利用CRISPR/Cas9技术构建OAS2敲除的PK-15细胞系及敲除OAS2对CSFV复制的影响

论文摘要

为研究猪源2’-5’寡腺苷酸合成酶2（OAS2）对CSFV复制的影响,本研究利用CRISPR/Cas9系统构建敲除OAS2的PK-15细胞系（PK-OAS2-KO）。在构建PK-OAS2-KO细胞系时,设计2条分别靶向OAS2基因第1和第2外显子的特异性sg RNAs,将sg RNA插入LentiCRISPRv2载体获得重组质粒plentiCRISPRv2-sgRNA;将重组质粒与辅助质粒共转染HEK293T细胞,包装获得携带sg RNA的慢病毒后以MOI 1转导PK-15细胞,通过嘌呤霉素药物筛选及有限稀释法获得单克隆细胞株,经基因测序和western blot鉴定OAS2敲除效果。利用MOI 0.01r CSFV-Rluc株（报告病毒）或CSFV Shimen株分别感染PK15细胞获得的PK-OAS2-KO细胞系,经荧光素酶活性检测和q RT-PCR证实敲除OAS2基因能够促进CSFV复制。综上,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了OAS2基因敲除的PK-15细胞系,并发现OAS2具有抑制CSFV复制的作用,本研究为进一步研究OAS2抗CSFV作用的分子机制提供了依据。

论文目录

1 材料与方法

1.1 主要实验材料

1.2 Le ntiCRIS P Rv2-s gRNA敲除质粒的构建与鉴定

1.3 不同s gRNA对OAS 2基因切割效果的检测

1.4 OAS 2基因敲除的P K-15细胞的制备及筛选

1.5 P K-OAS 2-KO细胞株OAS 2基因及其蛋白敲除的检测

1.6 敲除OAS 2对CS FV复制的影响

1.7 数据处理

2 结果

2.1 Le n ti CRIS P Rv2-s gRNA敲除质粒的构建与鉴定

2.2 不同s gRNA对OAS 2基因敲除效果的检测结果

2.3 OAS 2基因敲除细胞P K-OAS 2-KO的筛选与测序鉴定结果

2.4 OAS 2基因敲除细胞P K-OAS 2-KO OAS 2蛋白敲除的鉴定结果

2.5 敲除OAS 2对CS FV复制影响的检测结果

3 讨论

文章来源

类型: 期刊论文

作者: 张越秀,张华伟,李连峰,仇华吉

关键词: 寡腺苷酸合成酶,猪瘟病毒

来源: 中国预防兽医学报 2019年11期

年度: 2019

分类: 农业科技,基础科学

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室

基金: 国家自然科学基金(31702220),黑龙江省自然科学基金(QC2017027)

分类号: S852.651

页码: 1094-1098+1105

总页数: 6

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利用CRISPR/Cas9技术构建OAS2敲除的PK-15细胞系及敲除OAS2对CSFV复制的影响

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