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突变型pVenus-cdc25b表达载体的构建及其功能初探

2020-12-09阅读(433)

突变型pVenus-cdc25b表达载体的构建及其功能初探

论文摘要

Cdc25b（cell division cycle 25b）,细胞分裂周期25b磷酸酶,cdc25磷酸酶家族成员之一,是一种Thr/Tyr双特异性蛋白磷酸酶,在哺乳动物细胞周期调控过程中起到逆转抑制磷酸化的作用。在生殖细胞的减数分裂恢复过程中,cdc25b可以使细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase）CDK1上14/Thr和15/Tyr上发生去磷酸化,从而导致CDK1活性恢复与周期蛋白CyclinB结合发挥功能,启动细胞分裂的进行。Cdc25b蛋白磷酸酶上有两种特异性的短序列,分别是核定位和核输出信号,在细胞质和细胞核的动态穿梭过程中发挥功能,该蛋白磷酸酶在细胞减数分裂启动之前由细胞质进入细胞核,细胞减数分裂恢复由细胞核输出进入细胞质。同时,cdc25b蛋白磷酸酶活性受到磷酸化或去磷酸化作用的调节,在cdc25b上也存在有相应的磷酸化修饰位点149位Ser和321位Ser,蛋白激酶PKA（protein kinase A）通过磷酸化或去磷酸化作用对cdc25b上的这两个位点进行修饰从而调控该酶活性,维持或解除细胞减数分裂的阻滞,进一步来调节细胞周期的进程。本研究采用分子生物方法提取雌性小鼠卵巢组织RNA反转录为cDNA,进行小鼠cdc25b基因的扩增和pVenus-cdc25b真核表达载体的构建;结合蛋白组学技术对cdc25b上PKA结合的特异性磷酸化位点进行分析,实现基因定点修饰以及构建突变型载体过表达cdc25b基因;将野生型pVenus-cdc25b-WT和突变型pVenus-cdc25b-Mut真核表达载体转染体外培养的293T细胞和Hela细胞,对其功能进行了初步验证。结果如下:1.运用特异性扩增引物扩增出小鼠cdc25b基因,完成了pVenus-cdc25-WT真核表达载体构建,对pVenus-cdc25-WT野生型质粒经Hind III和BamH I双酶切和测序分析鉴定,表明成功扩增出小鼠cdc25b基因。2.对cdc25b蛋白磷酸酶上第30位、149位、321位、351位丝氨酸位点突变,完成pVenus-cdc25b-S351A,pVenus-cdc25b-S321A,pVenus-cdc25b-S149A,pVenus-cdc25bS321A-S149A,pVenus-cdc25b-S30A突变载体的构建,经Hind III和BamH I双酶切检测和测序分析,结果显示:cdc25b上第30位、149位、321位、351位已由原来的丝氨酸Ser突变为丙氨酸Ala,成功实现对cdc25b磷酸酶特异性位点的突变。3.利用重组质粒pVenus-cdc25b-WT和pVenus-cdc25b-Mut分别对培养的293T细胞和Hela细胞进行转染,结果显示:pVenus空载和pVenus-cdc25b-WT转染之后,cdc25b磷酸酶主要在两种细胞的胞质中定位表达,只有少量在胞核定位表达;而pVenus-Cdc25b-Mut转染之后,cdc25b磷酸酶均只在两种细胞的胞核中定位表达,而胞质中未见定位表达。结论:本试验成功突变了小鼠cdc25b基因特异性磷酸化位点,构建了pVenus-cdc25b各型突变载体。对突变载体转染体外培养的293T细胞和Hela细胞结果表明,cdc25b磷酸酶在细胞的分裂过程中是一个质核穿梭的动态过程,当cdc25b磷酸酶上特异性磷酸化位点发生突变之后,核定位和核输出序列功能改变出现明显的胞核滞留现象。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 主要符号对照表
  • 文献综述
  •   第一章 cdc25 对细胞分裂周期调控作用的研究进展
  •     1.1 细胞分裂过程
  •     1.2 细胞分裂的分子机制
  •       1.2.1 细胞分裂的相关分子信号通路
  •       1.2.2 卵母细胞减数分裂分子机制
  •     1.3 cdc25 蛋白磷酸激酶
  •     1.4 cdc25 蛋白磷酸激酶家族及功能
  •       1.4.1 cdc25a结构与功能
  •       1.4.2 cdc25b的结构与功能
  •       1.4.3 cdc25c的结构与功能
  •     1.5 cdc25b对细胞周期的调控
  •     1.6 cdc25b对生殖细胞的周期调控
  •     1.7 本研究内容及目的意义
  • 试验研究
  •   第二章 小鼠cdc25b基因克隆及表达载体构建
  •     2.1 材料
  •       2.1.1 试验动物
  •       2.1.2 主要试剂
  •       2.1.3 主要仪器设备
  •     2.2 方法
  •       2.2.1 RNA 提取及反转录
  •       2.2.2 小鼠cdc25b基因扩增
  •       2.2.3 野生型pVenus-cdc25b真核表达载体的构建
  •     2.3 结果
  •       2.3.1 小鼠cdc25b基因的扩增
  •       2.3.2 野生型pVenus-cdc25b-WT载体构建
  •       2.3.3 野生型pVenus-cdc25b-WT质粒测序鉴定
  •     2.4 讨论
  •     2.5 小结
  •   第三章 pVenus-cdc25b突变载体构建及功能验证
  •     3.1 材料
  •       3.1.1 试验动物
  •       3.1.2 主要试剂
  •       3.1.3 主要仪器设备
  •     3.2 方法
  •       3.2.1 cdc25b基因定点突变
  •       3.2.2 突变型pVenus-cdc25b真核表达载体的构建
  •       3.2.3 293T细胞及Hela细胞转染
  •     3.3 结果
  •       3.3.1 cdc25b基因定点突变
  •       3.3.2 pVenus-cdc25b基因突变载体构建
  •       3.3.3 pVenus-cdc25b突变载体的测序鉴定
  •       3.3.4 pVenus-cdc25b质粒转染细胞
  •     3.4 讨论
  •       3.4.1 重组突变载体pVenus-cdc25b在细胞中表达定位的差异性
  •       3.4.2 重叠PCR技术诱导cdc25b基因定点突变
  •       3.4.3 重组载体pVenus-cdc25b构建策略
  •     3.5 小结
  • 结论
  • 本研究的创新点与下一步研究计划
  •   创新点
  •   下一步研究计划
  • 参考文献
  • 致谢
  • 个人简介

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 梁学超

    导师: 卿素珠,雷安民

    关键词: 真核表达载体,磷酸化,位点突变

    来源: 西北农林科技大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学

    单位: 西北农林科技大学

    基金: 陕西省重点研发计划项目(2018NY-001)

    分类号: Q78

    总页数: 62

    文件大小: 2074K

    下载量: 66

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