论文摘要
番杏（Tetragonia tetragonioides（Pall.）Kuntze）为番杏科番杏属一年生或二年生半蔓性草本植物,分布于亚热带及温带地区的滨海富盐区域,是一种具有经济价值和生态价值的盐生蔬菜。番杏作为一种高耐盐性的盐土植物（halophyte）,可耐受海水盐度,可在海水倒灌引起的盐滞地区正常生长,常用于改良和利用滨海滩涂地、盐荒地和海水倒灌的农田,是一种具有重要生态价值的经济作物。本文以番杏为研究对象,从番杏的cDNA文库中随机测序获得基因TtASR（GenBank登录号:MH454101）,并对其进行生物信息学分析和基因功能验证,研究结果如下:1.番杏TtASR的生物信息学分析:TtASR全长1112 bp,编码区长度为723 bp,编码243个氨基酸,蛋白质等电点为5.26,分子质量大小是25.29 KD。TtASR蛋白的N端富含甘氨酸;而其靠近C端含有ASR蛋白共有的ABA和水分胁迫结构域（ABA/WDS domain）;在C末端含有一个核定位序列NLS（Nuclear localization signal）,推测TtASR可能分布于细胞核。2.番杏TtASR的表达分析:TtASR在番杏植株内广泛表达;同时,高盐、高渗透压、ABA等胁迫条件均可以诱导TtASR基因的表达。3.TtASR蛋白在大肠杆菌中的异源表达功能验证:通过在大肠杆菌中诱导表达TtASR蛋白,可以提高大肠杆菌菌株耐盐、抗渗透压、抗氧化的能力。4.TtASR的酵母功能验证:TtASR基因能够提高野生型酿酒酵母菌WT303的耐盐性,以及提高氧化敏感型酿酒酵母菌株Δyap1、Δskn7菌株的抗氧化能力。5.TtASR转录活性检测:利用β-半乳糖苷酶法检测TtASR的转录活性,发现TtASR基因与一些ASR家族基因不一样,并不具有转录活性,推测与其N-terminal结构域相关。6.番杏TtASR的亚细胞定位分析实验结果表明:TtASR蛋白主要分布在细胞质与细胞核中。7.番杏TtASR在拟南芥中的转基因超表达验证:将TtASR构建到转基因超表达载体上,通过农杆菌侵染法转化到拟南芥中,经抗性筛选得到超表达纯合植株。对不同逆境胁迫下转基因株系种子的根长以及植株的生长情况进行观察分析,结果证明了TtASR在拟南芥中的超表达增强了拟南芥的耐盐性、耐旱性以及抗氧化能力。
论文目录
摘要ABSTRACT第一章 前言 1.1 土地盐渍化对中国农业的影响 1.2 植物对非生物胁迫的应答 1.2.1 植物对盐渍胁迫的响应 1.2.2 植物对干旱胁迫的响应 1.3 盐土植物番杏简介 1.4 ASR基因简介 1.4.1 ASR基因家族的研究现状 1.4.2 ASR基因的特征 1.4.3 ASR蛋白的分布和表达特性 1.4.4 ASR基因的表达调控方式 1.4.5 植物ASR基因的抗逆性 1.5 研究内容与意义第二章 材料与方法 2.1 .实验材料 2.1.1 生物材料 2.1.2 载体 2.1.3 试剂盒、化学试剂与培养基 2.1.4 引物 2.1.5 常用溶液的配制 2.1.6 实验仪器 2.1.7 实验工具网站和软件 2.2 实验方法 2.2.1 番杏cDNA文库的构建 2.2.1.1 Total RNA的提取 2.2.1.2 mRNA的分离mRNA分离纯化 2.2.1.3 cDNA文库（Uncut型）的构建 2.2.1.4 cDNA第一链的合成 2.2.1.5 cDNA第二链的合成 2.2.1.6 BP重组反应 2.2.1.7 电转化大肠杆菌DH10B 2.2.1.8 Uncut文库的质粒抽提 2.2.1.9 文库质粒重组 2.2.1.10 电转化大肠杆菌DH10B 2.2.2 番杏文库目标基因TtASR的获得 2.2.3 番杏TtASR基因的生物信息学分析 2.2.3.1 TtASR基因序列分析 2.2.3.2 TtASR蛋白结构域结构预测以及氨基酸等理化性质预测 2.2.4 TtASR基因的表达分析 2.2.4.1 番杏成熟植株的培植 2.2.4.2 番杏成熟期材料的获取 2.2.4.3 番杏内参基因Actin片段的克隆 2.2.4.4 番杏各成熟组织的总RNA的提取 2.2.4.5 cDNA链的合成 2.2.4.6 实时荧光定量Quantitative Real-time PCR 2.2.5 TtASR基因在不同胁迫下的表达分析 2.2.5.1 番杏成熟植株的前期处理 2.2.5.2 成熟番杏植株的胁迫处理 2.2.5.3 番杏各处理组织总RNA的提取 2.2.5.4 cDNA链的合成 2.2.5.5 实时荧光定量Quantitative Real-time PCR 2.2.6 TtASR蛋白异源诱导表达 2.2.6.1 目的基因的扩增 2.2.6.2 目的基因的回收 2.2.6.3 载体的线性化与回收 2.2.6.4 目的基因与载体的连接 2.2.6.5 重组载体转化大肠杆菌DH5α 2.2.6.6 阳性克隆的PCR鉴定 2.2.6.7 重组质粒的提取 2.2.6.8 重组质粒的测序 2.2.6.9 重组载体转化至大肠杆菌BL 2.2.6.10 阳性克隆的PCR鉴定 2.2.6.11 TtASR蛋白的诱导 2.2.7 TtASR-GST蛋白在大肠杆菌中的耐受性 2.2.7.1 大肠杆菌生长曲线的测定 2.2.7.2 TtASR诱导蛋白表达菌株在不同胁迫下的生长状况 2.2.8 TtASR基因酵母互补试验 2.2.8.1 酵母感受态的制备 2.2.8.2 乙酸锂法转化酵母 2.2.8.3 酵母抗氧化及耐盐互补实验 2.2.9 通过β-半乳糖苷酶法检测TtASR的转录活性 2.2.9.1 目的基因的扩增 2.2.9.2 目的基因的回收 2.2.9.3 载体的线性化与回收 2.2.9.4 目的基因与载体的连接 2.2.9.5 重组载体转化大肠杆菌DH5α 2.2.9.6 阳性克隆的PCR鉴定 2.2.9.7 重组质粒的提取 2.2.9.8 重组质粒的测序 2.2.9.9 重组载体的酵母感受态转化 2.2.10 TtASR亚细胞定位分析 2.2.10.1 TtASR蛋白亚细胞定位载体以及转基因植物表达载体的pEGAD-TtASR构建 2.2.10.2 冻融法转化农杆菌GV3101 2.2.10.3 农杆菌菌液侵染拟南芥花序 2.2.10.4 转基因超表达植株的鉴定 2.2.10.5 TtASR蛋白亚细胞定位分析 2.2.11 TtASR在拟南芥中转基因超表达以及功能鉴定 2.2.11.1 TtASR转基因超表达纯合植株的获取 2.2.11.2 不同胁迫处理幼苗的根长 2.2.11.3 干旱处理拟南芥幼苗第三章 结果与分析 3.1 TtASR基因的生物信息学分析 3.2 番杏TtASR的表达量 3.3 TtASR蛋白异源诱导表达 3.4 TtASR蛋白表达菌株在不同胁迫下的生长状况 3.5 TtASR基因酵母互补功能验证 3.6 TtASR转录活性检测 3.7 TtASR蛋白亚细胞定位 3.8 TtASR在拟南芥中转基因纯合子的获得 3.9 TtASR转基因拟南芥的功能鉴定 3.10.1 TtASR转基因株系不同胁迫下幼苗根长情况 3.10.2 TtASR转基因株系在干旱胁迫下幼苗的表型第四章 结论与讨论 4.1 结论 4.2 讨论 4.3 展望参考文献研究生期间发表的论文致谢
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 叶玉妍
导师: 杨礼香
关键词: 番杏,耐盐,耐旱,转基因
来源: 广州大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 广州大学
分类号: Q943.2
总页数: 71
文件大小: 3954K
下载量: 50
相关论文文献
标签：番杏论文; 耐盐论文; 耐旱论文; 转基因论文;
