傅爽1，黄钰2
（1.武汉市汉阳区疾病预防控制中心，湖北武汉，430051；
2.湖北省第三人民医院，湖北武汉，430032）
摘要：人类暴露在多样化的环境毒物下，这和一系列的疾病的发展息息相关。转录因子Nrf2，已经表现出对细胞保护酶网络表达的调控能力，研究表明一系列细胞保护酶处在Nrf2控制下。Nrf2诱导的细胞保护酶在保护人类健康中的作用越来越明显，同时Nrf2也已被证明能有效地消除致癌物质的代谢活性，能抑制环境化学致癌物的致癌作用。本文就Nrt2-keap1信号通路结构特点及Nrt2-keap1信号通路的研究进展作一综述。
关键词：NF-E2相关因子2；氧化性应激；肿瘤
1.Nrf2-keap1的基本结构
1.1Nrf2的基本结构
Nrf2于1994年由Moi等[1]克隆出，属于转录因子CNC家族,含有亮氨酸拉链(basicleucinezipper,bZip)结构。NRF2含有6个不同的功能区，分别被命名为Nehl到Neh6。Nehl区包含1个C端亮氨酸拉练结构(bZIP),bZIP与细胞核内Maf蛋白形成异二聚体,使Nrf2能够识别、结合抗氧化反应元件(antioxidantresponseelement,ARE)上的(APG)TGA(CPT)nnnGC(APG)DNA基序从而启动目标基因转录。Neh2区是Nrf2与胞浆蛋白Keap1的结合区[2]，Neh3结构域位于羧基端，可上调Nrf2靶基因的表达[3]，Neh4、Neh5是参与启动下游基因转录的结构域[4]，
Neh6结构域是氧化还原非敏感区对氧化应激状态下Nrf2降解有重要作用[5]。目前认为Nrf2是调控细胞对抗外来异物和氧化损伤的关键转录因子，Nrf2缺失或
作者简介：傅爽（1987～），男，湖北人，硕士研究生,研究方向：理化检验
通讯作者：黄钰（1988～），女，湖北人，研究方向：临床检验，4261739@qq.com
激活障碍，会引起细胞对应激源的敏感性增高，与化学促癌的发生、细胞调亡等病变过程密切相关[6]。
1.2Keapl的基本结构和功能
Keapl蛋白是一个与胞浆肌动蛋白结合的含624个氨基酸的多肽，主要有DGR区、BTB区、IVR区。生理状态下，Keapl与Nrf2结合并将其锚定在胞浆，处于非活性状态。当受到亲电试剂或氧化剂的作用，Keapl与Nrf2解耦联使得Nrf2转移入核，与Maf蛋白结合成异二聚体后识别并结合ARE，启动Ⅱ相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因的转录，提高细胞抗氧化应激能力[7]。
2.Nrf2-keap1的信号通路
Nrf2蛋白是抗氧化剂反应元件（ARE）在靶基因的启动子[7]。通常情况下,Nrf2存在于有Keap1的细胞质中，生理状态下，Keapl与Nrf2结合并将其锚定在胞浆，同时结合泛素化连接酶促进Nrf2泛素化和在蛋白酶作用下的降解，使NH2处于非活性状态。在接触了一些外界刺激后,Keap1中的Nrf2分离出来，如活性氧（ROS）、活性氮、脂质醛和15-脱氧-D-内源性前列腺素。实验表明Nrf2从锚定状态分离存在不同的机制。第一种是Keap1中包含的半胱氨酸与亲电子物质反应形成蛋白质交联，导致Keap1-Nrf2的结合与Nrf2的释放的中断[8]。第二个机制需要二级传感蛋白和这种蛋白激酶信号通路的活化使Nrf2磷酸化，使其更稳定和/或由此释从Keap1中放出的NRF2[9]。一旦进入细胞核，Maf蛋白导致Nrf2与抗氧化反应元件ARE结合,启动ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶体Π分子伴侣等基因转录和表达以抵抗内外界的有害刺激[10]。多微阵列分析Nrf2的野生型（WT）和缺陷型（N0期）小鼠已经确定了一系列Nrf2调节的细胞保护酶，其中包括谷胱甘肽还原酶，过氧化物酶，过氧化氢，铜/锌超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶[11-13]。
3.NRF2-Keap1通路的研究进展
3.1NRF2抗氧化作用
氧化压力的增加已成为了一系列与环境毒物暴露相关的急慢性疾病的病因。体外研究证明了Nrf2相关的信号通路对肌体接触氧化剂后的细胞毒性有重要的保护作用。Nrf2在正常HEpG2细胞中能最低限度的减少抗氧化酶的表达，使氧化损伤的生物标志物的水平不变。虽然在无负荷情况下的Nrf2对基础水平的活性氧的作用很小，但是在氧化应激状态下Nrf2的细胞保护的适应性反应是至关重要的。一些研究人员使用氧化神经退行性疾病模型证实了Nrf2对大脑的细胞保护适应性反应。在纹状体内注射丙二酸或使用三硝基丙酸(3-NP),同时使用线粒体复合体II抑制剂。相对于WT小鼠，在N0小鼠中产生更严重的神经毒性和运动神经功能低下的表现[11-13]。此外，在帕金森病小鼠模型中，对氧化应激介导的神经退行性疾病模型中使用1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）证实了Nrf2对神经功能的保护。这些研究显示，在体外和体内Nrf2信号途径抗氧化应激的重要性[10]。
3.2Nrf2的抗炎作用
花生四烯酸在环氧合酶(COX)作用下合成的15d-PGJ2是激活Nrf2的内源性诱导剂之一，,15d-PGJ2可与Keap1形成共价加合物,与Nrf2-Keap1结合形成竞争[14]。炎症介导的氧化应激是活化Nrf2调控的细胞保护反应的刺激因素。例如，在肺脓毒症模型中施用脂多糖(LPS)，相对于野生型小鼠，N0小鼠肺部检测到氧化谷胱甘肽含量升高，说明了Nrf2影响的抗氧化酶能调节炎症介导的氧化应激。此外，Nrf2能调节抗氧化酶的表达加强和亲炎症介质的表达降低，像炎症介质-2，白细胞介素-1β，IL-6和肿瘤坏死因子，这些在WT小鼠的肠炎模型中被发现，但N0小鼠中没有，并且Nrf2调节的信号通路已被证明能使NF-κB活化。相对于野生型小鼠，N0小鼠已经证明NF–κB活性升高[13]。总而言之，这些研究表明，Nrf2的信号通路可以有效的抑制亲炎症刺激导致炎症和减少炎症的损害。
3.3Nrf2肿瘤发生的关系
正常状态下,细胞质中的Nrf2与Keap1结合并处于活性相对抑制状态。当细胞接触到一些致癌物时,引起Nrf2与Keap1解偶联,激活此信号转导通路并启动靶基因的转录及表达,如NQO1、多种GST同工酶、HO-1等,提高了细胞的氧化应激及修复功能,避免了肿瘤的发生。现已证明,Keap1的两个半胱氨酸(C273和C288)残基对Nrf2-Keap1复合物的稳定起关键作用。ARE调控基因的诱导剂能共价修饰或氧化Keap1IVR中的半胱氨酸硫醇,导致Keap1构象改变,使其不能与Nrf2结合,为Nrf2转移入核提供了条件[15]。同时，Keap1BTB的保守丝氨酸突变为丙氨酸(S104A)，导致Nrf2不再与Keap1结合,并转移到细胞核中[16]。Singh等[17]发现在许多肿瘤和一些肺癌细胞系中Nrf2-Keap1信号转导通路已经被损坏。也有研究表明,当活性氧增加时,Nrf2-ARE信号转导通路可调节许多解毒酶的表达,如果这一保护机制被破坏,将会增加DNA的损伤,这可能是前列腺癌发生的原因之一。由此可见,Keap1可能是一个新的抑癌基因,其突变可导致肿瘤发生。
4.小结
Nrf2-Keap1系统在细胞抵御外源性或内源性氧化应激的机制中有重要地位，同时在预防肿瘤形成，药物性肝损伤、炎症修复、细胞凋亡等过程中也发挥了重要作用。Nrf2对细胞保护酶的调节作用具有巨大潜力，通过对Nrf2的进一步了解将为肿瘤，衰老，炎症等方面的预防和治疗提供新的思路。
参考文献
[1]MoiP,ChanK,AsunisI,etal.IsolationofNF2E22relatedfactor2(Nrf2),aNF2E22likebasicleucinezippertranscriptionalactivatorthatbindstothetandemNF2E2PAP1repeatofthebeta2globinlocuscontrolregion[J].ProcNatlAcadSci,1994,91(21):9926-9930.
[2]NioiP,McMahonM,ItohK,etal.IdentificationofanovelNrf22regulatedantioxidantresponseelement(ARE)inthemouseNAD(P)H:quinoneoxidoreductase1gene:reassessmentoftheAREconsensussequence[J].BiochemJ,2003,374(Pt2):3372348
[3]NioiP,NguyenT,SherrattPJ,etal.Thecarboxy2terminalNeh3domainofNrf2isrequiredfortranscriptionalactivation[J].MolCellBiol,2005,25(24):10895210906
[4]KatohY,ItohK,YoshidaE,etal.TwodomainsofNrf2cooperativelybindCBP,aCREBbindingprotein,andsynergisticallyactivatetranscription[J].GenesCells,2001,6(10):8572868
[5]McMahonM,ThomasN,ItohK,etal.Redox2regulatedturnoverofNrf2isdeterminedbyatleasttwoseparateproteindomains,theredox2sensitiveNeh2degronandtheredox2insensitiveNeh6degron[J].JBiolChem,2004,279(30):31556231567.
[6]KobayashiA,OhtaT,YamamotoM,UniquefunctionoftheNrf22keap1pathwayintheinducibleexpressionofantioxidantanddetoxifyingen2zynmes[J].MethodsEnzymol,2004,378:273-286.
[7]MotohashiH，YamamotoM．Nrf2一Keapldefinesaphysiologicallyimportantstressresponsemechanism[J]．TrendsMolMed，2004,10(11)l549-557．
[8]wakabayashiN,Dinkova-KostovaA,HoltzclawW,KangM,KobayashiA,YamamotoM,KenslerT,TalalayP.Protectionagainstelectrophileandoxidantstressbyinductionofthephase2response:fateofcysteinesoftheKeap1sensormodifiedbyinducers[J].ProcNatlAcadSciUSA2004,101:2040–2045.
[9]HuangH,NguyenT,PickettC.PhosphorylationofNrf2atSer-40byproteinkinaseCregulatesantioxidantresponseelement-mediatedtranscription[J].JBiolChem,2002,277:42769–42774.
[10]WilliamOOsburnandThomasWKensler1.Nrf2signaling:Anadaptiveresponsepathwayforprotectionagainstenvironmentaltoxicinsults[J].MutatRes.2008,659(1-2):31–39.
[11]LeonardM,KieranN,HowellK,BurneM,VaradarajanR,DhakshinamoorthyS,PorterA,O'FarrellyC,RabbH,TaylorC.Reoxygenation-specificactivationoftheantioxidanttranscriptionfactorNrf2mediatescytoprotectivegeneexpressioninischemia-reperfusioninjury[J].FASEBJ2006,20:2624–2626.
[12]KwakMK,WakabayashiN,ItohK,MotohashiH,YamamotoM,KenslerTW.Modulationofgene1expressionbycancerchemopreventivedithiolethionesthroughtheKeap1-Nrf2pathway.Identificationofnovelgeneclustersforcellsurvival[J].JBiolChem2003,278:8135–8145.[13]ThimmulappaRK,MaiKH,SrisumaS,KenslerTW,YamamotoM,BiswalS.IdentificationofNrf2-regulatedgenesinducedbythechemopreventiveagentsulforaphanebyoligonucleotidemicroarray[J].CancerRes2002,62:5196–5203.
[14]HuangH,NguyenT,PickettC.PhosphorylationofNrf2atSer-40byproteinkinaseCregulatesantioxidantresponseelement-mediatedtranscription[J].JBiolChem2002,277:42769–42774.
[15]WakabayashiN,Dinkova-KostovaAT,HoltzclawWD,etal.Protectionagainstelectrophileandoxidantstressbyinductionofthephase2response:fateofcysteinesoftheKeap1sensormodifiedbyinducers[J].ProcNatlAcadSciUSA,2004,101(7):2040-2045.
[16]ZipperLM,MulcahyRT.TheKeap1BTB/POZdimerizationfunctionisrequiredtosequesterNrf2incytoplasm[J].JBiolChem,2002,277(39):36544-36552.
[17]SinghA,MisraV,ThimmulappaRK,etal.DysfunctionalKEAP1-NRF2interactioninnon-small-celllungcancer[J].PLoSMed,2006,3(10):e420