鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用

论文摘要

新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种严重危害禽类健康的高度接触性传染病。NDV作为一种嗜神经病毒能够导致禽类病毒性脑炎及神经紊乱,表现为头震颤、扭颈、翅爪瘫痪的临床症状及脑部血管充血、胶质细胞聚集、血管周围淋巴细胞侵润（血管套）等病理变化,其神经致病机制至今未明。本实验室前期通过基因芯片技术对NDV感染鸡脑部的差异表达基因（DEGs）进行了初步分析。本研究以基因芯片数据为基础,筛选到宿主免疫相关基因CARD11呈现上调表达,而该基因在已有的NDV感染的禽类其他组织及细胞的转录组数据中未发现差异表达。实验发现CARD11具有脑部特异性上调表达的特性,并能有效抑制NDV复制和病毒引起的细胞病理变化（CPEs）。本研究旨在解析宿主因子CARD11抑制病毒的作用机制,为揭示NDV与宿主的相互作用及其神经致病机制提供有价值的线索。具体研究内容及结果包括以下几个方面。1.鸡原代神经元细胞中CARD11对NDV复制的影响NDV强毒株F48E9可以造成在鸡原代神经元细胞（chPNCs）严重的CPEs,如轻微合胞体形成、轴突断裂、胞体分离、细胞迅速死亡,而弱毒株LaSota不能引起明显的CPEs;强弱毒株均可以在chPNCs中复制。将本实验室前期获得的NDV感染鸡脑的基因芯片数据以变化倍数大于2（FC>2）及P<0.05为标准,统计分析出强毒株F48E9感染鸡脑后特有的14个免疫相关的DEGs,qPCR验证5个DEGs的表达变化与基因芯片结果一致;在强毒株F48E9感染鸡体的13个组织中,只有CARD11在脑组织中特异性上调表达;由于CARD11蛋白在chPNCs中表达量很低,通过免疫沉淀富集（IPE）方法检测证实强毒株F48E9感染的chPNCs中CARD11蛋白同样上调表达;利用重组腺病毒实现CARD11在chPNCs中超表达,发现可抑制NDV的复制,CARD11在chPNCs中敲低后,可增加病毒的复制。结果表明CARD11能够抑制NDV在chPNCs中的复制。2.鸡原代神经元细胞中CARD11抑制NDV复制的机制CARD11激活后招募Bcl10和MALT1分子共同形成CBM信号体,继而MALT1激活下游NF-κB、JNK、mTOR信号通路。采用MALT1及NF-κB抑制剂阻断信号通路,发现NDV的复制没有变化,表明CARD11并非通过CBM信号体抑制NDV复制。那么,CARD11与病毒蛋白是否存在直接相互作用而影响病毒的复制?我们发现CARD11与NDV的P蛋白能够免疫共沉淀,且CARD11的CC1结构域与P蛋白的X结构域相互结合;进一步研究发现P蛋白X结构域也介导病毒RNP复合体中L蛋白与P蛋白的结合,而P蛋白X结构域不能介导P与NP蛋白的结合作用,故CARD11、L蛋白与P蛋白的共同结合过程中存在竞争关系;采用微型基因组（Minigenome）系统证实,该竞争性结合作用导致病毒RNA聚合酶活性受到抑制,进而降低了病毒的复制;通过对雏鸡脑内注射超表达CARD11蛋白的重组腺病毒,强毒株F48E9攻毒后发现CARD11能够减缓脑部的病理变化及抑制病毒在脑内的复制。3.鸡胚成纤维细胞中CARD11对NDV膜融合活性的影响CARD11在鸡体各组织中均有表达,那么,CARD11在鸡成纤维细胞中是否也能够被NDV诱导表达并抑制病毒复制?本部分研究以鸡胚成纤维细胞（DF-1）为模型,NDV强弱毒株的感染对DF-1细胞中CARD11 mRNA及蛋白水平的诱导上调表达不显著;DF-1细胞中CARD11可以与病毒P蛋白共定位于细胞核周围;通过慢病毒技术建立CARD11超表达及干扰的DF-1细胞系,发现CARD11能够抑制NDV的复制及合胞体的形成,甚至可抑制HN和F蛋白共转染引起的膜融合活性。CARD11如何抑制NDV诱导的膜融合活性?CARD11抑制furin蛋白酶的表达受到,进而影响F蛋白的裂解效率;利用MALT1及NF-κB抑制剂阻断信号通路,发现病毒的膜融合活性增强,细胞内furin蛋白酶的表达增加。结果表明CARD11通过激活CBM-NF-κB信号通路来抑制病毒的细胞膜融合活性。4.其他禽嗜神经病毒诱导CARD11脑特异性的上调表达禽嗜神经病毒除NDV之外还包括禽脑脊髓炎病毒（AEV）等,是否嗜神经病毒诱导CARD11脑特异性上调表达具有普遍性?本部分以嗜神经病毒AEV毒株XY/Q?1410及非神经嗜性病毒IBV分离株H09和FAdV-4分离株SXD15进行感染实验,发现CARD11只在嗜神经病毒NDV及AEV感染的鸡大脑和小脑中上调表达,而在IBV、FAdV-4感染的各组织中均为下调,并且各组织中CARD11的表达变化与各病毒载量没有必然联系。结果初步表明CARD11可以作为潜在的禽病毒性脑炎的标记分子。综上所述,本研究首次发现宿主因子CARD11可有效地抑制NDV复制和CPEs形成,其对NDV的抑制作用可能存在两种机制:（1）在神经细胞中,主要通过CARD11与病毒L蛋白竞争性结合病毒P蛋白抑制病毒RNA聚合酶活性,进而抑制病毒的复制;（2）在成纤维细胞中,主要通过CARD11参与的CBM-NF-κB信号通路降低细胞furin蛋白酶的表达,从而降低F蛋白的裂解效率抑制病毒诱导的膜融合活性,而CARD11与病毒P蛋白的相互作用同时降低了病毒的复制。本研究进一步发现其它禽嗜神经病毒也可诱导CARD11的脑部特异性上调表达,初步预示CARD11可以作为嗜神经病毒致神经损伤的标记分子。本研究为探索嗜神经病毒与中枢神经系统之间的相互作用及潜在的抗病毒靶标提供了基础依据。

论文目录

摘要

ABSTRACT

主要符号对照表

第一章文献综述

1.1 新城疫病毒的研究进展

1.1.1 NDV概述

1.1.2 NDV结构及病毒的转录与复制

1.1.3 新城疫病毒致病性

1.2 CARD11 蛋白研究进展

1.2.1 CARD11 蛋白概述

1.2.2 CBM信号体通路

1.2.3 CARD11 蛋白与疾病

1.3 本研究的目的与意义

第二章鸡原代神经元细胞中CARD11对NDV复制的影响

2.1 材料

2.1.1 SPF鸡胚、细胞、病毒、载体

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要仪器及常用试剂配制

2.2 方法

2.2.1 引物、shRNA设计

2.2.2 RT-qPCR

2.2.3 CARD11 相关表达载体的构建

2.2.4 CARD11 多克隆抗体的制备

2.2.5 CARD11 免疫沉淀富集实验

2.2.6 重组腺病毒包装及纯化

2.2.7 病毒感染实验

2.2.8 细胞免疫荧光实验

2.2.9 数据统计分析

2.3 结果

2.3.1 CARD11在NDV感染鸡脑中特异性显著上调表达

2.3.2 NDV在 chPNCs中的感染与复制

2.3.3 CARD11 真核表达载体的构建

2.3.4 CARD11 多克隆抗体的制备

2.3.5 NDV诱导chPNCs中 CARD11 的上调表达

2.3.6 chPNCs中实现外源蛋白表达的方法筛选

2.3.7 rAdVs的制备

2.3.8 rAdVs在 chPNCs中的感染效率

2.3.9 CARD11 抑制NDV的复制

2.4 讨论

2.5 小结

第三章鸡原代神经细胞中CARD11 抑制NDV复制机制的研究

3.1 材料

3.1.1 动物、细胞、病毒、质粒

3.1.2 主要试剂

3.1.3 主要仪器及常用试剂配制

3.2 方法

3.2.1 引物设计

3.2.2 真核表达载体的构建

3.2.3 抑制剂处理实验

3.2.4 鸡NF-κB双萤光素报告基因检测系统的建立

3.2.5 病毒感染实验

3.2.6 免疫共沉淀实验

3.2.7 IFA实验

3.2.8 NDV微基因组检测

3.2.9 动物实验

3.2.10 数据统计分析

3.3 结果

3.3.1 各真核表达载体的鉴定

3.3.2 CBM信号体对NDV复制的影响

3.3.3 chPNCs内源性CARD11与NDV蛋白相互作用

3.3.4 CARD11的CC1 结构域与NDV P蛋白的X结构域相互作用

3.3.5 NDV NP、L蛋白与P蛋白的相互作用

3.3.6 CARD11 蛋白与NDV L蛋白竞争性结合NDV P蛋白

3.3.7 CARD11 抑制病毒RNA聚合酶活性

3.3.8 脑内过表达CARD11对NDV在脑内复制的影响

3.4 讨论

3.5 小结

第四章鸡胚成纤维细胞中CARD11对NDV膜融合活性的影响

4.1 材料

4.1.1 细胞、质粒、病毒

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器及常用试剂配制

4.2 方法

4.2.1 引物设计

4.2.2 NDV感染实验

4.2.3 RT-qPCR

4.2.4 重组慢病毒的获得

4.2.5 细胞系的建立

4.2.6 Western blot

4.2.7 IFA实验

4.2.8 抑制剂处理实验

4.2.9 细胞凋亡检测

4.2.10 细胞膜融合活性的定性及定量分析

4.2.11 蚀斑实验

4.2.12 数据统计分析

4.3 结果

4.3.1 F48E9 NP基因标准曲线的建立

4.3.2 NDV诱导DF-1中CARD11 的上调表达不显著

4.3.3 HN蛋白诱导DF-1 细胞中CARD11 的上调表达

4.3.4 DF-1 细胞中CARD11 抑制NDV的复制

4.3.5 DF-1 细胞中CARD11 蛋白可与NDV P蛋白共定位

4.3.6 CARD11 降低NDV的细胞膜融合活性

4.3.7 CARD11 抑制细胞内furin蛋白酶的表达

4.3.8 CBM-NF-κB信号通路的活化抑制了NDV膜融合活性

4.3.9 CBM-NF-κB信号通路的活化抑制胞内furin的表达

4.4 讨论

4.5 小结

第五章其他禽嗜神经病毒对CARD11 表达的影响

5.1 材料

5.1.1 动物、细胞、病毒

5.1.2 主要试剂

5.1.3 主要仪器及常用试剂配制

5.2 方法

5.2.1 引物设计

5.2.2 组织总RNA提取及c DNA合成

5.2.3 绝对荧光定量CARD11 基因标准曲线的建立

5.2.4 正常鸡体中不同组织CARD11 基因的表达量测定

5.2.5 动物攻毒实验

5.2.6 病毒感染鸡体中CARD11 mRNA的相对表达变化

5.2.7 NDV滴度测定

5.2.8 NDV、AEV、IBV、FAdV-4 病毒基因组拷贝数测定

5.2.9 数据统计分析

5.3 结果

5.3.1 CARD11 基因标准曲线的建立

5.3.2 正常鸡不同组织中CARD11 基因含量

5.3.3 NDV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系

5.3.4 AEV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系

5.3.5 IBV组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系

5.3.6 FAdV-4 组织病毒载量与CARD11 mRNA表达变化的关系

5.4 讨论

5.5 小结

全文总结

本研究创新点

参考文献

附录

致谢

个人简历

文章来源

类型: 博士论文

作者: 王文彬

导师: 萧飒

关键词: 新城疫病毒,复合物,嗜神经病毒,竞争性结合

来源: 西北农林科技大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 西北农林科技大学

基金: 国家自然科学基金项目(编号:31572533)

分类号: S852.65

DOI: 10.27409/d.cnki.gxbnu.2019.000062

总页数: 142

文件大小: 10527K

下载量: 141

鸡CARD11蛋白对新城疫病毒的抑制作用

论文摘要

论文目录

文章来源

相关论文文献

猜你喜欢