张保中[1]2003年在《低强度超声波促进骨折愈合过程中TGF-β_1及Ⅰ、Ⅹ型胶原蛋白基因表达的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景 骨折愈合是一个非常复杂的生物学过程，涉及到多种细胞及细胞间质、大量蛋白质、成百上千种基因的表达，它们互相协调、共同作用，导致了骨结构完整性和骨强度的恢复，但如果此高度协调的过程由于各种原因被减慢、干扰甚至停止，将出现延迟愈合或不愈合。低强度超声波作为一种无创形式的机械能作用在生物器官，能加速新鲜骨折愈合并在治疗骨延迟愈合及不愈合中得到了良好的结果。美国食品与药物管理组织(FDA)分别于1994年与2000年对低强度超声波在加速新鲜骨折愈合及治疗骨折不愈合中的应用予以认可。 许多基础和临床研究表明，超声波对骨折愈合具有促进作用。它能引起细胞膜结构变化，导致离子通透性的改变及第二信使激活，后者可引起基因表达的改变，进一步引起软骨及骨特异基因的表达上调，从而促进骨折的愈合过程。超声波也可以刺激血管发生，促进骨折部位的血流，使生长因子及细胞因子等骨折愈合必需成分的运输加强。超声波可通过多种生物学及力学机制，调节与愈合有关的多种细胞、基因以及其它影响因素，加快并促进骨折的愈合过程。 分子生物学技术使对骨折愈合过程中蛋白多糖、细胞因子、生长因子及胶原蛋白作用的认识逐步深入。目前，国内尚无关于低强度超声波促进骨折愈合的临床及基础研究资料报告，国外亦无关于低强度超声波作用下参与创伤愈合因子如骨形态蛋白、转移生长因子β、成纤维细胞
郑毅[2]2016年在《“接骨丹”对兔骨折愈合过程的促进作用效应实验研究》文中指出目的骨折是临床上多发疾病和常见疾病,主要包括骨小梁中断和皮质骨断裂,骨折不愈合或延迟愈合是骨折治疗中比较棘手的问题,骨折愈合过程是一个极其复杂的组织学、生物学、内分泌学、生物力学修复过程。骨折愈合影响因素众多,包括全身因素和局部因素、医源性因素、骨生长因子、微量元素、生物力学因素。据不完全统计,大概有5%-10%的骨折患者会因为各种原因发生不愈合、延迟愈合等不良后果。因此如何促进骨折愈合、缩短骨折愈合周期、恢复骨的正常功能和结构一直是医学界研究的焦点和热点。虽然说加快骨折愈合的方法有很多,但是有一些治疗办法的效果并不显着,祖国医学治疗骨折折历史悠久,历经了几千年的临床实践检验,其简单方便、安全有效、毒副作用低、成本低廉等特点一直被医生和患者所认可。本课题在祖国医学理论指导下,开展“接骨丹”对骨折愈合过程的促进作用效应研究,希望能对中医药促进骨折愈合提供进一步的试验依据。方法新西兰大白兔20只,年龄10-12个月,体重2.5±0.25Kg,身长约25-30cm,四肢无畸形,活动自如,生命体征平稳,饮食正常,无传染病,动物喂养于标准动物房,适应性喂养1周开始实验。用显微外科骨刀在股骨颈中部凿断,形成股骨颈骨折,克氏针固定,术后8天拆线,以生命体征稳定、正常进食、无感染、内固定无明显移位、脱落为造模成功。随机分为2组,每组10只,A组为对照组,只做复位固定;B组为实验组,在复位固定基础上采用中药方剂“接骨丹”治疗。术后4、8、12w拍摄双髋关节正位X线片和进行核素骨显像检查,双髋关节正位取X线片,以99mTc-亚甲基二磷酸(99mTc-MDP)为示踪剂,SPECT及配套系统骨同位素显像;双侧股骨头的血液灌注的情况以头干比的比值(股骨头和同侧股骨干的99mTc-MDP浓集值相比)比较;血液流变学检测全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞压积;全自动生化分析仪检测血钙和血磷、血清碱性磷酸酶;ELISA实验检测骨形态发生蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子;生物力学试验检测骨痂最大载荷、挠度和刚度,Westemblot法检测骨骼中胶原蛋白含量,运用图象分析系统进行检测,并对数据进行统计分析。结果1.X线结果观察:术后4周股骨颈骨折线模糊不清楚,实验组骨痂逐步形成,对照组有骨膜反应,骨痂阴影密度实验组比对照组高;术后8周骨实验组骨折线基本消失,有外骨痂桥接骨折断端,面积逐渐缩小,髓腔未完全再通,对照组可见骨痂形成,髓腔未通,骨痂生长面积和骨痂阴影密度比较,实验组优于对照组;术后12周骨折基本愈合,实验组骨痂生长速度比较快,骨折线完全消失,髓腔完全再通;对照组可见到比较模糊的骨折线,有明显骨痂形成,面积缩小,髓腔未通。实验组骨折愈合质量评分第4周、8周、12周均明显优于对照组,有显着统计学意义(P<0.01),结果认定实验组较对照组骨折愈合较快。2.骨折部位灰度值比较:实验组与对照组比较,骨折部位灰度值4W、8W、12周实验组高于对照组,差异有显着性统计学意义(P<0.01)。3.骨同位素显像结果:实验组与对照组比较,股骨头处核素浓集明显,头干比值比较大,4W、8W差异有统计学意义(P<0.05),12W差异无统计学意义(P>0.05),4W、8W、12W头干比值随时间推移出现下降势。4.血液流变学测定结果:实验组与对照组比较,全血黏度、血浆黏度、血沉、红细胞压积降低明显,差异有统计学意义(P<0.05)。5.接骨丹对生化指标影响:血清钙离子浓度4W、8W、12周实验组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);血清磷离子浓度实验组与对照组血清磷离子浓度随时间推移逐渐上升,8周趋于稳定,4W、8W、12周实验组高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);血清钙磷乘积比较4W、8W、12周钙磷乘积实验组高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01);血清碱性磷酸酶活性4W、8W、12周血清碱性磷酸酶活性高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01)。6.接骨丹对骨生长因子影响:4W、8W、12W实验组BMP2高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01);4W、8W实验组IGF高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01),12W两组无显着性差异(P>0.05);4W、8W实验组TGF-β1高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01),12W两组无显着性差异(P>0.05);4W、8W实验组PDGF高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01),12W两组无显着性差异(P>0.05);4W、8W实验组b FGF高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01),12W两组无显着性差异(P>0.05)。7.接骨丹对生物力学影响:最大载荷、挠度、刚度12W实验组高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01)。8.接骨丹对Ⅰ型胶原蛋白的影响:Ⅰ型胶原蛋白4W时实验组高于对照组,差异有显着统计学意义(P<0.01),8W实验组与对照组Ⅰ型胶原蛋白表达较少,两组差异无统计学意义(P>0.05),12W两组无表达。结论1.接骨丹能明显改善骨折端微循环,增加局部血供,可以降低血液粘稠度,使局部血液循环尽早恢复,同时通过改善血液流变学的性质,使血液浓粘、凝集的程度减轻,加快血肿内瘀血的吸收,改善血液流变状态,增加局部肢体血流量,以促进骨折愈合。2.接骨丹能够升高血钙和血磷,使钙磷乘积高峰显着升高,促进钙盐沉积,提高骨折愈合中血清碱性磷酸酶的活性,增强体内成骨活动,促进骨折愈合。3.接骨丹可以调节外周血中骨生长因子的合成、分泌,促进骨形态发生蛋白、转化生长因子β、胰岛素样生长因子、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子的表达,通过影响骨生长因子促进骨折愈合。4.接骨丹能够提升骨痂最大载荷、挠度和刚度,促进骨生物力学性能的恢复,生物力学性能的增强可能与骨骼中胶原蛋白含量的增加有关。
高锋[3]2011年在《低强度脉冲超声波促进人髓核细胞合成胞外基质功能性成分的体外实验研究》文中认为第一部分低强度脉冲超声波促进人正常髓核细胞合成Ⅱ型胶原和蛋白聚糖最佳声强度参数的筛选目的有报道证实低强度脉冲超声波(Low-intensity pulsed ultrasound, LIPUS)能促进髓核细胞合成细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)主要功能性成分：Ⅱ型胶原(COLL2)和蛋白聚糖(Proteoglycan, PG)。本研究在国内首次使用人正常髓核细胞株(Human Nucleus Pulposus Cell Line, HNPC)接受LIPUS作用,筛选出使细胞产生最大量COLL2(?)(?)PG的强度参数(PG家族中研究最早最多的是Aggrecan,故以Aggrecan为代表检测)方法LIPUS(?)勺频率、作用时间等参数设定参考以往文献结果(频率1MHz,声脉20μs,重复1.0KHz的LIPUS,每天作用20分钟),设立5个LIPUS声强组：0、15、30、60、120mW/cm2,分别作用于HNPC,采用Real-time PCR检钡(?)COLL2(?)口Aggrecan对应基因的表达量,Western-Blotting检测(?)COLL2和Aggrecan蛋白的表达量,细胞免疫组化提供定性的形态学证据。结果COLL2和Aggrecan蛋白表达量趋势与其mRNA表达量趋势接近：COLL2基因和蛋白表达相对量在30、60mW/cm2两个声强组最多(此两组之间比较P>0.05,与其他组比较P<0.05), Aggrecan基因和蛋白表达相对量在60、120cmW/cm2两个声强组最多(此两组之间比较P>0.05,与其他组比较P<0.05)。但是,120cmW/cm2声强组COLL2蛋白和基因表达相对量明显下降(P<0.05)。结论选择60mW/cm2声强组作为促进COLL2和Aggrecan最大表达量的LIPUS声强参数。第二部分LIPUS对IL-1 p诱导HNPC退变模型合成基质能力的影响目的IL-1β可诱导HNPC基质合成能力下降,一定程度上模拟体内退变环境,建立退变细胞模型;探讨LIPUS对炎症因子作用环境中的HNPC合成ECM的影响。方法参考相关文献内容,使用IL-1β作用于正常HNPC48h后,建立退变的HNPC模型。采用声强为60mW/cm2,频率1 MHz,声脉20μs,重复1.0KHz的LIPUS.分组为：IL-1β+LIPUS(-)组、IL-1β+LIPUS(+)组、LIPUS(+)+IL-1β组。Real-time PCR检测COLL2、Aggrecan以及MMP-3、MMP-13对应基因的表达量,Western-Blotting检测相关蛋白的表达量,细胞免疫荧光检测提供LIPUS(?)乍用后COLL2、Aggrecan蛋白表达变化的形态学证据。结果LIPUS可以明显提升在炎性因子IL-1β刺激环境下COLL2和Aggrecan对应基因和蛋白的表达(P<0.05)。先接受LIPUS作用的正常HNPC,当LIPUS停止后加入IL-1β刺激,HNPC表达COLL2和Aggrecan对应基因的能力下降到与IL-1β+LIPUS(-)组相当；同时发现Aggrecan蛋白较COLL2蛋白下降明显；IL-1β上调MMP-3的作用强于上调MMP-13, MMP-3主要降解Aggrecan可能是Aggrecan下降更明显的原因。细胞免疫荧光表现支持以上结果。结论IL-1β可以有效的降低HNPC合成Aggrecan和COLL2的能力,构建出合理的模拟体内髓核退变状态的细胞模型；LIPUS促进模拟退变状态的HNPC合成Aggrecan、COLL2,具有潜在治疗价值,但促进作用在LIPUS停止后,下游效应不能持久,炎性刺激环境降低细胞功能。第叁部分LIPUS促进HNPC合成COLL2、Aggrecan的机制研究目的LIPUS促进软骨和椎间盘细胞合成COLL2和Aggrecan,但具体机制不明。有报道证明LIPUS通过协同TGF-β1发挥对犬髓核细胞的正向调节作用。我们使用HNPC来探索LIPUS (?)勺作用机制,更接近人的实际情况。方法设计LIPUS组、LIPUS+TGF-β组和LIPUS+TGF-β1+TGF-β1中和抗体组,Real-time PCR检测COLL2、Aggrecan对应基因的表达量,细胞免疫荧光检测进一步提供LIPUS作用效果的直观证据;Real-time PCR检测LIPUS作用后TGFβR1mRNA的表达量；细胞免疫荧光技术检测连续时间LIPUS作用后Integrinα5β1与细胞骨架蛋白的联动效应。结果LIPUS+ TGF-β1组COLL2、Aggrecan对应基因表达相对量最大(P<0.05),免疫荧光结果与其一致；当加入足量的TGF-β1中和抗体后,效果发生了反转,COLL2、Aggrecan对应基因的表达量明显降低于单纯LIPUS作用组(P<0.05)。LIPUS刺激上调HNPC的TGFPR1基因表达；连续时间LIPUS作用后,HNPC表达Integrinα5β1量逐渐增多,细胞骨架逐渐解聚模糊,LIPUS停止作用后,Integrinα5β1不表达,细胞骨架重新构建。结论LIPUS促进HNPC合成COLL2、Aggrecan的机制为主要通过TGF信号通路。而且,LIPUS作用后,HNPC表达TGFβR1上调,提示LIPUS作用使得HNPC对TGF-β1的敏感性提高,以此模式发挥对TGF-β1的协同作用。LIPUS作为一种机械干预因素,其机械信号通过"ECM- integrinα5β1-F-actin"机械信号转导通路转换为HNPC内第二信号,调控细胞功能和状态。第四部分LIPUS对退变人髓核组织细胞合成COLL2、Aggrecan的影响[接要]目的初步探讨LIPUS对退变人髓核组织细胞合成COLL2、Aggrecan的影响。方法手术获得的人退变髓核组织细胞的分离、培养和鉴定。设计分组：LIPUS(+)组、LIPUS(-)组和DMEM/F12培养基作为阴性对照组；ELISA检测连续5次LIPUS作用,每次作用后上清液中的COLL2和Aggrecan含量；Western Blotting法检测LIPUS作用前、LIPUS作用5天后、自然生长5天后髓核细胞中COLL2和Aggrecan含量,评估LIPUS是否延缓了退变的进展。结果LIPUS作用下.连续测定培养基中COLL2和Aggrecan蛋白浓度变化趋势曲线先升后降,作用两次后,浓度达到最大,与作用前比较有统计学意义(P<0.05)；随后,曲线下降,达到接近作用前浓度水平。同期自然生长的退变髓核细胞培养基中COLL2和Aggrecan蛋白浓度呈现逐渐下降趋势,第5次作用后,蛋白浓度与LIPUS作用组相比较明显下降(P<0.05); Western Blotting结果显示：LIPUS(+)组与LIPUS作用前组比较,COLL2和Aggrecan相对量接近(P>0.05);与LIPUS(-)(?)且相比,蛋白相对量明显增多(P<0.05)。结论LIPUS作用使得退变人髓核细胞保持了合成分泌功能性基质分子的能力,延缓了其退变的进展。
蒲建中[4]2013年在《骨健颗粒促进家兔骨折愈合的实验研究》文中研究指明目的通过对中药骨健颗粒促进家兔骨痂中转化生长因子β1(TGF-β1)、骨形态蛋白-2(BMP-2)的表达以及血清骨钙素(BGP)和血液流变性改变的实验研究,探讨其促进骨折愈合的机制。方法建立125只兔桡骨骨折模型,随机分为空白组(A组)、伤科接骨片组(B组,又称阳性对照组)及骨健颗粒低剂量组(C组)、骨健颗粒中剂量组(D组)、骨健颗粒高剂量组(E组),每组25只,分别给予生理盐水、伤科接骨片和骨健颗粒(低、中、高剂量)灌胃1次/日。分别于术后第1w、2w、3w、4w、6w取材,采用免疫组化染色,应用图像分析方法测定实验家兔骨痂中TGF-β1和BMP-2含量；于术后第1w、2w、3w、4w、6w用放射免疫分析仪检测外周静脉血BGP的含量；用血粘度测试仪检测术后2w时血液流变学指标。结果骨健颗粒组较其它组能提高实验家兔骨痂中TGF-β1、BMP-2的表达且峰值提前出现,能提高血清BGP的峰值,可以明显降低全血粘度、红细胞压积和血浆粘度,以中剂量效果为着。结论骨健颗粒中剂量可以明显缩短实验家兔骨折愈合的时间和提高骨折愈合的质量。
冯磊[5]2016年在《早期高压氧疗和鼠神经生长因子对糖尿病伴骨折患者TGF-β1与骨折愈合的影响》文中研究指明背景骨折是外科常见病,尤其是随着经济发展和生活节奏加快,使得建筑业与交通事故意外发生导致的外伤性骨折成为骨折的最常见的原因之一。骨折延迟愈合(fracture delayed union)指骨折在正常愈合所需的时间(一般为4个月内)仍未达到骨折完全愈合的标准。骨折不愈合(fracture nonunion)也称骨不连,是指由于种种原因导致骨折9个月以上仍未愈合,或者连续观察3个月以上仍未见到明显愈合征象,常常引起关节活动障碍,给患者带来很大痛苦和经济负担,一直以来都是骨折领域研究的热点。据报道,骨折不愈合的发生率平均为2.5-10%,在不同的个体出现的概率有很大不同,是否发生不愈合与年龄、性别、内分泌和营养状况、血管神经损伤、制动情况、是否合并感染等等多种因素有关,其中合并糖尿病是发生不愈合的重要危险因素。转化生长因子β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)是机体内重要的细胞因子,具有促进创伤愈合的作用,如果提高TGF-β1水平就有可能促进骨折愈合。高压氧疗和鼠神经生长因子是目前正在临床尝试治疗骨折愈合的方法。目前尚未见到高压氧疗和鼠神经生长因子对于糖尿病伴骨折患者TGF-β1和骨折愈合情况的影响的研究。目的探讨早期高压氧疗和鼠神经生长因子对于糖尿病伴骨折患者TGF-β1活性水平与骨折愈合情况的影响。方法观察对象为外伤性上肢长骨骨折患者。患者按照是否合并糖尿病和治疗方式分为3组:A组患者有糖尿病(n=116),对骨折进行复位、固定和功能锻炼以及控制血糖、营养支持等常规治疗,B组患者有糖尿病(n=102),除了常规治疗外,在术后1周内就开始高压氧疗,每天1次,每月进行高压氧疗21天,共进行3个月,同时肌肉注射鼠神经生长因子18ug/天,连用3个月;C组患者无糖尿病(n=96),进行常规治疗。术前、术后定期化验血清TGF-β1水平,连续观察2月;每2月查X片了解骨折愈合情况,连续观察10月。观察指标:(1)3组患者治疗前、治疗2周、1月、2月的血清TGF-β1水平变化;(2)术后10月内定期复查X线片了解骨折愈合情况。结果(1)3组患者血清TGF-β1水平在术后第2周均升高,到1月达到高峰,2月回落到基础值,但是患者基础值和峰值均有明显差异,表现为A组<B组<C组。(2)A组患者骨折不愈合和延迟愈合发生率均高于B组和C组,B组和C组之间无明显统计学差异。结论(1)糖尿病患者骨折愈合情况比非糖尿病的患者差;(2)早期进行高压氧疗和鼠神经生长因子治疗,提高了血清中TGF-β1活性水平,能够促进糖尿病伴骨折患者的愈合,减少了延迟愈合与不愈合的发生率,;(3).对于糖尿病伴骨折患者的治疗中,应早期进行高压氧疗和鼠神经生长因子治疗,以减轻患者痛苦,提高患者的生活质量。
杨征毅[6]2014年在《愈合期埋植型和非埋植型种植体骨界面改建中胶原蛋白I和组织蛋白酶D表达变化的研究》文中研究说明研究背景随着时代的发展和社会的进步，人们对生活质量的要求也在提高，对口腔问题越来越重视，这使得种植义齿成为修复口腔牙列缺损或者牙列缺失的主要方式之一。种植体与骨组织之间建立直接有序的结构功能连接，即骨整合(osseointegration)，是评价种植体成功的重要指标。临床上，为了减少患者的手术次数及就诊时间，非埋植型种植体这一改良形式在临床应用逐渐增多。然而，对于一些牙槽骨质量较差，种植体植入后初期稳定性较差的患者，传统的埋植型种植体才是最佳的选择。当种植体植入后种植体骨整合随之开始，骨组织的动态改建亦随之发生直至达到最终的平衡，这种平衡的形成受骨局部微环境内自分泌和（或）旁分泌的多种相关因子调节，有研究发现在种植体-骨界面有较高的胶原蛋白I和组织蛋白酶D的表达，但其在骨改建中的作用机制尚不完全清楚。基于以上观点，本实验拟通过直接比较埋植型和非埋植型这两种不同的种植方式种植体，在植入后愈合期中种植体-骨界面胶原蛋白I和组织蛋白酶D的动态变化规律，探讨胶原蛋白I和组织蛋白酶D在界面改建过程中的分子机理。研究目的本实验是拟通过对比埋植型与非埋植型两种不同植入方式的种植体在植入后，愈合期种植体-骨界面中胶原蛋白I和组织蛋白酶D的变化及其规律，探讨其胶原蛋白I和组织蛋白酶D在种植体-骨界面骨改建中的作用和机理。材料与方法1.钛种植体制备采用纯钛制成：长10mm，直径3.75mm的螺纹状植入钉，基桩和植入钉之间由中心螺丝相连。2.实验动物选用健康雄性杂种犬8只，体质量13-15kg，年龄为18-20个月。3.牙体拔除实验犬以3%戊巴比妥钠按1ml／kg肌肉注射进行全身麻醉，用金刚砂片分切牙冠，牙钳小心拔除下颌第4前磨牙和第1磨牙，搔刮牙槽窝，缝合创口。4.种植体植入拔牙3个月后，每只实验犬下颌左侧均植入埋植型种植体3枚，右侧均植入非埋植型种植体3枚，8只实验犬共植入种植体48枚(埋植型与非埋植型种植体各24枚)。5.组织标本制备实验犬分别在植入后1周、2周、1月、3月周时各处死2只。取出下颌相应骨段，在种植体外周10mm处将颌骨截开离断。标本均置于100g／L EDTA中脱钙3个月。梯度乙醇脱水，石蜡包埋。标本采用颊舌向纵切，厚约4μm，裱于经APES涂布的玻片上，等待后续免疫组化染色观察。6.实验方法采用免疫组化ABC法7.对照用封闭血清（10%正常羊血清）代替一抗作为阴性对照8.图像分析与统计学处理采用HPIAS-1000彩色图文分析仪（Olympus,BX40）进行图像分析，结果采用配对t检验进行统计学分析。结果1.埋植型和非埋植型实验组种植体-骨界面组织表达胶原蛋白I和组织蛋白酶D阳性强度均明显高于对照组，且表达出现一定规律。2.埋植型实验组种植体-骨界面中胶原蛋白I1周时出现弱阳性表达，其灰度值为91.25±2.48，随后开始逐渐增加，并在1月时达到峰值112.71±0.57，3月时恢复至81.29±0.81，与对照组水平相近。3.非埋植型实验组种植体-骨界面中胶原蛋白I1周时也出现弱阳性表达，其灰度值为90.72±1.82，随后逐渐增加，1月时达到峰值113.98±0.51，并于3月时恢复至81.04±0.52，与对照组水平接近。4.埋植型实验组种植体-骨界面中组织蛋白酶D1周时出现弱阳性表达，其灰度值为84.38±1.05，随后开始逐渐增加，2周时达到峰值102.53±1.03，后随着时程的延长而逐渐下降，3月时恢复至75.21±0.66，与对照组水平相近。5.非埋植型实验组种植体-骨界面中组织蛋白酶D1周时也出现弱阳性表达，其灰度值为86.81±0.52，随后开始逐渐增加，2周时达到峰值114.49±2.28，后随着时程的延长而逐渐下降，3月时恢复至75.84±1.83，与对照组水平相近。6.愈合期中各时间点埋植型和非埋植型实验组之间胶原蛋白I和组织蛋白酶D的表达无明显统计学差异。结论埋植型和非埋植型种植体在愈合过程中，种植体-骨界面中胶原蛋白I和组织蛋白酶D均有明显的表达，其表达变化随时间的改变而呈现出一定的规律性，影响着种植体骨界面的改建。在埋植型和非埋植型种植体之间表达无显着差异。
周勇[7]2016年在《低强度脉冲超声对BMSCs增殖及向软骨细胞分化影响的实验研究》文中进行了进一步梳理【目的】观察低强度脉冲超声对体外全骨髓贴壁筛选法获取的BMSCs增殖的调节作用。探索LIPUS联合TGF-β1促进BMSCs向软骨细胞分化的协同效应。【方法】1.通过分离提取四周龄日本大耳白兔的骨髓液,在体外采用全骨髓贴壁筛选法培养、纯化、扩增,得到足够数量级具备良好生物学活性的BMSCs,光镜下观察BMSCs形态变化、免疫荧光细胞化学染色检测细胞质中II型胶原合成分泌情况、流式细胞仪技术检测BMSCs表面标志物CD34、CD45、CD90、CD105,对细胞表型进行鉴定。2.设定不同刺激强度(30、60、90 m W/cm2)和刺激时间(5、10、15、20 min)的参数组合,对体外培养扩增的第3代BMSCs进行LIPUS刺激,24 h后光镜下观察细胞增殖情况,并采用Cell Counting Kit-8试剂盒检测不同参数下LIPUS对离体培养的BMSCs增殖的作用,优选出可促进BMSCs增殖的最佳LIPUS参数;3.选取离体培养的第3代BMSCs,分为4组:空白对照组(Blank Control组)、单纯TGF-β1组(T组)、单纯LIPUS组(L组)、TGF-β1+LIPUS组(T-L组)。其中,空白对照组:培养基中不加TGF-β1,不予以LIPUS刺激;单纯TGF-β1组(T组):培养基中加入TGF-β1进行培养,不予以LIPUS刺激;单纯LIPUS组(L组):不加入TGF-β1,予以前期筛选出的最佳参数的LIPUS刺激;TGF-β1+LIPUS组(T-L组):在培养基中加入TGF-β1后给予最佳参数的LIPUS刺激,各组均分别在干预的第1、3、7天后观察,应用免疫荧光细胞化学染色检测细胞质中II型胶原的合成分泌情况,应用番红O-固绿染色检测软骨细胞外基质的合成分泌情况,应用RT-PCR法检测细胞SOX9、COL2A1、MMP13 m RNA的表达情况。【结果】1.体外分离培养的BMSCs生长状态良好,贴壁能力强,光镜下观察,稳定增殖后的细胞形态呈梭形或纺锤形,大小形态较为一致。免疫荧光细胞化学染色显示:COL-II染色呈阴性,流式细胞仪技术检测显示:BMSCs均一表达CD90和CD105,阳性率分别为99.78%和99.52%,而CD34和CD45的阳性率分别为0.35%和0.56%,确认培养的细胞为表型稳定的未分化BMSCs。2.不同参数组LIPUS刺激细胞后24 h镜下观察:LIPUS刺激后的细胞呈漩涡状排列,整体分布更加紧密,形成很多BMSCs集簇,尤以超声强度60m W/cm2,作用时间15 min最为明显。CCK-8法检测结果显示:不同参数LIPUS刺激后BMSCs增殖情况均优于空白对照组,其中超声强度60 m W/cm2,作用时间15 min组细胞的OD值均数最大,且差异具有统计学意义(P<0.05)。3.免疫荧光细胞化学染色显示:空白对照组可见COL-II染色呈阴性,而T组和L组的COL-II染色呈阳性,其中,T-L组最显着。番红O-固绿染色:空白对照组的细胞外基质中在第1、3、7天都未见明显的红染出现;而L组和T组细胞外基质中第1天出现较少量红染,第3、7天红染区逐渐增多;T-L组细胞外基质中第1、3、7天均有红染出现,且红染区呈现逐渐扩大的趋势。RT-PCR结果显示:实验组各组在第1、3、7天SOX9和COL2A1表达上调,而MMP13的表达量下调,T-L组的SOX9和COL2A1表达上调量和MMP13下调量更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。【结论】1.通过全骨髓贴壁筛选法可获得生物活性良好、增殖能力强、形态一致、表型稳定的BMSCs,全骨髓贴壁筛选法操作简单、易于掌握,对获得优质BMSCs种子细胞具有重要意义。2.自行构建的低强度脉冲超声刺激细胞装置符合实验需求。适宜参数的低强度脉冲超声可促进离体培养的兔骨髓间充质干细胞增殖,促细胞增殖效应与超声刺激参数有相关性,本研究中,超声强度60 m W/cm2,作用时间15 min促增殖效率最佳。3.单独应用LIPUS和TGF-β1均可促进软骨细胞外基质合成,促进BMSCs向软骨细胞分化,当将LIPUS和TGF-β1联合应用时,二者对促进BMSCs向软骨细胞分化具有协同效应。
邓迎生[8]2007年在《低强度脉冲式超声波对叁维培养兔关节软骨细胞、基质的生物学效应及相关基因研究》文中指出目的:研究低强度脉冲式超声波(LIPUS)对体外叁维培养兔关节软骨细胞的活性、增殖、细胞表型及功能的影响,并探讨其对软骨修复及基质降解的关键基因col-II、aggrecan、TGF-β1、TIMP-1、MMP-1mRNA表达的影响。方法:构建藻酸盐凝胶-关节软骨细胞叁维培养体系,并予以LIPUS刺激,观察细胞形态、软骨细胞增殖、细胞周期及表型的变化;免疫组织化学法和ABPAS法分别检测各组软骨细胞基质中蛋白多糖蛋白及I、II、X型胶原合成和分泌情况;Real Time PCR法在基因转录水平检测软骨细胞基质中aggrecan与Collagen II、Collagen I、Collagen X基因及调控因子TGF-β1、MMP1、TIMP-1等的mRNA表达情况。结果: LIPUS不影响软骨细胞的活性、可促进细胞增殖、有效维持兔关节软骨细胞的表型;促进II型胶原、蛋白多糖并抑制X型胶原的合成分泌;能上调Collagen II、aggrecan mRNA、TIMP-1和TGF-β1mRNA表达,下调MMP-1、Collagen X mRNA的表达。结论:低强度脉冲式超声能维持细胞表型、活性和增殖、增加细胞外基质合成、防止降解,有修复关节软骨的潜能,其效应可能是通过上调TGF-β1mRNA的表达介导的。
柯丹[9]2007年在《低强度脉冲超声对皮肤成纤维细胞增殖的影响》文中研究表明超声波被广泛应用于医学治疗和诊断领域,高强度聚焦超声作为一种无创性治疗手段正日益受到人们的重视。低强度脉冲超声波(low intensity pulsed ultrasound,LIPUS)具有刺激细胞增殖和细胞外基质合成增加的作用,已逐渐应用于骨与软组织创伤的愈合和神经修复治疗中。目前,LIPUS对人皮肤成纤维细胞的影响研究还较少,为了探讨超声治疗皮肤疾病的应用前景,我们研究了LIPUS对人皮肤成纤维细胞的增殖及胶原蛋白合成的影响,为LIPUS治疗皮肤疾病提供理论依据。并开展了聚焦超声治疗神经性皮炎和慢性湿疹的临床研究,进行了超声治疗皮肤疾病的初步探讨。一、LIPUS促进皮肤成纤维细胞增殖的适宜辐照参数筛选用辐照参数为1 MHz、1.2 MHz、1.7 MHz,每一频率下四种不同声强的LIPUS,同一声强分别辐照0 min(假照组)、5 min、10 min、15 min、20 min和30 min体外培养的成纤维细胞,辐照24 h后观察成纤维细的生长增殖情况,采用MTT法测定其吸光光度值,计算其相对成活值,通过比较不同辐照参数对细胞的相对成活率的影响,筛选出促进皮肤成纤维细胞生长的最适宜频率、声强和辐照时间。结果: (1)用MTT法测定叁种频率(1 MHz、1.2 MHz、1.7 MHz),每一频率下四种声强的LIPUS辐照成纤维细胞5 min,24 h后吸光光度值均增加,辐照成纤维细胞10 min,24 h后吸光光度值增加最高,较对照组都有显着性差异(P<0.05)。超过一定辐照时间后,吸光光度值下降,且随着辐照时间的延长,吸光光度值下降显着。(2)比较细胞的相对成活率发现,频率1 MHz、声强0.1 W/cm2、辐照时间5 min时细胞相对成活率为1.195,10 min时达1.325,与其它辐照参数组比较差异有统计学意义(P<0.05),两者之间比较P<0.05,有统计学意义。10 min时的细胞相对成活率最高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:⑴不同频率、不同声强的LIPUS辐照一定时间均能促进人真皮成纤维细胞增殖,超过一定辐照时间则会抑制细胞生长。⑵频率1 MHz、声强0.1 W/cm2、辐照时间10 min为促进成纤维细胞增殖较为适宜的辐照参数。二、低强度脉冲超声对皮肤成纤维细胞增殖及胶原蛋白合成的影响采用最适宜声参数——频率1 MHz、声强0.1 W/cm2的LIPUS辐照体外培养的人皮肤成纤维细胞,分别辐照5 min,10 min及20 min,采用H3-胸腺嘧啶核苷掺入试验检测其对细胞合成DNA的影响,H3-脯胺酸掺入试验检测其对细胞合成胶原蛋白的影响,并用流式细胞仪检测其对细胞周期的影响。结果:频率1 MHz、声强0.1 W/cm2的LIPUS辐照成纤维细胞5 min,24 h后细胞H3-胸腺嘧啶核苷H3- TdR掺入量为对照组的1.27倍、H3-脯胺酸掺入量为对照组的2.22倍,辐照10 min,24 h后H3- TdR掺入量为对照组的1.55倍、H3-脯胺酸掺入量为对照组的2.31倍,与对照组比较均有统计学差异(P<0.05),而辐照10 min时掺入量达最高,较5 min组有显着性差异(P<0.05),随着辐照时间进一步增加掺入量反而下降。LIPUS辐照5 min,S期细胞为(13.84±1.77)%,较对照组增加(P<0.05);辐照10 min后S期细胞为(20.56±3.56)%,较对照组增加(P<0.05);而辐照10 min G2/M期细胞(15.89±1.75)%,较对照组下降(P<0.05)。结论:LIPUS辐照一定时间能够促进人皮肤成纤维细胞DNA及胶原蛋白合成增加,并可以使细胞的周期发生改变,促进细胞从G2/M期进入S期,从而促进细胞的增殖。叁.聚焦超声治疗神经性皮炎和慢性湿疹的初步探讨采用自身对照法对聚焦超声治疗51例神经性皮炎患者和51例慢性湿疹患者进行了疗效观察和安全性评价。治疗组采用重庆海扶技术有限公司研制生产的CZP型皮肤超声治疗仪进行治疗,对照组治疗采用安慰剂(白凡士林)外涂,每日2次。治疗后一月观察病人的主观症状、体征以及出现的其他不良反应,评价超声治疗的有效性和安全性,并进行统计分析。结果:治疗后1月,治疗组神经性皮炎患者和慢性湿疹患者各项瘙痒/体征指标计分及总计分均有明显下降,与对照组组间比较有显着差异(P<0.05〉。治疗后1月,神经性皮炎患者治疗组的痊愈率和痊愈显效率分别为2%和52.9%;慢性湿疹患者治疗组的痊愈率和痊愈显效率分别为4%和54.9%,与对照组比较均显着性增加(P<0.05〉;不同程度(重度>9,轻度≤9)神经性皮炎和慢性湿疹治疗1月后疗效无显着性差异;超声治疗后患者瘙痒情况明显改善,治疗后90.2%慢性湿疹患者、80.4%神经性皮炎患者瘙痒基本消失或明显减轻;治疗后无不良反应发生。结论:超声波可以有效治疗慢性湿疹和神经性皮炎,是一种新型的、有效的、安全的物理治疗手段,是一种值得推广也需要进一步研究的新兴物理治疗方法。
冯丽芳[10]2018年在《低强度脉冲超声波对多孔钛合金成骨作用的影响及生物信息学分析预测》文中提出目的:超临界大面积或大段骨缺损仍旧是临床面临的治疗难题。由于自体骨移植和异体骨移植所存在的局限性~([1]),学者们致力于研发人工骨材料,但为了解决人工骨材料成骨效应不良的问题,人们关注到了物理治疗方法与人工骨材料联合治疗的新方案。低强度脉冲超声波(low-intensity pulsed ultrasound stimulation,LIPUS)是近年来比较被认可的促进骨愈合修复的一种物理治疗方法。由于LIPUS在骨愈合方面的促进作用,及其对叁维多孔材料内物质交换的促进作用。近年来,研究的主要目的是将LIPUS作为辅助手段与人工骨材料联合,应用于骨缺损修复的研究,为大面积骨缺损的修复提供一个新的思路。而LIPUS对于叁维多孔材料内成骨效应影响的适宜参数(包括强度、频率、时间等)的研究罕有报道。有研究证实LIPUS对成骨细胞影响的调控机制是通过调节整合素α5β1/PI3K/Akt通路,ROCK-Cot/Tpl2-MEK信号通路,m-TOR通路发挥作用。以上机制的研究均基于二维平面模型上,而基于二维平面阐述的机制不能完全用于解释叁维多孔材料上的实验结果。所以探索LIPUS对叁维多孔材料成骨作用影响的机理就非常有必要。近年来,研究证实多种miRNA能够参与成骨细胞的分化过程,而miRNA与LIPUS对多孔材料成骨作用影响的关系还未见报道。所以在本研究中,1、通过对两种频率LIPUS进行体外实验对比,观察两种频率的LIPUS对多孔材料上的成骨细胞的增殖和分化的影响,筛选优势频率,为LIPUS促进多孔材料修复骨缺损的体外研究提供数据。2、通过体内实验比较两种频率LIPUS对多孔材料修复兔下颌骨骨缺损修复的影响,筛选优势频率,为探讨LIPUS促进叁维多孔材料修复骨缺损的体外研究提供数据。3、通过检测mi RNA在LIPUS刺激下叁维培养成骨细胞中的差异表达谱,初步探索miRNA在LIPUS刺激下叁维多孔材料上成骨细胞内的变化情况,为探讨LIPUS促进叁维多孔材料内成骨效应的机制研究提供分子生物学数据。研究方法:1、将多孔钛合金材料随机分为高频超声组、低频超声组和对照组。在材料上进行小鼠前成骨细胞(mouse embryo osteoblast precursor cells,MC3T3-E1)的接种和培养,利用扫描电子显微镜(scaning electron microscope,SEM)评价两种频率LIPUS作用下多孔材料上成骨细胞的黏附状态。采用CCK-8(cell counting kit-8,CCK-8)和流式细胞仪PI染色检测两种频率LIPUS对材料上成骨细胞增殖的影响。采用碱性磷酸酶(alkaline phosphatese,ALP)和骨钙素(osteocalcin,OCN)检测技术测定两种频率LIPUS对多孔钛合金材料上成骨细胞早、晚期分化的影响。2、将多孔钛合金材料植入兔下颌骨的骨缺损区,随机分为高频超声组、低频超声组和对照组,加载3周和6周后取材进行X线影像学观察有无感染,Micro-CT扫描观察不同组材料内新骨形成的情况;制作硬组织切磨片,通过荧光显微镜观察各组多孔钛合金材料内新骨生成的活跃程度;对组织切片进行甲苯胺蓝染色、亚甲基蓝-酸性品红染色和von Kossa银染分析不同组多孔材料内新成骨情况和骨矿化情况。3、将多孔钛合金材料与小鼠前成骨细胞复合培养后,随机分为超声组和对照组,加载7d后,应用高通量miRNA测序技术检测在LIPUS作用下叁维培养成骨细胞中miRNA的差异表达谱,并通过生物信息学分析对差异表达的miRNA进行靶基因的预测,GO和KEGG Pathway功能聚类分析。再通过real-time PCR验证测序结果的可靠性。结果:1、SEM观察各组多孔钛合金材料上MC3T3-E1细胞均伸展良好,可见伪足伸出,细胞间靠伪足相互连接,边界模糊,并可见细胞长入材料空隙内部,但各组间细胞的密度及形态无明显区别。CCK-8结果显示细胞数量均随着时间的延长而增多,但叁组之间的OD值无统计学差异。流式PI染色3d后细胞增殖指数叁组之间都没有统计学差异。ALP结果显示细胞的ALP活性均随时间的延长而增高,在4,7,10d两种频率超声组与对照组相比差异具有统计学意义,而两种频率之间没有统计学差异。OCN含量检测,细胞的OCN含量均随时间的延长而增高,在10,14d两种频率超声组与对照组相比差异具有统计学意义,而两种频率之间没有统计学差异。2、X线影像学观察叁组在两个时间点均未发现感染迹象,骨与材料结合紧密。Micro-CT扫描结果显示随着时间的推移,多孔钛合金内新生骨量逐渐增大,相同时间点两频率组的新骨形成量优于对照组,但两频率组之间无明显差异。荧光显微镜观察随着时间的延长,多孔钛合金内荧光带宽度和荧光强度逐渐下降,但是荧光分布面积逐渐扩大。相同时间点两频率组的荧光带宽度,荧光强度,荧光分布面积优于对照组,但两频率组之间无明显差异。甲苯胺蓝染色、亚甲基蓝-酸性品红染色结果均是随着时间的延长,多孔钛合金内成骨面积越来越大,骨组织结构越来越成熟,相同时间点两频率组的新骨形成面积和骨成熟度优于对照组,而两频率组之间没有明显统计学差异。von Kossa银染结果,随着时间的增加,多孔材料内矿物质沉积的面积和密度均逐渐增大。相同时间点两频率组的矿物质沉积的量优于对照组,而两频率组之间无明显统计学差异。3、LIPUS可以下调多孔钛合金材料上成骨细胞内miRNA的表达量,下调的miRNA有30个。对30个表达下调的miRNA进行靶基因预测,并对预测到的靶基因进行了GO和KEGG富集分析,得到599条GO terms富集,185条信号通路。real-time PCR验证4个miRNA表达情况,结果与测序结果一致,表明测序结果真实可靠。结论:1、两种频率LIPUS对多孔钛合金材料上成骨细胞的增殖没有明显影响,可以明显促进材料上细胞的分化,两种频率之间没有明显差异。2、两种频率LPIUS可以明显促进多孔钛合金材料修复兔下颌骨骨缺损的新骨形成,但两种频率之间没有明显差异。3、LIPUS可以下调多孔钛合金材料上成骨细胞内30个mi RNA的表达。
参考文献：
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[2]. “接骨丹”对兔骨折愈合过程的促进作用效应实验研究[D]. 郑毅. 湖北中医药大学. 2016
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[5]. 早期高压氧疗和鼠神经生长因子对糖尿病伴骨折患者TGF-β1与骨折愈合的影响[D]. 冯磊. 郑州大学. 2016
[6]. 愈合期埋植型和非埋植型种植体骨界面改建中胶原蛋白I和组织蛋白酶D表达变化的研究[D]. 杨征毅. 广州医科大学. 2014
[7]. 低强度脉冲超声对BMSCs增殖及向软骨细胞分化影响的实验研究[D]. 周勇. 天津医科大学. 2016
[8]. 低强度脉冲式超声波对叁维培养兔关节软骨细胞、基质的生物学效应及相关基因研究[D]. 邓迎生. 第二军医大学. 2007
[9]. 低强度脉冲超声对皮肤成纤维细胞增殖的影响[D]. 柯丹. 重庆医科大学. 2007
[10]. 低强度脉冲超声波对多孔钛合金成骨作用的影响及生物信息学分析预测[D]. 冯丽芳. 中国医科大学. 2018
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