2基因的克隆、表达及其功能研究》文中研究说明小菜蛾Plutella xylostella (L.)属于鳞翅目菜蛾科,是一种世界性的重要农业害虫。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)是一种能产生杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins, ICPs,又称为d-内毒素)的革兰氏阳性细菌,因其对害虫高效、对非靶标生物安全、对环境友好,在世界范围内得到了广泛的应用。1990年,Tabashnik等首先报道了田间小菜蛾对Bt制剂的抗药性,至今已有小菜蛾(Plutella xylostella)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、美洲棉铃虫(Helicoverpa zea)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)、玉米钻心虫(Osreinia furnaialis)和红铃虫(Pectinophora gossypiella)等6种重要农业害虫田间种群已对Bt制剂或转Bt基因作物产生了抗药性。害虫抗药性治理依赖于对害虫抗性机制的阐明,但遗憾的是,到目前为止人们对Bt的抗性机制仍知之甚少。本论文从抗性与敏感小菜蛾品系内克隆获得了与Bt杀虫蛋白抗性可能相关的氨肽酶N(APN2)基因,构建了相关的表达载体并在昆虫细胞Sf9细胞系中进行了表达,最后研究了表达蛋白与Cry1Ac的结合特性。具体内容与结果如下：1、抗性与敏感品系小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2)基因全长的克隆与分析本研究根据GenBank上登录的APN2基因序列(登录号：GU479677.1)设计全长引物,克隆了抗性及敏感品系小菜蛾中肠APN2基因全长。结果表明：小菜蛾中肠APN2基因全长编码区(开放阅读框ORF)长度为2853bp,编码950个氨基酸,通过Compute pI/Mw tool软件预测得到目的基因APN2的蛋白质分子量为107kDa；与已登录的小菜蛾APN2核苷酸序列同源性为98%；比较抗性品系与敏感品系小菜蛾APN2基因,发现两者有4个氨基酸差异,分别是APN2-S的120Phe、344Glu、706Asp和709Phe突变为了APN2-R的120Val、344Lys、706Glu和709Tyr。2、抗性与敏感品系小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2)基因在昆虫细胞Sf9细胞系中的表达将抗性和敏感小菜蛾APN2基因连接到pFastBac HTB上,并利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功构建了APN2和GFP基因的重组杆状病毒,在Sf9细胞系中进行了表达。结果表明：SDS-PAGE分析发现表达蛋白分别在107和27kDa处发现一条特异性条带,表达含有GFP蛋白的细胞具有明显绿色荧光；Western blotting分析,发现表达的敏感与抗性小菜蛾中肠APN2蛋白与抗His标签抗体成功结合,并在107kDa处出现了一条特异性条带,证实目的基因得到成功表达。3、抗性与敏感品系小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2)重组蛋白的功能分析通过Far-western blot、免疫荧光定位以及Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒性等方法,对表达获得的抗性、敏感小菜蛾中肠氨肽酶N(APN2-S/R)重组蛋白进行了功能分析。结果表明：Far-western blot分析发现抗性、敏感小菜蛾APN2蛋白均能与Cry1Ac母素蛋白相结合；免疫荧光定位分析研究发现,只有表达APN2-S/R蛋白的Sf9细胞才有绿色荧光出现；Cry1Ac毒素对Sf9细胞的毒性分析发现,只有表达APN2蛋白的Sf9细胞在Cry1Ac毒素蛋白的孵育下,细胞发生明显裂解,细胞死亡数明显上升,差异性极显着(P<0.01)。
参考文献：
[1]. 3-二辛硫基-1，1，1-叁氟-2-丙烷（OTFP）与农药对小菜蛾（Plutella xylostella）的联合作用[D]. 任可. 福建农林大学. 2014
[2]. 四氯虫酰胺对小菜蛾的亚致死效应研究[D]. 王龙. 山西农业大学. 2016
[3]. 华中地区小菜蛾抗药性监测及小菜蛾对丁醚脲抗性机制研究[D]. 邱浩. 华中农业大学. 2012
[4]. 小菜蛾hsp70基因的克隆及其在抗、敏品系中热激表达差异研究[D]. 汪宽福. 福建农林大学. 2010
[5]. 小菜蛾对多杀霉素和氯虫苯甲酰胺抗性的特征及机理[D]. 王兴亮. 南京农业大学. 2012
[6]. 毒死蜱对小菜娥(Plutella xylostella)毒物兴奋效应的研究[D]. 邓振洲. 福建农林大学. 2013
[7]. 小菜蛾对Bt抗性机理及湖南地区综合治理研究[D]. 符伟. 湖南农业大学. 2013
[8]. 太白县小菜蛾的发生，种群遗传结构和越冬问题的研究[D]. 牛燕琴. 西北农林科技大学. 2014
[9]. 抗Cry1Ac杀虫晶体蛋白近等基因系小菜蛾中肠蛋白质基因组学研究[D]. 朱勋. 华中农业大学. 2014
[10]. 小菜蛾Cry1Ac靶标受体氨肽酶N2基因的克隆、表达及其功能研究[D]. 王俊华. 湖南农业大学. 2012