适于棘尾虫（Stylonychia）基因功能研究的CRISPR技术研究

论文摘要

在棘尾虫属中以模式物种浮萍棘尾虫（Stylonychia lemnae）研究得最为深入。浮萍棘尾虫是研究细胞和分子生物学机制的重要生物,已经完成大核基因组测定,这使得棘尾虫属的基因功能研究成为可能。基因敲除是目前研究基因功能最为有效的手段。但在原生动物尤其是棘尾虫属的基因组上进行高效、精确的基因敲除来验证基因功能的研究缺乏参考资料。CRISPR/Cas9系统是近年来发展最快速的基因组编辑技术,它能够实现基因的定点编辑,因其更具高效性和灵活性而广受研究者青睐。创建适合棘尾虫的CRISPR/Cas9系统能够有效推动棘尾虫基因功能的研究。本研究从探讨棘尾虫密码子的偏好性入手,在棘尾虫中创建CRISPR/Cas9基因编辑系统,针对对棘尾虫AdSS基因的功能开展实验,以建立适合棘尾虫基因功能研究的CRISPR技术平台。主要结果如下:通过对棘尾虫第3位密码子的GC含量计算,发现第3位密码子富含A和U。通过对浮萍棘尾虫基因组进行PR2-plot绘图分析,发现第3位碱基T的使用频率高于A,C的使用频率高于G。结合中性绘图分析、ENC-plot绘图分析、PCA分析,发现浮萍棘尾虫基因组密码子偏好性受突变和自然选择的影响比较大,但与此同时也受到其他因素的影响,密码子偏好性是多因素影响的结果。最终通过高表达优越密码子方法确定AGA、GGA、UUA等24个密码子为最优密码子。通过PCR扩增方法在棘尾虫中克隆到一个注释为腺苷酸基琥拍酸合成酶的基因AdSS,通过核酸和蛋白序列比对,发现浮萍棘尾虫AdSS基因与第四双小核草履虫、多子小瓜虫和嗜热四膜虫高度同源。通过同时双酶切cDNA和pEGFP-N1载体的方法构建定位AdSS基因的载体,验证该基因主要位于细胞质的核糖体中。根据棘尾虫密码子偏好性分析得到的最优密码子改造载体中的Cas9蛋白,筛选出成功突变的质粒进行转染,与此同时对浮萍棘尾虫中的AdSS基因设计多个sgRNA打靶位点,成功获得1个sgRNA作用于目的基因,并产生大片段缺失。AdSS基因被敲除后,虫体的运动性明显降低,生长发育也受到影响,少量虫体产生畸形。为了检测敲除效率,利用实时荧光定量PCR技术完成对突变体的检测,证明该CRISPR/Cas9系统能够在棘尾虫中实现目标基因的编辑。综上所述,本研究筛选并验证棘尾虫的最优密码子,对敲除载体进行了优化,成功利用CRISPR/Cas9系统实现了对棘尾虫AdSS基因的特异敲除,证明该系统可有效应用于棘尾虫的基因组编辑,获得的具有稳定突变的细胞克隆和构建的CRISPR打靶载体为后续棘尾虫基因功能的研究奠定了坚实的基础。

论文目录

摘要

Abstract

第1章绪论

1.1 棘尾虫概述

1.1.1 棘尾虫简介

1.1.2 棘尾虫研究现状

1.2 棘尾虫基因功能研究现状

1.2.1 基因功能研究新技术

1.2.2 棘尾虫的基因功能研究现状

1.3 密码子偏爱性研究

1.3.1 密码子的使用模式

1.3.2 影响密码子使用的因素

1.4 CRISPR/CAS9 基因敲除技术的研究

1.4.1 利用基因敲除对基因功能的研究

1.4.2 CRISPR/Cas9 表达系统简介

1.5 本研究的目的和意义

1.6 研究方案

第2章棘尾虫密码子偏爱性研究

2.1 材料与方法

2.1.1 数据来源

2.1.2 分析方法

2.2 结果

2.2.1 密码子组成分析

2.2.2 相对同义密码子使用度分析

2.2.3 中性绘图分析

2.2.4 ENC-plot绘图分析

2.2.5 PR2-plot绘图分析

2.2.6 主成分分析（PCA）

2.3 讨论

第3章棘尾虫CRISPR敲除载体构建

3.1 材料与方法

3.1.1 主要实验药品与载体

3.1.2 实验仪器

3.1.3 载体的突变

3.1.4 gRNA设计

3.1.5 gRNA表达载体的构建

3.1.6 Cas9表达载体的构建

3.2 结果

3.2.1 载体突变结果

3.2.2 gRNA表达载体的构建

3.2.3 Cas9表达载体的构建

3.3 讨论

第4章浮萍棘尾虫ADSS基因的克隆及序列分析

4.1 材料与方法

4.1.1 虫株培养

4.1.2 主要试剂

4.1.3 实验仪器

4.1.4 引物设计与合成

4.1.5 总RNA的提取及c DNA合成

4.2 结果

4.2.1 AdSS基因的扩增和克隆

4.2.2 AdSS蛋白的基本理化性质

4.2.3 AdSS蛋白的结构预测

4.2.4 AdSS基因系统发育树构建

4.2.5 AdSS基因的定位结果

4.3 讨论

第5章棘尾虫CRISPR敲除虫株的构建

5.1 材料与方法

5.1.1 主要实验药品

5.1.2 实验仪器

5.1.3 转染步骤

5.1.4 RT-qPCR检测

5.1.5 G418抗性筛选

5.2 结果

5.2.1 敲除质粒转染棘尾虫结果

5.2.2 敲除结果检验

5.3 讨论

结论

参考文献

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 范金凤

导师: 陈瑛

关键词: 棘尾虫,密码子偏好性,基因,实时荧光定量

来源: 哈尔滨师范大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学

单位: 哈尔滨师范大学

分类号: Q78

总页数: 70

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