张瑛[1]2003年在《胰岛素样生长因子-1对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤神经元凋亡及Caspase-3表达的影响》文中研究表明围产期窒息所致的缺氧缺血性脑病(Hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是导致新生儿死亡的常见原因，存活者常遗留严重的后遗症。HIE后神经元的死亡发生于两个不同的阶段：第一阶段为原发性神经元死亡，在窒息后早期发生，是由于缺氧缺血导致的细胞溶解坏死；第二个阶段为迟发性神经元死亡，发生在几小时之后。现在认为迟发性神经元死亡即为凋亡。因此，进一步对HIE后的凋亡进行研究，探讨HIE后凋亡的防治问题很有必要。 胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1, IGF-1)是神经营养因子中的一种，具有非选择性的神经营养作用。研究表明，IGF-1能减轻多种病理变化下神经元的凋亡。但IGF-1对新生动物缺氧缺血后神经元凋亡的影响及其剂量—效应关系目前报道较少。本课题在建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)模型后以不同剂量IGF-1侧脑室用药，观察其对神经元凋亡的作用，并且通过检测不同组之间大脑组织的死亡蛋白酶caspase-3活性亚单位P20表达的变化，对IGF-1的抗凋亡机制进行研究。 材料与方法 1．HIBD动物模型：取新生7d龄SD大鼠，体重12～14g，结扎左颈总动脉后放入低氧舱(含8％氧气)中2h。 2003年浙江大学硕士研究主毕业论文 2．实验分组及干预方法：HIBD后Zh将新生大鼠按体重编号，对照随机数字表分为 叁组：干预 1组、干预 2组和对照组。分别在其左侧侧脑室内注射 in g、5 n g的 IGFI 及等体积的PBS。注射部位为人字缝尖向嘴侧2刀mm，左侧1．smm，垂直2刀nun。 3．细胞凋亡及caspase－3表达的检狈 O）透射电镜法：HIBD后 24h处死动物，取缺血侧大脑皮层和海马新鲜组织各 lmm3 左右的标本。标本处理后通过 TECNAI型透射电镜观察正常、凋亡以及坏死神经元的形 态。 p）TUNEL法：HIBD后 24h处死动物，取缺血侧脑组织制成石蜡切片后用 TUNEL 法检测凋亡细胞。采用NBT显色，细胞核染成蓝黑色为TUNEL阳性细胞。在400倍光镜 下计数 TU’NEL阳性细胞数。每样本取 15个视野以上，大脑皮层计数 3000个，海马计数 1000个。 o）Western blot法：HIBD后 24h，取缺血侧大脑组织经裂解及蛋白浓度测定后上0℃ 保存。实验时每样本取 80 u g蛋白质，经 SDS－PAGE电泳及电转移后，分别加入羊抗 caspase习多克隆抗体及抗羊IgG。使用ECL显影。胶片扫描后采用NIH图象处理软件半 定量分析光密度。 4．统计学处理：采用 SPSS 10刀统计软件包非参数检验，叁组间比较用 Kluskal－Wallis 法，两两比较用Mann－Whitney法。结 果 1．电镜结果 PBS对照组的缺血侧大脑皮层和海马内可见较多具有明显凋亡特征的细胞及部分坏死细胞。两个IGF．l用药组的凋亡细胞相对较少。 2．不同剂量IGF－l对大脑皮层和海马神经元TU’NEL阳性细胞数的影响 在大脑皮层，计数3000个细胞，对照组、干预1组和干预2组的TUNEL阳性细胞数 的中位数（四分位数间距）分别为：114．0（59．5）、44．5（28．8）和36．5（21．6）。在海马， 计数 1000个细胞，对照组、干预 1组和干预 2组的 TUNEL阳性细胞数的中位数（四分位 数间距）分别为：29．0（23．2）、8．5（7．5）和 ZI．0（17．4）。两个mF－l干预组大脑皮层和 海马神经元的TUNEL阳性细胞数均明显少于缺氧缺血后注射PBS的对照组，差别有显着 2 2003年浙江大学硕士研究生毕业论文性意义（尸＜0刀5人在海马，干预 1组即 illg IGFI组的 TUNEL阳性细胞数明显少于干预2组即 5卜 g IGFI组，差另有显着性意义（尸＜0刀5）。 3．不同剂量 IGFI对大脑 caspasel P20亚单位表达的影响 叁组间 caspase习 P20亚单位的表达不尽相同。对照组、干预 1组和干预2组caspaselP20亚单位的光密度的中位数（四分位数间距）分别为 108．9（198．4）、5．1（12．4）和 27．5 （41．1）。干预 1组 P20亚单位的光密度明显低于干预 2组和对照组，差别有显着性意义（尸＜0刀5）。结 论 1．IGFI对新生大鼠HIBD后神经元的凋亡有一定的保护作用，是一种较好的神经营救因子； 2．IGFq的抗凋亡作用与caspase刁活性亚单位P20的下降紧密相关； 3．IGFI的神经元保护作用与剂量有一定的关系，in g IGFI比 5 u g IGFI效果更佳。
张瑛, 俞惠民[2]2004年在《新生鼠缺氧缺血性脑损伤后胰岛素样生长因子1对神经元凋亡的保护作用》文中研究表明胰岛素样生长因子 1(IGF 1)是一种神经营养因子 ,具有非选择性的神经营养作用。目前有关IGF 1对新生动物缺氧缺血性脑损伤 (HIBD)后神经元凋亡影响的报道较少。本研究采用不同剂量IGF 1侧脑室给药 ,观察其对新生大鼠HIBD神经元凋亡及死亡蛋
黄维清[3]2009年在《IGF-1对新生大鼠HIBD急性期线粒体功能影响的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:应用新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic braindamage,HIBD)模型,通过观察IGF-1干预后细胞色素C(Cytc)及Caspase-3表达的改变,探讨IGF-1对HIBD急性期线粒体功能的影响,探讨IGF-1对HIBD的神经保护作用及可能机制。方法:按Rice法制作新生大鼠HIBD模型,将新生7日龄SD大鼠90只随机分为正常对照组、HIBD组和HIBD+IGF-1组(各组n=30),HIBD+IGF-1组于HI后即刻予腹腔注射IGF-1,剂量0.2mg/kg。各组分别于HIBD后24h、48h、72h随机取10只大鼠,应用RT-PCR和Western Blot法检测Cyt-c及Caspase-3的mRNA及蛋白表达。结果:(1) RT-PCR检测Cyt-c mRNA的表达:正常组、HIBD组、HIBD+IGF-1组24小时相对密度值分别为:(0.20±0.03)、(0.61±0.05)、(0.47±0.07);48小时相对密度值分别为:(0.18±0.03)、(0.52±0.04)、(0.42±0.05);72小时相对密度值分别为:(0.17±0.06)、(0.45±0.02)、(0.40±0.04),叁组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。(2) RT-PCR检测Caspase-3mRNA的表达:正常组、HIBD组、HIBD+IGF-1组24小时相对密度值分别为:(0.21±0.02)、(0.65±0.03)、(0.49±0.05);48小时相对密度值分别为:(0.19±0.08)、(0.54±0.06)、(0.45±0.03);72小时相对密度值分别为:(0.17±0.04)、(0.40±0.05)、(0.38±0.06),叁组之间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。(3)用Western Blot检测Cyt-c蛋白表达:正常组、HIBD组、HIBD+IGF-1组24小时相对密度值分别为:(0.22±0.06)、(0.70±0.02)、(0.48±0.05);48小时相对密度值分别为:(0.21±0.07)、(0.48±0.03)、(0.42±0.04);72小时相对密度值分别为(0.20±0.08)、(0.37±0.04)、(0.32±0.06),叁组之间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。(4)用Western Blot检测Caspase-3蛋白表达:正常组、HIBD组、HIBD+IGF-1组24小时相对密度值分别为:(0.23±0.07)、(0.66±0.07)、(0.51±0.04);48小时相对密度值分别为:(0.24±0.08)、(0.47±0.04)、(0.45±0.03);72小时相对密度值分别为(0.22±0.05)、(0.35±0.05)、(0.32±0.05),叁组之间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。结论:IGF-1能减少新生大鼠缺氧缺血性脑损伤侧大脑皮层Cyt-C及Caspase-3 mRNA和蛋白表达;IGF-1可能通过改善线粒体功能,减少线粒体Cyt-C释放,从而减少神经细胞凋亡,对新生大鼠HIBD发挥神经保护作用。
李星儿[4]2012年在《针刺对宫内窘迫缺氧缺血性脑损伤大鼠新生神经细胞凋亡的影响研究》文中研究表明目的新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)严重危害新生儿的健康,是导致脑性瘫痪(cerebral palsy, CP)、癫痫(epilepsy)等儿童脑病的直接因素。对此类疾病的治疗至今仍为世界性医学难题。如何有效改善HIE所致的病理状况一直是医学界研究的重要内容之一。近十几年来,针灸在治疗新生儿缺氧缺血性脑病后遗症之一的脑瘫方面,取得了很大突破,针灸在脑瘫领域展现出空前的繁荣景象。随着研究的深入,一些学者发现患儿接受针灸治疗的年龄越小,疗效越显着,因此萌生了在新生儿期即对缺氧缺血性脑损伤的患儿进行针灸治疗的想法。但由于HIE的危险性和严重性、现代医学目前在我国医学系统尤其是新生儿急救领域的主导地位、中医针灸对该病作用机制的实验研究尚属空白、中医“科学性”受现代医学质疑、针灸作为有创治疗在新生儿领域的安全性等多种原因,决定了目前中医针灸难以进入该领域一展所长。因此,先在动物实验上验证中医针灸的有效性和安全性,并深入探索和揭示针灸治疗HIE的作用机制,将有助于推动针灸治疗进入新生儿HIE领域的进程。靳叁针疗法是已故广州中医药大学治疗弱智儿童的首席教授靳瑞教授所创立的学术体系,被誉为“岭南针灸新流派”。靳瑞教授及其带领的靳叁针团队,以“靳叁针头穴”为主治疗小儿脑病二十余年,疗效肯定,国家中医药管理局已将“靳叁针治疗儿童精神发育迟滞和儿童自闭症临床规范化研究”两项成果作为临床适宜疗法向全国推广。目前对“靳叁针疗法”治疗小儿脑病的临床观察研究很多,但缺乏对其作用机理的实验基础研究。本论文目的有二：一方面,以“靳叁针头穴”为切入点,旨在探索针刺对HIBD新生大鼠的作用机制是否与减少新生神经细胞凋亡有关,并进一步寻求其起效通路,为针灸治疗HIE寻找可靠的实验依据；另一方面,以针刺介入时间为切入点,比较HIBD发生后不同时间开始针刺对新生神经细胞凋亡相关指标的影响,为临床研究提供必要的理论支持。方法文献研究本部分回顾了现代医学对新生儿HIE的认识和治疗进展、古代中医对新生儿HIE认识和现代中医治疗进展、神经干细胞凋亡基因的研究进展等叁大内容。在此基础上对新生儿HIE的中西医治疗现状进行了归纳总结。实验研究本部分共包括六个实验项目。实验一采用延迟5min剖宫产术模拟宫内窘迫制造HIBD新生大鼠模型,设立正常组(自然分娩的新生大鼠)和假手术组(正常剖宫产术分娩的新生大鼠)作为对照组。根据新生大鼠出生时神经行为学表现、脑组织HE染色鉴定造模成功。将实验一中获得的各组新生大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、针刺1组和针刺2组,每组再根据处死观察的时间分为21d、28d、35d、42d、49d亚组,每组雌雄各半,饲养到第14天时,用苦味酸标记后,进入后续实验。实验二观察各组新生大鼠14～49天的体重变化,研究针刺对HIBD新生大鼠体重的影响。实验叁～六研究针刺对HIBD新生大鼠大脑皮层缺血灶中的新生神经细胞凋亡的影响。其中：实验叁采用Tunel法检测大脑皮质中凋亡的神经细胞数量；实验四采用免疫组织化学法检测大脑皮质中促凋亡基因Caspase-3蛋白的表达；实验五采用免疫组织化学法检测大脑皮质中BrdU.Nestin蛋白的表达,来反映大脑皮质中新生神经干细胞的数量和细胞增殖状况；实验六采用免疫组织化学法检测大脑皮质中抗凋亡基因14-3-3蛋白的表达。结果实验研究1、建立模型1)新生大鼠死亡率：出生21天时各组死亡率为正常组5.13%(4/78),假手术组6.82%(3/44),模型组14.66%(28/191),卡方检验p=0.049。2)新生大鼠出生时表现：正常组甫出生即全身呈现较深的粉红色,在雌鼠的舔舐下可扭动身体、挥舞四肢、发出叫声,并可迅速吃乳。假手术组和造模组甫从子宫中取出时,均全身青紫或苍白,四肢伸展,没有呼吸,心跳过速,对触觉刺激无反应。3)新生大鼠出生第2天翻正反射：最短翻正时间假手术组<正常组<模型组,其中模型组与正常组和假手术组的差异均有统计学意义(P<0.01)。10次翻正中的成功次数正常组>假手术组>模型组,其中模型组与正常组和假手术组的差异均有统计学意义(P<0.01)。4)新生大鼠出生第14天悬吊试验：正常组和假手术组完成试验的时间差别无统计学意义(P>0.05),造模组完成试验的时间均短于正常组(P<0.01)和假手术组(P<0.01)。5)新生大鼠出生第14天斜坡试验：正常组和假手术组完成试验的时间差别无统计学意义(P>0.05),造模组完成试验的时间长于正常组(P<0.01),而和假手术组的差别无统计学意义(P>0.05)。其中,正常组参加斜坡试验的新生大鼠27只,成功25只(92.6%),不成功2只(7.4%)；假手术组参加斜坡试验的新生大鼠15只,成功13只(86.7%),不成功2只(13.3%)；造模组参加斜坡试验的新生大鼠84只,成功55只(65.5%),不成功29只(34.5%)。卡方检验P<0.01,可以认为斜坡试验成功与否的结果与组别有关。6)脑组织HE染色：正常组大脑皮质的神经元分布由表及里可见分子层、外颗粒层、外锥体细胞层、内颗粒层、内锥体细胞层、多形细胞层,神经元的6层结构完整。神经元圆形或锥形,细胞质内见嗜碱性均匀分布的尼氏体,细胞核位于胞体中央,核膜明显。在一片正常细胞中间或出现个别固缩细胞。假手术组大脑皮质神经元的6层结构基本完整,局灶区域可见3层(外锥体细胞层)锥体细胞胞浆红染,胞核浓缩深染,结构消失。模型组大脑皮质的3层和5层(外锥体细胞层和内锥体细胞层)锥体细胞数量减少,细胞体积缩小,变成叁角形,胞浆呈均匀的嗜伊红染色,胞核浓缩深染,结构消失。部分海马椎体细胞层细胞亦见上述变化。2、针刺对体重的影响：新生大鼠14-49天体重：35天龄前,模型组、针刺1组、针刺2组和正常组或假手术组的体重差异有统计学意义,42天龄后,各组的体重差异均无统计学意义。3、针刺对细胞凋亡的影响：针刺1组凋亡细胞个数21-35天龄时和模型组的差异均无统计学意义(P>0.05)。针刺2组凋亡细胞个数35-49天龄时均少于模型组(P<0.01)。35天龄时,针刺2组凋亡细胞个数少于针刺1组(P<0.05)。4、针刺对Caspase-3的影响：针刺1组Caspase-3的表达21天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05),28天龄时低于模型组(P<0.01),35天龄时高于模型组(P<0.01)。针刺2组Caspase-3的表达35天龄时高于模型组(P<0.01),42和49天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。35天龄时,针刺1组和针刺2组Caspase-3的表达差异无统计学意义(P>0.05)。5、针刺对BrdU的影响：针刺1组BrdU的表达21-35天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。针刺2组BrdU的表达35-42天龄时和模型组的差异无统计学意义,49天龄时低于模型组(P<0.01)。35天龄时,针刺1组和针刺2组BrdU的表达差异无统计学意义(P>0.05)。6、针刺对Nestin的影响：针刺1组Nestin的表达21和35天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05),28天龄时高于模型组(P<0.01)。针刺2组Nestin的表达35-42天龄时和模型组的差异无统计学意义(P>0.05),49天龄时高于模型组(P<0.01)。35天龄时,针刺2组Nestin的表达低于针刺1组(P<0.01)。7、针刺对14-3-3的影响：针刺1组14-3-3的表达21天龄时高于模型组(P<0.01),28天和35天龄时,表达急剧降低,和模型组的差异无统计学意义(P>0.05)。针刺2组14-3-3的表达35天龄时低于模型组和正常组(P<0.01),42天和49天龄时,表达略有上升,而模型组和正常组在此阶段的大脑皮质中已经没有表达。35天龄时,针刺2组14-3-3的表达低于针刺1组(P<0.01)。结论文献研究1、新生儿缺氧缺血性脑病的发病机制和病理生理过程复杂,中西医多种方法综合治疗是未来的发展方向。目前国内外对该病的治疗仍以支持疗法和对症处理为主,高压氧、亚低温、神经营养因子、神经干细胞移植等多种方法仍以动物实验研究为主,未大规模应用于临床。2、古代中医对该病的理论认识和临床经验相当丰富,古人已经发展出一套处理新生儿缺氧缺血性脑病类似症状的辨证论治方案。迄今为止,尚未有学者对古代中医治疗该病的方法进行过系统总结,也未与现代中医的临床和实验研究成功对接。这是一个巨大的宝库,值得广大中医研究者去挖掘和应用。3、现代中医在新生儿缺氧缺血性脑病治疗领域以数种单一中药提取物制剂为主,临床应用也未体现中医的辨证论证精神。针灸推拿对该病的治疗集中于其神经后遗症——脑性瘫痪上,真正在新生儿期介入治疗的临床报道非常少。实验研究1、延迟5min剖宫产术在短期内可以制备大量长期存活的HIBD新生大鼠,高度模拟胎儿宫内窘迫的发病机制,且操作简便,是一种值得推广的研究缺氧缺血性脑损伤的造模方法。该方法可造成相对温和的缺氧缺血性脑损伤,新生大鼠出生后21-49天存在神经细胞“延迟凋亡”现象,是研究中枢神经细胞凋亡的理想模型。2、获得正常新生大鼠神经系统发育和细胞凋亡的生理规律：(1)正常新生大鼠21-42天龄时大脑皮质的神经干细胞持续存在,42-49天年龄段突然下降,表明42-49天年龄段,新生大鼠神经系统发育接近成熟。(2)正常新生大鼠42天龄大脑皮质的神经细胞出现凋亡高峰,随后逐渐下降。42天以前,大脑皮质中可能存在某些抑制Caspase-3促凋亡作用的因素,抑制神经细胞过度凋亡,14-3-3可能是其中一个因素。42天以后,14-3-3表达消失,大量神经细胞进入凋亡程序,但Caspase-3可能与此无关。3、获得模型组新生大鼠细胞凋亡相关的病理规律：(1)该模型42天后大脑皮质的神经细胞开始大量凋亡,新生神经干细胞减少,同时伴随异常的细胞增殖,这些增殖的细胞很可能不是正常成熟的神经元,而是修复损伤的其他神经细胞。(2)42-49天年龄段,大脑皮质神经细胞出现“延迟凋亡”的现象,与Caspase-3的表达存在因果关系。4、获得针刺对观察指标的作用规律：(1)针刺具有抑制HIBD新生大鼠大脑皮质中的细胞凋亡和BrdU的表达、提高大脑皮质中Nestin和14-3-3表达水平的作用。其中,针刺2组的上述作用均优于针刺1组。(2)针刺对神经细胞凋亡的抑制作用,可能与针刺提高14-3-3的表达水平有关,并通过抑制凋亡,间接抑制了BrdU的表达,另一方面,针刺具有促进Nestin在大脑皮质中表达的作用,能提高损伤区的新生神经干细胞水平,从而修复受损组织。(3)针刺对Caspase-3的抑制作用不明显,针刺抑制HIBD新生大鼠神经细胞凋亡的作用很可能不是通过Caspase-3途径来实现的。5、针刺介入时间研究对临床应用的启示：(1)决定针刺介入时间的关键,不一定在于越早越好。最佳的针刺介入时机,应取决于受针刺影响的靶蛋白,以及该蛋白在HIBD模型神经系统发育过程中表达发生转折的年龄段。(2)针刺影响靶蛋白表达的维持时间偏短,提示机体对针刺具有耐受性。因此找准关键时间点介入针刺治疗,才能更大限度地提高疗效。在治疗过程中,定时更换穴位进行刺激,可能有利于减少机体对该穴位的耐受性,提高针刺治疗敏感度。
赵倩[5]2016年在《IGF-1对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠急性期下丘脑Cyt-C、 Caspase-3表达及恢复期焦虑行为的影响》文中研究指明目的:探讨胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1,IGF-1)对新生小鼠缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)急性期下丘脑部位线粒体细胞色素C(Cyt-C)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)表达及恢复期焦虑行为的影响。方法:采用改良Rice方法制备新生小鼠HIBD动物模型。将新生小鼠永久性结扎右侧颈总动脉后置于缺氧舱(含8%氧气和92%氮气)中持续缺氧2h。7日龄C57/BL小鼠126只随机分为对照组42只、HIBD组42只、HIBD+IGF-1组42只。对照组仅游离右侧颈总动脉,不结扎,不进行缺氧处理,HIBD+IGF-1组在HI后即刻给予腹腔内注射IGF-1(50ug/Kg),HIBD组、对照组在HI后即刻予腹腔注射等体积生理盐水。每组随机选取36只小鼠分别于术后0h、3h、6h、12h、24h、48h时点(n=6)取其脑组织标本,采用免疫荧光染色技术检测3组小鼠不同时点下丘脑区脑细胞线粒体Cyt-C、Caspase-3的表达。每组剩余6只小鼠,分别于日龄21d、28d、42d采用高架十字迷宫实验、空场实验测定小鼠焦虑行为。结果:1免疫组化HIBD组Cyt-C及Caspase-3免疫荧光OD值于术后3h时点开始升高,但与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05),于HI后24h达高峰,6h、12h、24h、48h四个时点Cyt-C及Caspase-3免疫荧光OD值与对照组、HIBD+IGF-1组比较差异有统计学意义(P<0.05)。HIBD+IGF-1组各时点Cyt-C及Caspase-3免疫荧光OD值在6h、12h、24h、48h四个时点低于HIBD组,高于对照组,各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。2焦虑行为(1)高架十字迷宫实验P21、P28、P42时各组间开放臂停留时间的比率、开放臂进入次数的比率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中,HIBD组开放臂进入次数比率、开放臂停留时间的比率较对照组、HIBD+IGF-1组高,差异有统计学意义(P<0.05),对照组与HIBD+IGF-1组开放臂停留时间的比率、开放臂进入次数比率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。P21、P28、P42时各组间进入开放臂和闭合臂的总次数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)空场实验P21、P28、P42时各组间中央区运动距离百分比、中央区运动时间比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中,HIBD组中央区运动距离百分比、中央区运动时间较对照组、HIBD+IGF-1组高,差异有统计学意义(P<0.05),对照组与HIBD+IGF-1组中央区运动距离百分比、中央区运动时间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。P21、P28、P42时各组间水平运动总距离比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.应用IGF-1干预治疗可以减少新生小鼠HIBD后下丘脑区Cyt-C及Caspase-3的表达;2.缺氧缺血性脑损伤后C57/BL小鼠青春期焦虑行为减少,而应用外源性IGF-1干预可使其焦虑行为恢复至正常水平。
李蓓华[6]2017年在《脑缺血大鼠血清生长因子的动态变化及重组人生长激素对血管性痴呆模型大鼠作用的研究》文中研究表明目的:观察慢性脑缺血大鼠血清及脑组织生长激素及血清生长因子的动态变化;以及重组人生长激素(recombinant human growth hormone,rhGH)对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠血清生长因子及学习记忆的影响,探讨重组人生长激素对VD脑保护作用的机制。方法:1、采用Morris水迷宫筛选学习记忆能力正常的雄性SD大鼠143只,随机分入各实验组,采用间断性结扎大鼠双侧颈总动脉法制备慢性脑缺血所致VD大鼠模型,术后,给药组颈部皮下注射rhGH,给药28d后,进行Morris水迷宫实验,观察各组大鼠学习记忆能力情况;2、在脑缺血后各时间点分别从相应实验组选取8只大鼠,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清、皮质和海马组织匀浆中的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)和生长激素(growth hormone,GH)的水平变化;另一部分大鼠断头取脑制作脑组织石蜡切片,进行HE染色和TUNEL凋亡染色,观察海马CA1区病理学变化和神经元的凋亡程度,采用Image Pro Plus图像处理软件处理TUNEL凋亡染色图片,统计IOD值。结果:1、脑缺血大鼠VEGF、IGF-1和GH活性水平测定分析,与正常组相比,模型组血清、皮质及海马vegf、igf-1及gh活性水平随脑缺血时间延长均降低且有显着差异性(p<0.05);并且血清、皮质和海马vegf、igf水平和gh水平之间存在正相关性;在he染色中,模型组大鼠随缺血时间增加海马ca1区细胞排列紊乱,分布稀疏,细胞形状不规则,细核变形,出现核固缩、溶解,而正常组无此改变;2、在水迷宫实验中,随着训练天数的增加,各组逃避潜伏期均缩短。定位航行实验第六天,假手术组、模型组(28d)、重组人生长激素组(28d)逃避潜伏期分别为5.29±3.41s、23.45±3.58s和7.30±5.39s,空间探索实验穿越平台次数分别为5.87±3.27、1.32±1.19、3.14±1.50,可以发现:与正常组比较,模型组(28d)大鼠学习记忆能力显着下降,差异有统计学意义(p<0.05),说明模型制备成功。与模型组(28d)比较,重组人生长激素组(28d)学习记忆能力显着增加,差异有统计学意义(p<0.05),较正常组差异无统计学意义。重组人生长激素组大鼠vegf、igf-1和gh水平测定分析,与模型组相比,重组人生长激素组血清、皮质及海马vegf、igf-1及gh活性水平增高且有显着差异性(p<0.05);tunel凋亡染色观察发现,与模型组比较,重组人生长激素组海马ca1区神经元阳性染色减少且分布密度有所增加;与模型组比较,重组人生长激素组iod值降低,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:慢性脑缺血导致血清、皮质和海马igf-1及vegf均减少,并且与血清、皮质和海马gh水平具有直线相关性。rhgh可以增加vd大鼠gh、igf-1及vegf水平,改善其学习记忆及认知功能障碍,减轻海马神经元凋亡,提示rhgh对vd大鼠慢性缺血性脑损伤具有保护作用。
佚名[7]2007年在《其它》文中认为074038重庆地区儿童血清偏肺病毒中和活性的研究/张琴…∥中华儿科杂志.-2007,45(6).-432~436在抽取的50份血清标本中,此前通过间接酶联免疫吸附试验检测为阴性的8份标本均未显示中和活性,而42份人偏肺病毒(hMPV)IgG抗体阳性血清
李云[8]2010年在《高压氧、2ME2和Cystamine对全脑缺血模型中凋亡相关因子的多重作用及对海马神经元的保护机制》文中进行了进一步梳理[目的]①研究全脑缺血再灌注大鼠模型海马神经元凋亡的变化规律,探讨缺氧诱导因子la (HIF-la)在全脑缺血缺氧再灌注过程中的作用。②探讨严重缺氧引起的HIF-la和p53过度表达是否激活促凋亡通路caspase-9和caspase-3,能够引起细胞凋亡这样的有害结果。③我们想通过实验检验高压氧治疗(HBO)是否是由于提高了大脑的供氧水平而产生了神经保护作用,或能够证明HBO的治疗作用是由于对HIF-la和其下游凋亡基因表达的抑制而起作用。[材料和方法]材料：78只成年SD大鼠(370g)被随机分成13个组(每组数量n=6)：1个假手术组,6个全脑缺血再灌注组(GI),分别为6h,12h,24h,48h,96h和7天组,6个全脑缺血再灌注+HBO治疗组(GI+HBO),分别为6h,12h,24h,48h,96h和7天组。二血管闭塞全脑缺血模型(2VO)：该模型是由Smithl984年发明的,Sugawara做了些改进,我们有所完善。暴露大鼠颈部结构并股动脉抽血时血压保持在30-35 mmHg,随后,大鼠两边的颈总动脉被两个血管夹夹闭10分钟。10分钟后,抽出的血被注射回股动脉中,血管夹被松开。高压氧治疗(3个标准大气压持续两小时)在缺血-低血压1小时后开始.各组实验大鼠分别在6h,12h,24h,48h,96h和7天被断头取脑。Nissl染色和细胞计数：每只动物的海马CA1区在奥林巴斯迭加成像系统中定位扑捉以进行细胞数量的计算。每个区域中被计算出的Nissl染色细胞数量,CA1区细胞的密度被平均,以获得每只动物的平均值。免疫组化染色：将提供在大脑切片上海马CA1区HIF-lal阳性细胞和其它凋亡基因的分布信息。荧光双染标记：假如在相同神经元中HIF-la与其它凋亡基因均呈阳性的话,提供了唯一的信息,即可认定HIF-la和其它凋亡基因呈阳性细胞类型。TUNEL染色：提供DNA破碎的信息,这是凋亡的独特现象。蛋白质印迹分析：将提供HIF-la和其他凋亡基因在神经组织定量变化的信息。每组取4只大鼠脑的样本用于免疫印迹染色的研究。大鼠在相应的时间点断头取脑用于蛋白质印迹分析。[统计分析]本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显着性差异,则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.) P< 0.05被认为有显着性差异。[结果]Nissl染色：全脑缺血后24小时时间点,神经组织在海马区有脱失,而在缺氧的皮层神经元脱失成都较轻,在48小时时间点神经元脱失进一步加重,在7天时达到最大值。在所有时间点中,HBO治疗均减轻了脑组织神经元的脱失。全脑缺血-低血压后48小时-7天,海马CA1区的细胞数量明显少于正常对照组(P<0.05, ANOVA)。HBO治疗后48小时-7天海马CA1区的细胞数量与正常对照组有明显差异(P<0.05, ANOVA)TUNEL:全脑缺血-低血压损伤后12小时,较强的TUNEL阳性物质开始出现在海马中,而在皮层中TUNEL阳性物质相对较少。高倍镜显示TUNEL染色发生于神经核内。大脑样本中更强一些的TUNEL染色发生于全脑缺血后24-48小时。全脑缺血经HBO治疗后的样本中很少发现TUNEL细胞(尤其在12-24小时),无论在海马或者皮层中均如此。免疫荧光染色显示,全脑缺血-低血压损伤后24小时,样本海马CA1有HIF-1α阳性细胞(细胞核中的红色)。在同一玻片上进行免疫荧光双染,在神经元细胞核内(绿色),TUNEL呈现阳性染色。将两个复合体融合在一起,证明了海马神经元细胞核中TUNEL与HIF-1α的定位(黄色),这也提示了HIF-1α在凋亡细胞中表达。免疫荧光图片显示,HIF-1α仅出现于神经元的细胞核内而不在细胞浆内。p53, caspase-9和caspase-3的免疫组化表达：在正常对照组的海马和皮层中我们观察到p53, caspase-9和caspase-3免疫组化染色的阴性结果。在全脑缺血-低血压损伤后24小时,可以观察到在海马及皮层p53, caspase-9和caspase-3免疫组化染色强阳性结果。高倍镜下观测样本玻片显示在海马和皮层p53, caspase-9和caspase-3免疫组化染色阳性的神经元。在全脑缺血-低血压损伤后24小时,可以观察到在海马CA1区的神经元免疫荧光双染显示p53(绿)和HIF-1α(红)在神经元核内阳性染色。另外,caspase-9(绿)和caspase-3(绿)在细胞质内的染色呈阳性,HIF-1α(红)阳性染色在细胞核内成阳性染色。Caspase-8和bcl-2的免疫印迹染色表达：关于caspase-8和bcl-2我们获得了意象之外的结果.全脑缺血-低血压损伤后6小时,在缺血的大脑皮层,caspase-8的蛋白表达与正常对照组比较明显升高,在12小时达到高峰,24小时-7天持续维持在一个较高的水平(P< 0.05, GI vs. control, ANOVA)。HBO治疗未能改变caspase-8的蛋白表达的峰值,但却极可能亦不加强了caspase-8 12小时至7天的表达水平(P<0.05, GI+HBO vs. GI)。更有意思的是全脑缺血-低血压损伤后6小时bcl-2的蛋白表达显着升高,然后不断升高在7天时达到高峰(P<0.05, GI vs. control, ANOVA). HBO治疗在所有时间点均显着地降低了bcl-2的蛋白表达(P<0.05, GI+HBO vs. GI).与正常对照组比较,除了24小时(P<0.05 vs. control)以外HBO治疗均降低了bcl-2的蛋白表达水平(P>0.05 vs. control)。[小结]全脑缺血-低血压(10分钟全脑缺血,同时血压保持在30-35mmHg)导致大鼠海马和大脑皮层HIF-la的表达在6小时明显升高,48-96小时达到高峰。p53, caspase-9和caspase-3的表达在相同的时间点均明显升高。这些分子生物学的变化同时伴有海马区神经细胞的大量脱失,大脑皮层的神经细胞也有程度略小一点的脱失,这种细胞脱失有明显的细胞凋亡的特征。HBO能明显减少HIF-la, p53, caspase-9和caspase-3的表达,减少神经细胞的死亡。促凋亡基因caspase-8和抗凋亡基因bcl-2的蛋白水平在全脑缺血后均升高。HBO增加了caspase-8的表达,减少了bcl-2的表达。研究结果显示：尽管全脑缺氧后进行HBO整体上是降低HIF-la的表达,减少神经细胞的凋亡,但是HBO对凋亡基因具有多重作用。[目的]缺氧诱导因子1α(HIF-1α)是一个的由缺氧特异性激活的转录因子。促凋亡通路capase-3可被HIF-1α及p53激活,能够引起像细胞凋亡这样的有害作用。而survivin作为抗凋亡基因能够直接抑制capase-3的表达而减轻细胞的凋亡[1]。进一步的研究提示,survivin是caspase-3, caspase-7的抑制剂[3]。同时有试验证明HIF-1α有抑制survivin表达的作用[2,3]；也有试验表明HIF-1α有上调survivin表达的作用[4]。2ME2是否通过HIF-1α抑制剂,我们想通过实验检验2ME2是否通过抑制HIF-1α的表达而增强或减弱了survivin的表达,是否起到脑保护作用或脑损害作用。[材料和方法]雄性SD大鼠(n=78)被随机地分成13个组(n=6,每组)：1个假手术组,6个全脑缺血再灌注(GI),6个全脑缺血再灌注加2ME2治疗组(GI+2ME2)。全脑缺血10分钟取下动脉夹后,立即给予2-甲氧基雌二醇腹腔注射(16mg/kg体重),大鼠分别在6h,12h,24h,48h,96h和7天时被断头取脑。统计方法：本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA)。假如发现有显着性差异,则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.) P< 0.05被认为有显着性差异。数据用SPSS11.5软件包做统计分析。[结果]全脑缺血10分钟导致大鼠海马HIF-1α和P53的表达在6小时明显升高,48-96小时达到高峰。survivin的表达在相同的时间点均略有升高,而caspase-3的表达明显升高。这些分子生物学的变化同时伴有海马区神经细胞的大量脱失,这种细胞脱失有明显的细胞凋亡的特征。2ME2能明显减少HIF-1α表达[5],使survivin受到的抑制减弱而表达明显增加,从而减少了caspase-3的表达。[结论]研究结果显示：全脑缺氧后给予2ME2治疗,整体上是2ME2抑制HIF-1α的过度表达,HIF-1α对survivin的抑制作用减弱,继而上调了survivin的表达,survivin抑制了caspase-3的表达从而减少神经细胞的凋亡[2]。[目的]①研究全脑缺血再灌注大鼠模型海马神经元凋亡的变化规律,探讨组织型转谷氨酰胺酶(tTG),被tTG抑制的核磷蛋白(NPM),及相关的p53和caspase-3在海马缺血再灌注后的相互作用关系。②缺血再灌注后,应用组胺(cystamine, CYS)作为tTG干预抑制剂,其对于tTG下游相关基因NPM、P53和caspase-3的影响。③通过对tTG的抑制剂cystamine与tTG及其相关基因核磷蛋白和p53和caspase-3相互作用关系的研究,探讨cystamine的保护海马神经元的作用机制。[材料和方法]采用4血管阻断法制作大鼠全脑缺血模型,脑电图验证成功与否。104只SD大鼠随机分为、假手术组(Sham)、全脑缺血组(GI)、全脑缺血+cystamine治疗组(GI+CYS)3组,其中Sham组8只,GI组、GI+CYS组各48只大鼠。GI组和GI+CYS组,按照再灌注后6小时、12小时、1天、3天、5天和7天随机分各为6个亚组,每个亚组8只大鼠。其中GI+CYS组于双侧颈总动脉夹闭10分钟后立即给予cystamine (150mg/kg)腹腔注射,缺血时间在24小时内的只在缺血后给予一次cystamine (150mg/kg)腹腔注射,超过1天的在相应时间点各给予cystamine150mg/kg。Sham组仅暴露两侧椎动脉及颈总动脉,不予电凝及夹闭,每天给予生理盐水lml腹腔注射,于第3天处死。将GI组和GI+CYS组大鼠分别在相应时间点,经灌流固定后取脑。TUNEL染色检测再灌注后不同时间点海马CA1区的神经元凋亡水平。用原位凋亡专用试剂盒处理后,利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区TUNEL阳性细胞数。免疫组织化学方法检测缺血再灌注后不同时间点海马CA1区tTG、NPM、p53、和caspase-3表达水平的变化,利用显微镜及图像处理系统软件计数海马CA1区免疫组化阳性细胞数。蛋白质印迹分析方法检测缺血再灌注后不同时间点亚组和CYS治疗组各个时间点亚组海马tTG、NPM、p53、和caspase-3表达水平,用BioRadio半定量方法测定各因子表达情况。统计方法：本研究的所有资料均由均数的F标准差来表示(SD)。下列一一比较的资料的标准差使用单因素方差分析(ANOVA).假如发现有显着性差异,则用Tukey-Kramer多重比较法(the Tukey-Kramer multiple comparison procedure.)P<0.05被认为有显着性差异。数据用SPSS11.5软件包做统计分析。[结果]TUNEL染色：GI组海马CA1区’TUNEL阳性细胞明显增加,1天、3天、5天、7天亚组与Sham组相比有统计学差异(p<0.05)；GI+CYS组再灌注24小时后TUNEL阳性细胞有少量增加,在相应的1天、3天、5天、7天的时间点亚组,GI+CYS组的TUNEL细胞数目比GI组的明显少,具有统计学意义(p<0.05)。免疫组织化学：1.tTG, NPM和p53的表达：Sham组海马CA1区有一定数量的tTG和p53的表达；GI组与Sham组比较其12小时、1天、3天亚组的tTG和p53的表达)均明显升高,具有统计学意义(P<0.01)；GI+CYS组的tTG和p53的表达明显减弱,再灌注7天仍维持在较低水平；与GI组相比,1天、3天、5天、7天亚组tTG和p53的表达显着降低,具有统计学意义(P<0.01),12小时亚组tTG和p53的表达水平略高于GI组,计算无统计学意义(P>0.01)的表达。NPM的表达：Sham组海马CA1区有一定数量的NPM表达。GI组与Sham组比较其12小时、1天、3天亚组的NPM的表达均明显降低,具有统计学意义(P<0.01)；GI+CYS组的NPM表达明显增强,再灌注7天仍维持在较高水平；与GI组相比,1天、3天、5天、7天亚组NPM的表达显着增加,具有统计学意义(P<0.01)。2.caspase-3的表达：caspase-3蛋白在假手术组大鼠海马CA1区中极少见阳性表达；GI组caspase-3蛋白的表达于再灌注6小时可见增加,3天达高峰,7天降至接近正常水平；GI+CYS组caspase-3表达与GI组相比明显减低,但仍高于假手术组,表达变化趋势同GI组,GI+CYS组中1天、3天、5天和7天亚组与GI组相应时间点亚组相比有显着性差异(P<0.05)。蛋白质印迹分析：缺血组tTG蛋白表达在全脑缺血再灌注后6h和12h表达较弱,于全脑缺血再灌注后1d开始升高,于全脑缺血再灌注3d、5d、7d亚组显着高,与假手术组相比,3d、5d、7d时间点亚组蛋白表达升高的差异有显着性意义(P<O.05)；CYS治疗组海马tTG蛋白水平于缺血再灌注后1d开始升高,于3d、5d、7d时间点亚组亦逐渐减弱,但相应各个时间点均显着低于缺血组(p<0.05)；全脑缺血再灌注后,海马神经元NPM蛋白表达水平6小时的表达较正常对照组明显减弱,12小时NPM表达明显恢复,1天时间点恢复至与正常对照组水平,然后在3天、5天和7天保持较高的水平。CYS治疗后NPM蛋白表达水平从6小时开始升高,1 d时达到高峰,3d,5d,7d均保持较高的表达水平,CYS治疗后,治疗组各个时间点NPM的蛋白表达水平均明显高于缺血组,比较有显着差异(p<0.05)；全脑缺血再灌注后,海马神经元p53蛋白表达水平从6小时开始积聚升高,到7天时接近正常水平；CYS治疗后,治疗组各个时间点p53蛋白表达水平6 h,12h和1d时间点明显低于缺血组,比较有显着差异(p<0.05)。缺血组caspase-3蛋白表达于缺血再灌注6h即明显升高,从3的开始下降,单直至7d仍处于较高水平(P<0.05)；治疗组caspase-3蛋白水平于再灌注后6h,12h,1d、3d、5d、7d各亚组较缺血组均明显减低,相应时间点的比较有显着性差异(p<0.05)。[结论]全脑缺血再灌注损伤可以诱导核磷蛋白(NPM)表达的下调,同时导致组织型转谷氨酰胺酶(tTG)、p53和caspase-3表达上调,从而导致海马神经元的损伤,最终神经元凋亡,我们认为神经元的凋亡是与tTG, NPM, p53和caspase-3这个细胞信号传递系统有重要相关的。CYS能够抑制tTG的表达,而tTG的表达抑制导致了下游通常被抑制状态的核磷蛋白的过度表达,核磷蛋白的过度表达减少了p53在线粒体内的水平；同时核磷蛋白还直接(或间接)抑制了caspase-3的表达,这个过程可能是全脑缺血再灌注损伤后CYS保护海马神经元免于凋亡的作用机制。
魏爱宣[9]2010年在《慢性脑缺血致认知功能障碍大鼠HIF-1α及其靶基因表达与西洛他唑保护作用》文中研究指明慢性脑缺血致认知功能障碍是严重影响生活质量的疾病,随着人口老龄化,其发病率呈逐年上升趋势。迄今为止,其发病机制不完全清楚,尚无特效药物和治疗手段,因此,慢性脑缺血致认知功能障碍发病机制及其防治是神经科学研究的重点。本研究从HIF-1α及其靶基因HO-1、TH表达在慢性脑缺血致认知功能障碍中的作用及西洛他唑对其保护作用及机制进行了研究。研究首先用双侧颈总动脉永久性结扎法制备大鼠慢性脑缺血模型,利用Morris水迷宫、HE染色方法检测其行为学、组织学变化,对模型进行评价;采用免疫组化、RT-PCR和Western-blot方法检测大鼠慢性脑缺血不同时间点额叶皮层、海马HIF-1α及其靶基因HO-1、TH的表达水平变化;利用流式细胞学技术检测细胞凋亡变化,RT-PCR技术检测细胞周期调控因子CyclinD1表达,同时对慢性缺血大鼠给予西洛他唑进行干预治疗,观察上述指标变化。探讨HIF-1α及其靶基因表达在慢性脑缺血致认知功能障碍中的作用,并从细胞凋亡、细胞周期调控、HIF-1α及其靶基因HO-1、TH的表达方面探讨西洛他唑对其的保护作用机制。结果显示,慢性脑缺血大鼠学习记忆能力下降,HIF-1α及其靶基因HO-1、TH表达水平升高,HIF-1α、HO-1蛋白表达分别与大鼠学习记忆能力呈正相关;额叶皮层、海马神经细胞出现凋亡,细胞周期调控因子CyclinD1表达升高,西洛他唑干预后,大鼠学习记忆能力明显改善,HIF-1α与HO-1、TH、CyclinD1表达水平均有不同程度降低,额叶皮层、海马神经细胞凋亡细胞百分数下降。本研究表明,HIF-1α及其靶基因HO-1可能作为保护因素参与慢性脑缺血后认知功能障碍的发生发展过程;靶基因TH可能作为损害因素参与慢性脑缺血后认知功能障碍的发生发展过程。西洛他唑可能通过下调HIF-1α及其靶基因的表达、抑制细胞凋亡及细胞调控因子CyclinD1的表达发挥神经保护作用。提示HIF-1α可能成为防治慢性脑缺血致认知功能障碍新的治疗靶点,西洛他唑有望成为防治慢性脑缺血致认知功能障碍新的治疗药物,并为其临床应用提供了基础实验证据。
参考文献：
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