李涛[1]2004年在《天然类胡萝卜素（叶黄素）的分离纯化及分子修饰》文中研究指明本课题探索出一种简易分光光度法测定万寿菊中叶黄素及浸膏中叶黄素的含量,与其他现有方法(HPLC,AOAC)相比,具有操作快速简便(单样检测时间大约缩短1/3—1/2)、溶剂耗量小、检测成本低、环境污染小(节省溶剂约1/2)、精确度高的特点,适用于万寿菊及其粗、精加工产品中叶黄素的检测。 本课题以万寿菊提取浸膏为原料,设计出一种分离纯化工艺,得到高纯度叶黄素。最后得到的产品经过红外、紫外、核磁氢谱、核磁碳谱确定为高纯度的叶黄素,并且通过HPLC定性和定量检测,产品的纯度达到80%以上,产率能够达到70%以上。且该叶黄素分离纯化工艺适于在工业生产中实现。 本课题还设计了叶黄素向玉米黄素转化的工艺,得到最佳转化反应条件,且得到较高的转化率(从原来的5%提高到近40%)。工艺简单,易于应用于生产,产业化推广。 本课题还在玉米黄素分子修饰制得生物效价极高的虾青素分子方面做了探索。从而增加了虾青素的一种新来源,而且这是一种由天然色素分子化合物经过分子修饰制取的来源,克服了国内外文献报道的几种来源中存在的过程复杂、成本高的缺点,适于工业化的实现,有很好的应用前景。
汪廷彩[2]2004年在《南瓜黄色素中叶黄素的纯化及特性研究》文中认为南瓜(Cucurbiat moschata Duch)，为葫芦科南瓜属植物的果实，栽培简单，产量高，易于贮运，而且营养丰富，深受人们的喜爱。本研究以我国主要栽培种的黄狼南瓜品种为原料，从其粉体中提出天然食用黄色素，对其组分分析，结果发现南瓜黄色素中主要含有叁种类胡萝卜素：叶黄素、β-胡萝卜素和α-胡萝卜素。叶黄素对老年性黄斑变性病(AND)具有良好的预防作用，通过过滤蓝光和清除自由基而对眼睛具有良好的保护作用，有研究还显示，叶黄素对白内障和癌症都有预防作用。本研究目的在于寻找南瓜黄色素的最佳提取工艺，而后从所制备的南瓜黄色素粗品中分离纯化出叶黄素，并初步探讨其清除羟自由基和抑制猪油自氧化的能力，为南瓜综合利用提供可靠的理论依据。本研究的主要结果如下： 首先对苯、氯仿、二氯甲烷、环己烷、石油醚、乙醚、丙酮、四氢呋哺、乙醇九种溶剂的提取效果进行对比实验，其效果依次为：四氢呋喃＞氯仿＞二氯甲烷＞乙醇＞乙醚＞苯＞石油醚＞环己烷＞丙酮，而后对混合溶剂优选，结果以四氢呋喃-乙醇的提取效果最佳，最后经过正交实验，结果显示以四氢呋喃-乙醇(3：1)为提取溶剂，温度为20℃，料液比为1：5，超声波辅助提取40min连续提取五次为最佳提取工艺，得到的南瓜黄色素的提取率为4.94％。 对南瓜色素皂化品进行组分分析，HPLC条件为Waters 510泵，20μl微量进样器，Waters996检测器，Millenium色谱数据分析系统，大连依利特科学仪器有限公司提供的C_(18)色谱柱(150mm×4.6mm，5 μm)，流动相为甲醇-二氯甲烷-乙腈-水(38：32：29：1，V／V)，检测波长450nm，流速0.6ml／min，结果发现其中主要含有叁种成分：叶黄素、β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，其中叶黄素含量为27.364mg／g，β-胡萝卜素的含量为6.802mg／g。利用叶黄素与胡萝卜素存在结构上的差异以及在正己烷中的溶解度的差异，对南瓜色素中的叶黄素进行分离纯化，由HPLC分析结果显示，叶黄素纯化后得率为80.5～86.3％，纯度为90.5～94.6％。 对南瓜色素的理化特性进行研究表明，该色素对大多数金属离子是稳定的，但叁价的铁离子会使该色素遭到破坏，当有Ba~(2+)存在时会产生不明沉淀，此外，该色素对pH和防腐剂都比较稳定，温度在不超过100’C时对色素的破坏作用也不大，但高温处理则使其组分分解，南瓜色素对光照十分敏感。分光光度法测得皂化品中总类胡萝卜素含量为29.22%，粗品中含量为5.07%。 采用抗坏血酸一CuZ十一H八一酵母体系产生的经自由基为体外模型，对制备产品清除轻自由基的能力进行研究，结果发现南瓜黄色素的皂化品和纯化碑能有效清除轻自由基，最佳的浓度为0.Zmg/m1。在猪油自氧化实验中，在低浓度范围(<0.2%)南瓜色素同样表现出了良好的抑制作用，而且在不超过VC浓度的时候与VC具有良好的协同抗氧化作用。· 综上所述，南瓜黄色素为天然类胡萝卜素，从南瓜中提取南瓜黄色素为其综合利用提供了一条有效的途径，尤其从中制备分离出叶黄素开发高档产品提供了良好的理论依据。
鹿林[3]2007年在《自天然叶黄素酯制取虾青素的实验研究》文中研究指明本课题研究了以广泛种植的万寿菊花提取物为底物，通过化学修饰和分子改造的技术手段，制取附加值更高的功能性产品—虾青素的生产工艺技术。该工艺技术主要包括：叶黄素酯的一步法制取玉米黄素和玉米黄素通过溴化、水解、氧化等环节制取虾青素，还包括组分的分离纯化，分析检测，结构鉴定，工艺参数优化和工艺装置的设计。实验研究了如何通过化学反应，把叶黄素酯通过一步法制取玉米黄素并通过分离纯化得到高含量玉米黄素的生产工艺。叶黄素酯与醇碱溶液和乳化剂混合，惰性环境下高温反应16h。通过HPLC分析，该反应转化率达到70％以上。反应后对产物进行分离提纯，得到高纯度游离态玉米黄素。高效液相色谱法进行定性、定量检测，产品中玉米黄素的含量由反应初始浓度的0.8％变为反应终止浓度的40％。同时建立了叶黄素酯一步法制取玉米黄素的反应动力学模型。结果表明，在碱远远过量的情况下，可以将该反应近似看作一级反应。100℃下，100g叶黄素酯溶于100 ml丙二醇，在30g碱作用下进行水解，反应中玉米黄素的质量与反应时间之间关系的表达式为：M_(zeaxanthin)=11.35*[1-exp(-0.15124t)]式中：t为反应时间，hM_(zeaxanthin)为时间t时水解液中游离叶黄素的质量，g实验研究了由高纯度游离态玉米黄素溴化、水解、氧化生成虾青素的生产工艺。玉米黄素与氧化剂水溶液混匀，加入卤化剂。惰性环境下反应4～6h。反应后萃取分离纯化。高效液相色谱和质谱法进行定性、定量检测。反应最终生成虾青素，含量达到20％。
申利英[4]2009年在《高纯度叶黄素的制备及其衍生物的合成》文中认为叶黄素是一种优良天然色素,其所具有的良好抗氧化性能,日益受到人们青睐,但在国内高纯度叶黄素制备仍然是一个空缺。本课题主要研究了高纯度叶黄素制备、油酸叶黄素酯的合成和叶黄素、油酸叶黄素酯的抗氧化研究。万寿菊是富含叶黄素类物质的天然原料,非常适合作为提取叶黄素的原料,作者对万寿菊颗粒耐高温、光照、酸、碱性能做研究,旨在为万寿菊颗粒储存提供依据。利用超声波的空化作用、热效应、机械作用加速细胞壁的破碎,促使细胞内叶黄素的溶出,以提高含量,缩短提取时间。并采用STATISTICA6.0软件,根据中心复合旋转设计(central composite rotatable design,CCRD),考察提取时间、提取温度、料液比对提取率的影响,从响应曲面上得出超声波提取叶黄素的最优工艺条件:提取温度:30℃,提取时间:50min,料液比:1:4。叶黄素在植物体中主要是以酯衍生物的形式存在,所以要经过皂化处理,将叶黄素还原为单体形式。本研究利用超声波产生的‘空化效应'和机械作用,加快皂化时间,降低皂化温度。采用薄层层析,考察皂化时间、皂化温度、加碱量及加碱次序对皂化率的影响,得出超声皂化最佳工艺条件:用碱量(10%KOH-甲醇溶液)24 ml,加碱次序:0—60分钟每5分钟加入0.67ml,60—150分钟每5分钟加0.8ml,150—190分钟每10分钟加0.9ml,190—210分钟无碱加入,超声温度:40℃,超声时间:120分钟。利用重结晶法对叶黄素的分离纯化工艺进行了研究,采用浸膏(g):四氢呋喃(ml):无水乙醇(ml):石油醚(ml):水(ml)=1:20:15:5:20混合溶剂对叶黄素进行第一次重结晶,并用丙酮+水+石油醚混合溶剂进行第二次重结晶,依次进行四次重结晶可以从纯度低的叶黄素(40%)得到高纯度叶黄素(88%)。采用直接酯化法,合成油酸叶黄素酯,体外提高叶黄素稳定性,体内分解为叶黄素和油酸,同时满足人们对叶黄素和油酸需求,通过NMR~1H、NMR~(13)C、MS、IR检测表明合成成功。作者也对甘氨酸叶黄素的合成进行研究,但在脱氨基保护剂过程中,由于在高温环境下叶黄素发生异构化导致实验失败。从清除羟自由基、DPPH自由基能力方面研究了油酸叶黄素双酯、叶黄素、油酸叶黄素单酯的体外抗氧化活性,并与抗氧化剂BHT进行比较。结果表明,叶黄素、油酸叶黄素单酯、油酸叶黄素双酯对DPPH自由基、羟自由基都有一定的清除作用,其清除能力大小为:BHT＞叶黄素＞油酸叶黄素单酯＞油酸叶黄素双酯。该结论论证了类胡萝卜素抗氧化性与共扼双键有关,并随羟基数增多,其抗氧化性能增强。
陈龙胜[5]2005年在《金盏菊提取物化学转化和生物转化法制备叶黄素的研究》文中提出本论文以水解金盏菊提取物中叶黄素酯从而得到游离态叶黄素为研究对象,主要包括以下六个方面。 (1)国内外关于叶黄素方面的研究进展。 查阅国内外近二十年来关于叶黄素和叶黄素酯的相关文献,对其分析、提取、分离、转化工作进行了归纳和总结。 (2)建立了同时测定叶黄素和叶黄素酯的HPLC法。 建立了一种高效液相色谱法同时测定金盏菊中叶黄素和叶黄素含量的方法。采用KNAUER Eurospher-100 C18(3.9×300mm,4.6μm)色谱柱,以乙腈-甲醇-乙酸乙酯混合液为流动相(v/v/v 55:1:44),流速1.0mL/min;检测波长460nm;柱温:25℃。 (3)建了化学法转化叶黄素酯为游离态叶黄素的工艺。 考察了皂化工艺中溶剂类型、KOH浓度、反应时间、反应温度和反应底物比例对皂化结果的影响,最佳皂化工艺为:将10.0克叶黄素酯加入50mL饱和KOH甲醇溶液,在室温下(25℃)下反应4h。 (4)建立了叶黄素分离纯化工艺 叶黄素最佳纯化工艺为:将皂化液的滤渣水洗的最佳条件为5℃,冷水洗涤至流出液呈中性,过滤,干燥即可获得纯度大于22.0%的叶黄素产品;将水洗后滤渣,用40mL5℃正己烷分两次洗涤,再在常温下溶于二氯甲烷中制得饱和溶液,向饱和溶液中滴加正己烷至出现浑浊,放入冰箱于5℃静置过夜,再滴加二氯甲烷0.4倍正己烷静置过夜,过滤后即得到纯度大于>90.0%的叶黄素产品。 (4)叶黄素酯生物转化法的菌种筛选。 用平板诱导培养基考察了糙皮侧耳、黑曲酶、青霉对叶黄素酯的降解作用,发现接种青霉和黑曲酶孢子均能将培养基中叶黄素酯转化为游离态叶黄素,青霉的转化效果优于黑曲霉;糙皮侧耳孢子在培养基上不能生长,但接种菌种后亦能将培养基中叶黄素酯转化为游离态叶黄素。 (5)青霉摇瓶发酵法转化初步研究 用青霉摇瓶发酵转化叶黄素酯法制备叶黄素,考察了pH值、接
刘良忠[6]2004年在《天然红心蛋中红色类胡萝卜素的结构表征及其生物活性评价》文中提出天然红心蛋产自湖区蛋鸭，其蛋黄光泽红艳，红色色度可达RYCF(Roche Yolk Color Fan)值15以上，在国内外市场上深受消费者喜爱。天然红心蛋的生产与湖区蛋鸭摄食一种季节性生长的天然水生植物——菹草(Potamogeton crispus L．)有重要关系。根据本实验室研究发现，这种类胡萝卜素不仅赋予蛋黄艳丽的红色，而且还具有非常特殊的抗癌活性，因此天然红心蛋红色类胡萝卜素及其原产资源的研究具有重要的学术意义和应用前景。目前有关天然红心蛋中红色类胡萝卜素的组成、结构、性质和生物来源及其抗癌活性评价等系列研究均未见报道。 本论文首次采用色谱、HPLC／MS／MS及高分辨质谱等现代仪器手段对天然红心蛋中红色类胡萝卜素成分及其来源进行了结构分析和鉴定；并采用分子生物学前沿技术从细胞凋亡角度探讨了天然红心蛋中红色类胡萝卜素提取物的抗癌生物活性等。 主要研究内容如下： 1 天然红心蛋红色类胡萝卜素的分离纯化 1．1 总类胡萝卜素的提取 从红心蛋黄冻干粉中提取总类胡萝卜素的最优提取条件： 溶剂：石油醚-丙酮=2∶1(v／v)；料液比：1∶4(w／v)；温度40℃，提取3次，每次60min。 每100克普通干蛋黄粉中含总类胡萝卜素的含量为4.5毫克； 每100克干红心蛋黄粉(色度15度及以上)总类胡萝卜素的含量为9.25毫克。 1．2 天然红心蛋红色类胡萝卜素的分离纯化 材料：总类胡萝卜素提取物。 采用氧化镁(MgO∶硅藻土=1∶2w／w)柱或硅胶柱脱去类胡萝卜素提取物中的脂类成分； 在制备硅胶薄层色谱上，采用展层剂A(石油醚-丙酮=17：4 v／v)或展层剂B天然红心蛋中红色类胡萝卜素的结构表征及其生物活性评价(石油醚一丙酮一甲醉二8:2:1 v/v/v),可从柱层析脱脂类胡萝卜素部分分离出一条红色素色谱带R; 采用展层剂C(正己烷一乙酸乙酷一丙酮一甲醇二27:4:2:2 v/v/v/v),可从柱层析脱脂色素部分分离出叁条红色素色谱带R1、R2、R3。 将展开的红色谱带R和R1、R2、R3部分,用石油醚一丙酮(2:1 v/v)洗脱,进一步分离制备得到各个红色素色谱带的分离纯化组分即红色类胡萝卜素R和红色类胡萝卜素RI、RZ、R3组分。1 .3类胡萝卜素提取物的稳定性 天然红心鸭蛋类胡萝卜素提取物在避光、惰性气体及80℃以下的温度条件下是稳定的,但在处理条件下容易发生顺反异构化作用(trans一ci 5 isomerism);对金属离子K’、Na‘、Ca”、Mg++、Cu++、Zn++、Fe+++、Al+++不稳定;对二价铁离子Fe++、光线等极不稳定;常用抗氧化剂VC、VE、BHT等对总类胡萝卜素提取物有很好的保护作用。2天然红心蛋红色类胡萝卜素R的初步鉴定 通过定性化学分类反应表明红色素R为多烯类色素,分子中不存在环氧结构。皂化前后红色素在薄层上的位置及最大吸光值没有变化,表明红色物质不存在酷键结构部分。 红外光谱特性表明红色素R为含有拨基,不含轻基的类胡萝卜素。 UV一VIS及与硼氢化钠反应特性表明,红色类胡萝卜素R分子中存在与双键共扼的拨基。3天然红心蛋红色类胡萝I、素Rl,RZ,R3组分的HPLO-MS一MS鉴定及顺反异构体的发现 红色类胡萝卜素Rl、R2、R3组分具有与红色类胡萝卜素R相同的化学反应特性。 RAD扫描光谱结果显示:红色类胡萝卜素Rl、R2、R3组分分子中均存在与双键呈共辘状态的拨基。红色类胡萝卜素Rl、R2、R3组分的HPLC一MS一MS鉴定结果表明这叁者均是分子量为562的类胡萝卜素,它们均存在顺反异构现象,在存放过程中这叁者可互相转变,最后以动态平衡方式存在。刘良忠华中农业大学20()4届博士学位论文4天然红心蛋红色类胡萝卜素的生物来源分析及HPLC一MS一Ms鉴定 天然红心蛋红色类胡萝卜素R与范草红色类胡萝卜素、紫杉紫素的HPLc有很好的对应关系。叁种来源的红色类胡萝卜素具有相同的与硼氢化钠反应性质。采用Agilent 1100series LC/M SD Trap设备,5腼,25emX4.6nnn,ODSC,。色谱柱,18℃柱温,0.smL/min流速,进样量5协L,甲醇一梅ter(99.5:0.5 v/v)为流动相,检测波长480njrn,天然红心蛋红色类胡萝卜素R、范草红色类胡萝卜素与紫杉紫素在该条件下都被分成五个峰,且叁种来源的红色类胡萝卜素的各个峰之间具有很好的对应关系。一级质谱结果表明:天然红心蛋红色类胡萝卜素R、殖草红色类胡萝卜素与紫杉紫素具有相同的分子量,都为562。二级质谱结果表明,叁个来源的红色类胡萝卜素的液相色谱的对应峰具有基本相同的二级质谱,都有几个主要的碎片而z峰,包括545[M+H一15]+,507[M+H一56]+,479[M干H一54]+,425[M+H·1 35]+,373[M+H一190〕+,359[M艰一204]+,347[M爪·216〕’等.表明天然红心蛋红色类胡萝 卜素、范草红色类胡萝卜素与紫杉紫素具有相同的组成和基本结构。5天然红心蛋红色类胡萝卜素R与殖草红色类胡萝卜素的高分辨质谱分析 天然红心蛋红色类胡萝卜素R和范草红色类胡萝卜素的高分辨质谱分析得出最可能的组成分子式为C4oHS。仇,计算分子量为562.38108。进一步确证了天然红心蛋红色类胡萝卜素R和范草红色类胡萝卜素与紫杉紫素具有相同的组成。二级质谱碎片模拟裂解分析符合紫杉紫素的裂解规律。 结果表?
邱涛涛, 黄明发, 陈颜虹, 王华[7]2008年在《玉米黄素提取及应用研究进展》文中研究指明玉米黄素是一种天然类胡萝卜素。大量研究表明,它具有预防老年性黄斑病变、白内障、心血管疾病以及抗癌等功效,和人类健康密切相关。文章综述了玉米黄素的性质、提取方法、生理功能以及在食品方面的应用,并对其应用前景进行了展望。
孙培培[8]2018年在《微藻中抗糖基化活性成分的筛选、纯化以及抗神经炎症的研究》文中研究表明随着人类寿命的延长,人口老龄化的加剧,神经退行性疾病尤其是阿尔兹海默症已经成为威胁人们健康和寿命的重大问题。探索具有预防阿尔兹海默症功能的营养成分并揭示其作用机制是当前食品科学领域的研究热点之一,特别是发掘对与阿尔兹海默症发生发展重要相关的蛋白质糖基化和神经炎症具有干预作用的食品成分,通过饮食预防已经成为人们保持健康的有效手段之一。微藻富有多种生物活性成分,这也使得其具有抗氧化、抗炎、抗肥胖等多种生理调节功能,是重要的食品和功能成分的天然来源。然而,关于微藻抗糖基化和抗神经炎症的作用鲜有报道。鉴于此,本论文通过体外模型系统评估了9株不同微藻的不同极性提取物抗晚期糖基化终产物(AGEs)形成的能力,筛选出具有显着抑制AGEs形成的微藻提取物,并建立了提取物中关键类胡萝卜素的分析方法;首次在微藻Nitzschia laevis中发现岩藻黄醇和岩藻黄素的大量存在,通过相关性分析和标准品验证,确定了其提取物中发挥抗糖基化作用的关键成分为岩藻黄醇和岩藻黄素;然后,在光自养、异养和混养模式下,构建了N.laevis的细胞生长、岩藻黄醇和岩藻黄素的生成和培养基基质消耗的非线性动力学模型,获得规模化生产岩藻黄醇和岩藻黄素的最佳培养工艺,并通过固相萃取和快速硅胶柱层析结合薄层色谱层析的方法分离纯化岩藻黄醇和岩藻黄素;此外,我们通过考察岩藻黄醇和岩藻黄素对自由基、活性羰基化合物的清除效果以及抑制自由基诱导的蛋白质氧化损伤程度,探究它们的抗糖基化机制;最后本文从细胞水平上研究了岩藻黄醇和岩藻黄素对神经炎症的影响。本研究结果为岩藻黄醇和岩藻黄素对于阿尔兹海默症的干预研究奠定了理论基础,同时为微藻功能性成分的开发提供了新思路。本论文的主要研究结果如下:(1)体外牛血清白蛋白-葡萄糖和牛血清白蛋白-甲基乙二醛模型筛选结果表明,5株海洋藻株的丙酮水提取物对于抑制AGEs形成的抑制能力显着优于其他藻株,并且呈浓度依赖关系。初步分析判断这些提取物中的有效成分是类胡萝卜素。(2)为研究所筛选出的5株海洋微藻提取物的类胡萝卜素组成,确定关键抗AGEs形成的化合物成分,建立了类胡萝卜素的HPLC-PDA和UPLC-PDA-IMS-TOFMS分离鉴定方法,并对其关键组分岩藻黄醇和岩藻黄素进行定性定量分析。结果表明,经方法学论证,所建立的方法灵敏、稳定、可靠,满足对岩藻黄醇和岩藻黄素的定性定量要求。通过相关性分析和标准品的体外抗AGEs形成的研究,发现岩藻黄醇和岩藻黄素均具有抑制AGEs形成的活性。(3)基于岩藻黄醇在微藻中的首次发现,并且未有硅藻N.laevis同时积累岩藻黄醇和岩藻黄素的报道,为研究高密度培养N.laevis大规模生产岩藻黄醇和岩藻黄素,通过动力学模型探究了N.laevis在不同培养方式中的生长以及积累岩藻黄醇和岩藻黄素的规律。研究表明,构建的N.laveis生长动力学、产物生成动力学和底物消耗动力学模型能很好地拟合叁种模式下所得的实验数据。此外,混养培养方式更适合这两个代谢物的积累,且葡萄糖和硝酸钠的消耗影响它们的含量提高。(4)为获得高纯度岩藻黄醇和岩藻黄素,以便探究它们的抗糖基化和抗神经炎症活性,以N.laevis的岩藻黄醇和岩藻黄素提取物为研究对象,优化提取方法,建立分离纯化的方法,结果表明经过柱层析和薄层层析分离纯化后,可以同时获得98%纯度的岩藻黄醇和岩藻黄素。(5)为研究纯化的岩藻黄醇和岩藻黄素抑制AGEs形成的机制,考察了它们清除自由基的能力、捕获活性二羰基化合物的能力以及对自由基诱导的蛋白质氧化、羰基化的抑制作用。结果表明,岩藻黄醇和岩藻黄素均具有一定的自由基和活性二羰基清除能力,且具有显着的抑制自由基诱导的蛋白质氧化降解和羰基化的作用,从而发挥抑制AGEs形成的作用。(6)为研究纯化的岩藻黄醇和岩藻黄素对神经炎症的影响,以BV2小胶质细胞为研究对象,探讨它们对LPS诱导的小胶质细胞炎症反应的干预作用。结果表明,岩藻黄醇和岩藻黄素能够显着抑制LPS诱导的BV2小胶质细胞内ROS的生成及炎症相关因子IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2和iNOS的mRNA表达。此外,岩藻黄醇和岩藻黄素还能在蛋白水平显着降低LPS诱导的BV2细胞COX-2蛋白的过度表达,从而干预了LPS诱导的BV2小胶质细胞的炎症反应。
吴正云[9]2006年在《小球藻异养培养的动力学分析与优化》文中研究表明I小球藻(Chlorella)是一种单细胞微藻,含有丰富的蛋白质、类胡萝卜素、多糖、维生素和小球藻生长因子等多种营养及活性成份,具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力和预防心血管疾病等生理功能。由于富含叶黄素(lutein),小球藻作为一种极具潜力的叶黄素源而受到关注。与其它叶黄素源相比,小球藻具有生长迅速、可进行异养培养等优势。但迄今为止,小球藻的异养培养效率和水平与其它微生物(如酵母等)培养体系相比还有很大的差距。为建立高效的小球藻异养培养系统及叶黄素生产方式,本论文进行了以下方面的研究工作:(1)通过摇瓶实验对影响小球藻异养生长和叶黄素合成的主要培养参数,包括接种量、通气量及培养基中四种主要成分——葡萄糖、KNO3、KH2PO4和MgSO4的浓度进行了研究和优化,并在均匀设计实验的基础上建立了多元回归模型。研究结果表明,充足的通气量是小球藻生长和叶黄素合成的必要条件;葡萄糖浓度和C: N比是影响小球藻异养生长和叶黄素合成的主要因素,在10-60 g/l范围内,较高的葡萄糖起始浓度可提高小球藻的最终生物量和叶黄素产量,但抑制小球藻的生长速度;在2: 1-12: 1范围内,较低的C: N比有利于提高小球藻细胞中叶黄素含量。(2)在对小球藻异养生长进行动力学分析的基础上,通过流加方式的优化实现了小球藻的高密度培养。首先基于在19-l发酵罐中进行的分批培养实验,构建了描述小球藻异养生长的确定化模型(deterministic model),在该模型的基础上通过采用遗传算法进行了流加方式的初步优化,使小球藻的细胞浓度(以单位体积干重计)和最大生产效率分别达到104.9 g/l和0.613 g/l/h。在进行多批流加培养实验的基础上,构建了推
裴迎新[10]2007年在《苹果提取物与叶黄素对食管癌细胞的抗癌活性及标志物筛选》文中研究表明背景和目的食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。对食管癌和其它癌症寻求预防和治疗途径，减少癌症对人类健康的威胁是一项重要的工作。植物化学物为植物性食品中天然存在、含量较少的一类具有抗氧化、抗癌、减少脂质过氧化和降低胆固醇等生理活性的化学物质。寻找植物中抗癌成份进行食管癌的预防及治疗具有十分重要的意义。流行病学研究表明蔬菜水果的消费与降低心血管疾病以及某些癌症的危险有关。水果和蔬菜中的植物化学物尤其是酚类作为主要的生物活性物质，在对健康的保护方面起着重要作用。类黄酮属于多酚类化合物家族，广泛存在于水果、蔬菜、茶叶等各类植物之中，具有较强的抗氧化、抗过敏、消炎、抑菌、抑制肿瘤生长等作用。近年来一些调查结果表明，人类每天从膳食中摄入相当数量的类黄酮，其摄入量甚至超过了一些微量营养素。苹果中富含植物化学物如类黄酮及多酚类，实验室研究显示苹果提取物具有很强的抗氧化活性，可以减少脂质过氧化，降低胆固醇以及抑制结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞的生长，动物实验研究表明苹果提取物可以预防乳腺肿瘤的发生。虽然流行病学研究结果提示苹果的消费与降低肿瘤的危险性有关，一些体外和动物体内实验结果表明苹果提取物对某些肿瘤具有抑制作用，但对其复杂多样的作用机制还不甚了解，需进行深入的研究加以阐明。叶黄素(lutein)属于类胡萝卜素，流行病学研究表明，在预防视黄斑退化、肿瘤的发生与发展、心血管疾病和增强机体免疫力等方面有着广泛的生物学活性。水果蔬菜中天然存在的植物化合物的联合作用在抗氧化以及肿瘤预防方面至关重要。通过苹果中类黄酮物质含量的检测以及探讨苹果提取物和叶黄素抗肿瘤细胞增殖、诱导凋亡，以及作用于肿瘤细胞后在基因和蛋白水平发生的变化，对于揭示水果蔬菜预防肿瘤的作用机制以及开发研制复合型保健品具有重要的理论和实际意义。由于食管癌是严重危害人体健康的恶性肿瘤，寻找对其干预和治疗的措施非常重要。流行病学研究表明蔬菜和水果的消费与肿瘤发病呈负相关，但其作用机制尚未阐明。苹果中含有丰富的类黄酮，为了解苹果中类黄酮的含量水平、苹果提取物和叶黄素的抗肿瘤效应以及作用机制，以期为食管癌的膳食预防和肿瘤的辅助治疗提供参考。本课题选用苹果提取物和叶黄素作为处理因素，利用食管癌细胞建造体外模型，采用MTT法、流式细胞仪、免疫组织化学、western blot、DDRT-PCR和蛋白质组学等技术，从苹果提取物含量化学分析入手，以细胞增殖和凋亡事件为切入点，对细胞周期，凋亡诱导，差异基因乃至差异蛋白表达情况进行系统的研究，对苹果提取物和叶黄素抗食管癌作用及其机制进行深入探讨，同时筛选其作用的靶分子，为食管癌的预防及低毒抗癌药物的研制提供理论依据。方法全文共分五个部分，主要研究方法及内容如下：第一部分苹果提取物的制备和检测。采用溶剂提取法从苹果样本中提取可溶性黄酮类物质制备苹果提取物，铝离子显色法检测其中的总黄酮含量。第二部分苹果提取物与叶黄素对食管癌细胞周期和分化的影响。用不同浓度的苹果提取物和叶黄素处理EC9706细胞，采用MTT法，观察对细胞增殖抑制的影响。流式细胞术检测细胞周期分布，免疫组织化学的方法检测周期调节蛋白cyclin D1表达情况。第叁部分苹果提取物与叶黄素对食管癌细胞凋亡的影响。用不同浓度的苹果提取物和叶黄素处理EC9706细胞，采用流式细胞术和原位细胞凋亡检测技术，观察对细胞凋亡的影响，免疫组织化学方法和Western印迹杂交技术检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达情况。第四部分苹果提取物对食管癌细胞作用的差异基因表达。采用荧光标记mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)对处理组和对照组差异基因表达谱进行比较，筛选差异表达基因并进行克隆与测序鉴定。以探讨苹果提取物对食管癌细胞作用后基因水平的分子变化。第五部分蛋白质组学方法筛选标志物。以苹果提取物作用于体外培养的人食管癌EC9706细胞为模型，采用双向凝胶电泳和质谱技术筛选作用后在食管癌细胞中表达的差异蛋白质，旨在为阐明苹果提取物对食管癌细胞的作用及其抗癌的分子机制，以及为进一步探讨肿瘤治疗标志物提供依据。结果1．对9种新鲜水果提取物总黄酮检测表明，总黄酮的含量范围为40.11mg／100g～122.88mg／100g。由高到低依次为：红富士苹果、沙梨、黄金梨、香梨、丰水梨、红橙、砀山梨、水晶梨和猕猴桃。2．在体外实验条件下苹果提取物和叶黄素均显示出抑制食管癌EC9706细胞增殖的作用。苹果提取物通过抑制细胞DNA合成，降低了细胞周期中S期百分率，使细胞停滞于G_2／M期，叶黄素则使细胞停滞于G_0／G_1期，并抑制了Cyclin D1的表达。叶黄素作用后使食管癌增殖型细胞减少，分化型细胞增多，诱导了良性分化。3．苹果提取物和叶黄素均可诱导EC9706细胞凋亡，同步分析凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达结果显示，苹果提取物和叶黄素可下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达及上调促凋亡蛋白Bax的表达。4．采用DDRT-PCR技术对苹果提取物作用于食管癌细胞后的差异表达基因进行检测，获得了差异表达指纹图谱，经克隆和测序获得了差异表达片段的基因序列。这些差异表达的基因序列主要涉及SET结构域和PDZ结构域、细胞周期生长调节、参与细胞有丝分裂的肿瘤蛋白D52以及与肿瘤发生有关的甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱ。5．采用蛋白质组学技术检测苹果提取物作用后的差异表达蛋白，获得了差异表达蛋白的双向凝胶电泳图谱，用基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MOLDI-TOF-MS)鉴定了18个差异蛋白的肽指纹图谱，经数据库检索匹配，筛选出了一些相关蛋白，分析发现这些蛋白功能涉及细胞代谢、信号转导、细胞骨架组成、氧化应激、免疫、细胞增殖和凋亡以及分子伴侣等方面。这些生物标志物主要有：微管去稳蛋白、微管蛋白伴侣分子、蛋白激酶C抑制剂、泛素、HMG B1、异质性核内核糖核蛋白、微管蛋白分子伴侣和醛缩酶A。结论1．所检测的9种水果中均存在黄酮类化合物，但在不同种类的水果中差别较明显。与其它水果相比苹果总黄酮含量较高，是膳食黄酮类化合物的重要来源。2．苹果提取物和叶黄素在一定浓度范围内均可抑制食管癌EC9706细胞增殖，表明具有抗癌作用。干扰食管癌细胞周期，降低分裂期细胞可能是其抗癌机制之一。对细胞周期关键蛋白Cyclin D1表达水平的检测表明，经叶黄素作用后，其表达水平降低，揭示叶黄素通过调节Cyclin D1表达，调控细胞周期的进程，进而使食管癌EC9706细胞阻滞于G_0／G_1期，可能是叶黄素抑制食管癌细胞增殖的另一重要机制。叶黄素还具有促进细胞分化潜能，有助于延缓细胞生长，降低恶性程度。3．苹果提取物和叶黄素抑制EC9706细胞增殖的作用伴随着对凋亡的诱导和细胞循环周期的阻滞，研究结果提示苹果提取物和叶黄素通过介导Bax和Bcl-2的表达诱导细胞凋亡过程的发生，是其诱导食管癌细胞凋亡的分子机制之一。4．DDRT-PCR分析表明，差异表达的基因序列主要涉及SET结构域、PDZ结构域，揭示了苹果提取物在基因水平上的影响涉及到跨膜受体或离子通道蛋白，与细胞内信号调节以及蛋白质间相互作用有关的结构域。进而可影响到蛋白质定位、信号转导和蛋白复合体的组装等方面。从基因水平进一步深入探讨了苹果提取物的抗癌作用机制。研究中发现苹果提取物作用后，可使食管癌EC9706细胞周期停滞于G_2／M期，抑制细胞增殖，这种抑制作用机制可能与D52表达下调介导的抑制细胞有丝分裂有一定的联系。苹果提取物还可能通过抑制与细胞的生长、去分化和癌症有关的甲硫氨酸腺苷基转移酶Ⅱ的表达发挥抗肿瘤作用。5．经苹果提取物作用后，与细胞代谢、信号转导、细胞骨架组成、氧化应激、免疫、细胞增殖和凋亡以及分子伴侣有关的多种蛋白表达水平发生了变化。提示苹果提取物可作用于细胞代谢、信号转导、氧化应激等多种途径。鉴定的蛋白质可以作为苹果提取物作用的生物标志物，同时有可能成为临床上治疗食管癌药物作用的靶分子。苹果提取物调节微管去稳蛋白和微管蛋白伴侣分子表达，可影响细胞有丝分裂阻止肿瘤细胞生长；苹果提取物上调蛋白激酶C抑制剂，提示PKCI途径可能是苹果提取物发挥抗肿瘤作用的机制之一；对肿瘤细胞的作用与抑制泛素-蛋白酶体途径，去泛素化作用有关，潜在的机制可能涉及泛素-蛋白酶体途径介导的IKB降解，进而阻断NF-κB的活化，影响细胞内的信号传导过程；苹果提取物的抗氧化，预防氧化应激损伤与HMC蛋白有关，其抗氧化、抗炎的机制可能是通过HMC介导的；苹果提取物与蛋白质酪氨酸激酶抑制剂染料木黄酮作用相同的是，可下调异质性核内核糖核蛋白和上调微管去稳蛋白，表明这两种蛋白是它们作用的共同靶分子，提示苹果提取物可能具有酪氨酸激酶抑制剂作用；苹果提取物下调微管蛋白分子伴侣，这一作用类似抗肿瘤药物紫杉醇，微管蛋白分子伴侣是其作用的靶分子。苹果提取物可抑制醛缩酶A表达，醛缩酶A是肝癌诊断的标志物，也是药物作用的靶分子。提示苹果提取物在作用和途径上与某些抗肿瘤药物类似。6．综合研究结果表明苹果提取物和叶黄素作用后导致的细胞生长抑制、诱导凋亡与基因和蛋白表达的改变之间有着潜在的联系。由于苹果提取物中黄酮类化学物的综合作用，调节了多种基因和蛋白的表达，进而经由细胞代谢、信号通路、氧化应激、免疫调节等多途径，最终导致肿瘤细胞增殖的抑制和促进凋亡而发挥抗癌作用。
参考文献：
[1]. 天然类胡萝卜素（叶黄素）的分离纯化及分子修饰[D]. 李涛. 青岛大学. 2004
[2]. 南瓜黄色素中叶黄素的纯化及特性研究[D]. 汪廷彩. 浙江大学. 2004
[3]. 自天然叶黄素酯制取虾青素的实验研究[D]. 鹿林. 青岛大学. 2007
[4]. 高纯度叶黄素的制备及其衍生物的合成[D]. 申利英. 兰州理工大学. 2009
[5]. 金盏菊提取物化学转化和生物转化法制备叶黄素的研究[D]. 陈龙胜. 中南大学. 2005
[6]. 天然红心蛋中红色类胡萝卜素的结构表征及其生物活性评价[D]. 刘良忠. 华中农业大学. 2004
[7]. 玉米黄素提取及应用研究进展[J]. 邱涛涛, 黄明发, 陈颜虹, 王华. 中国调味品. 2008
[8]. 微藻中抗糖基化活性成分的筛选、纯化以及抗神经炎症的研究[D]. 孙培培. 华南理工大学. 2018
[9]. 小球藻异养培养的动力学分析与优化[D]. 吴正云. 上海交通大学. 2006
[10]. 苹果提取物与叶黄素对食管癌细胞的抗癌活性及标志物筛选[D]. 裴迎新. 四川大学. 2007