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高效合成丙谷二肽重组大肠杆菌的构建

2020-12-02阅读(222)

高效合成丙谷二肽重组大肠杆菌的构建

论文摘要

丙谷二肽（AQ）是一种功能二肽,具有水溶性高、热稳定性好、生物利用率高等优良特点,在临床医疗、术后康复、运动保健等领域应用广泛。AQ的生产目前主要采用化学合成法,由于化学法步骤繁琐,耗时耗力、产率低、伴随副产物产生,因此急需建立绿色高效合成AQ的方法。本研究利用代谢工程手段,构建了谷氨酰胺合成模块和AQ合成模块,通过筛选获得催化性质优良的谷氨酰胺合成酶（GlnA）和L-氨基酸-连接酶（BacD）,通过RBS优化和拷贝数优化,构建能够高效催化谷氨酸（L-Glu）和丙氨酸（L-Ala）合成丙谷二肽的重组大肠杆菌。所取得的结果如下:1、在大肠杆菌BW25113中表达L-氨基酸-连接酶（BacD）,构建AQ合成模块,获得重组菌pYB1a-BsbacD/BW,利用该重组菌,以丙氨酸和谷氨酰胺为底物进行全细胞催化初步实现了AQ的合成。2、通过CRISPR技术敲除大肠杆菌BW中编码二肽降解酶的基因pepABDN和编码二肽转运蛋白的基因簇dppA-F获得大肠杆菌AQ09,有效缓解了AQ的降解。重组菌pYB1a-BsbacD/AQ09在以L-Gln和L-Ala为底物的全细胞催化体系中反应18小时,AQ产量达到3.3mM,比出发菌株pYB1a-BsbacD/BW（产量2.0mM）提高65.0%。3、为了降低原料的成本,构建Gln合成模块:筛选获得能够高效转化L-Glu为L-Gln的谷氨酰胺合成酶CgGlnA,表达CgGlnA的重组菌以L-Glu为底物全细胞催化,L-Gln产量达到22.4mM,摩尔得率为44.8%。通过敲除BW中编码谷氨酰胺酶的基因glsA、glsB和编码GlnA亚基修饰相关酶的基因glnE、glnB获得重组菌AQ06,将pYB1a-CgglnA导入AQ06获得重组菌株pYB1a-CgglnA/AQ06。重组菌pYB1aCgglnA/AQ06以L-Glu为底物全细胞催化,L-Gln产量达到46.5mM,较出发菌株pYB1a-CgglnA/BW提高107.6%。4、通过叠加AQ合成模块和Gln合成模块,获得具有AQ06和AQ09底盘敲除性状的大肠杆菌AQ10,将共表达CgglnA和BsbacD的质粒pYB1s-CgglnA-BsbacD导入AQ10获得菌株pYB1s-CgglnA-BsbacD/AQ10。该菌在以L-Glu和L-Ala为底物的全细胞催化体系中反应6小时,AQ产量达23.6 Mm,比出发菌株pYB1aBsbacD/BW提高了1080%。5、合成途径的进一步优化:通过优化RBS和质粒拷贝数,调节BacD蛋白表达获得重组菌株YGS176300,该重组菌在以L-Glu和L-Ala为底物的全细胞催化体系中反应6小时,AQ产量达32.4 mM,较pYB1s-CgglnA-BsbacD/AQ10提高79.1%。进一步,通过更换质粒载体为中拷贝质粒pLB1s,获得重组菌株LGS176300,该菌株AQ产量达22.8mM,仅较菌株YGS176300降低9.0%,但培养后菌液浓度提高一倍。6、全细胞催化合成AQ的条件优化:通过全细胞催化条件,如温度、pH、补糖等的摸索,优化催化反应体系:100mM L-Glu和125mM L-Ala,葡萄糖50mM（分五次,每3小时补加一次）,pH 9.0,30℃,反应18小时AQ产量达到65.6mM,LGlu的摩尔得率为65.6%。

论文目录

  • 中文摘要
  • Abstract
  • 绪论
  •   第一节 L-谷氨酰胺概述
  •     1.1 L-谷氨酰胺的理化性质
  •     1.2 L-谷氨酰胺的生理功能
  •     1.3 L-谷氨酰胺的应用
  •   第二节 丙谷二肽
  •     2.1 丙谷二肽简介
  •     2.2 丙谷二肽的理化性质
  •     2.3 丙谷二肽的的制备
  •     2.4 L-氨基酸-α-连接酶
  •   第三节 本课题的立题背景、研究意义与研究方法
  •     3.1 立题背景及意义
  •     3.2 研究内容
  •     3.3 技术路线
  • 第一章 AQ合成模块和L-Gln合成模块的构建
  •   第一节 材料与方法
  •     1.1 实验材料
  •     1.2 实验方法
  •       1.2.1 AQ合成模块的克隆
  •       1.2.2 AQ合成模块的底盘改造
  •       1.2.3 L-Gln合成模块的构建
  •       1.2.4 高效合成L-Gln底盘的改造
  •       1.2.5 二肽降解途径和L-Gln合成模块的整合敲除
  •   第二节 结果与分析
  •     2.1 AQ合成模块的构建
  •       2.1.1 BsbacD基因的克隆与表达
  •       2.1.2 重组菌株的全细胞催化实验
  •     2.2 AQ合成模块的底盘改造
  •       2.2.1 敲除底盘的构建
  •       2.2.2 敲除底盘对AQ积累的影响
  •     2.3 L-Gln合成模块的构建
  •       2.3.1 CgglnA基因的克隆表达
  •       2.3.2 L-Gln产量检测
  •     2.4 高产L-Gln底盘菌株的构建
  •       2.4.1 敲除底盘的验证
  •       2.4.2 敲除底盘效果检测
  •     2.5 底盘的叠加敲除
  •       2.5.1 AQ10的AQ降解
  •       2.5.2 AQ10 中的AQ积累
  •   第三节 小结与讨论
  • 第二章 GlnA和 BacD的筛选
  •   第一节 材料与方法
  •     1.1 实验材料
  •     1.2 实验方法
  •       1.2.1 GlnA的筛选
  •       1.2.2 BacD的筛选
  •   第二节 结果与分析
  •     2.1 GlnA的筛选
  •       2.1.1 不同来源glnA的克隆
  •       2.1.2 检测不同来源GlnA蛋白表达
  •       2.1.3 检测不同来源GlnA催化性质
  •     2.2 bacD基因的筛选
  •       2.2.1 表达载体的构建
  •       2.2.2 SDS-PAGE检测蛋白表达
  •       2.2.3 全细胞催化活性测定
  •   第三节 小结与讨论
  • 第三章 丙谷二肽合成菌株的构建与优化
  •   第一节 材料与方法
  •     1.1 实验材料
  •     1.2 实验方法
  •       1.2.1 AQ合成途径的构建
  •       1.2.2 bacD基因的表达优化
  •       1.2.3 平衡细胞生长与蛋白表达
  •   第二节 结果与分析
  •     2.1 glnA、bacD的组合筛选
  •       2.1.1 不同组合蛋白表达情况
  •       2.1.2 不同组合的AQ产量
  •     2.2 RBS调节bacD表达
  •       2.2.1 重组菌株蛋白表达情况
  •       2.2.2 调高BacD蛋白表达对AQ合成的影响
  •     2.3 载体拷贝数对AQ合成和菌株生长的影响
  •       2.3.1 YGS176300 生长曲线
  •       2.3.2 YGS诱导方式探究
  •       2.3.3 质粒拷贝数对生物量的影响
  •       2.3.4 不同载体中蛋白表达情况检测
  •       2.3.5 AQ合成情况检测
  •   第三节 小结与讨论
  • 第四章 全细胞催化反应条件优化
  •   第一节 材料与方法
  •     1.1 实验材料
  •     1.2 实验方法
  •       1.2.1 全细胞催化反应最适p H的探究
  •       1.2.2 全细胞催化反应最适温度的探究
  •       1.2.3 补糖策略探究
  •       1.2.4 底物配比探究
  •   第二节 结果与分析
  •     2.1 最适pH探究
  •     2.2 最适反应温度测定
  •     2.3 补糖策略探究
  •     2.4 底物配比探究
  •   第三节 小结与讨论
  • 第五章 结论与展望
  •   1.1 结论
  •   1.2 展望
  • 参考文献
  • 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
  • 致谢
  • 索引
  • 个人简历

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 朱江明

    导师: 黄建忠,陶勇

    关键词: 丙谷二肽,代谢工程,全细胞催化,氨基酸连接酶,谷氨酰胺合成酶

    来源: 福建师范大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 福建师范大学

    分类号: Q933

    DOI: 10.27019/d.cnki.gfjsu.2019.000693

    总页数: 96

    文件大小: 4465k

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