张延红[1]2003年在《马铃薯原生质体再生植株遗传变异鉴定及RAPD稳定性研究》文中提出搜集和创造新的种质资源，扩大变异来源是所有作物育种研究的重要课题。马铃薯栽培种大多为同源四倍体，遗传分离复杂，后代筛选繁琐，使得常规育种效率低。近年来发展起来的体细胞融合、基因导入、体细胞无性系变异等育种新技术在某种程度上可克服以上缺点，为育种开辟了一条新途径。通过原生质体培养再生的植株常常发生高频率变异，利用这一特性作为获得突变体的手段进而筛选新品种(系)可成为马铃薯品种改良的途径之一。但同时也应看到变异对体细胞融合，基因导入造成的不利影响。因此，深入全面地研究其遗传变异是这一培养体系应用中十分重要的工作。 本研究对马铃薯叶肉原生质体再生植株的54个株系及其母本进行分子水平(RAPD分析)、细胞水平(染色体数目)、表型水平(11个性状)的鉴定，全面深入地研究了再生植株的遗传变异；同时对小量法提取DNA及RAPD稳定性进行了研究，主要结果如下： 对双单倍体3#原生质体再生植株39份和双单倍体8#再生植株15份材料的表型分析表明再生植株的表型除8个株系变化较大，7个株系没变化，其它39个株系变异较小。源于同一愈伤组织的植株表型相近，发生明显变异的性状有结薯状况，株高和小叶数。 在54个再生植株的染色体检测中，有7个株系是双单倍体，2n=24；40个株系是四倍体，2n=48；少数为非整倍体和六倍体，变异丰富。同时也观察到有丝分裂过程中染色体联会分离的环状构型，染色体核内复制、胞质不分离等现象。 比较表型与染色体检测结果发现，原生质体再生植株的表型变异往往来源于其有丝分裂变异造成的染色体数目的变异。 用23个随机引物对3#母本及其39个再生植株，用23个随机引物对8#母本及其15个再生植株进行RAPD分析结果显示，再生株系与母本在所检测的位点范围内均有差异。3#再生株系变异率小，介于5.6％-18.2％之间，较集中，8#变异率大介于4.3％-32.6％较分散。原生质体再生植株在分子水平上的变异更为普遍，但各株系变异率低(个别株系除外)。在表型没有或很少变异的植株中，RAPD分析也显示出普遍变异，这说明再生植株的分子变化主要发生在不影响基因表达的DNA非编码区。 改良的小量法提取DNA，可快速、经济的提取高质量的DNA。同时通过优化选择反应参数(本实验结果显示DNA浓度在150-300ug／L之间可获得良好的扩增结果；MgCl_2浓度在1.5—4mmol／L范围内扩增效果最好；dNTP在反应中的最终起始浓度在100—300μmol／L之间为最佳；引物在0.3—3.0μmol／L之间为最佳浓度)获得了稳定的RAPD结果。 本研究首次从叁个不同水平鉴定马铃薯原生质体再生植株的遗传变异，对马铃薯双单倍体原生质体再生植株遗传变异得到全面详尽的认识，从而为以原生质体培养为载体技术的育种工作提供理论依据。同时对小量法提取DNA作了改进，增加了RAPD稳定性，对提高RAPD分析结果的可靠性具有十分重要的意义。
蔡兴奎[2]2003年在《原生质体融合创造抗青枯病的马铃薯新种质及其遗传分析》文中研究说明马铃薯四倍体栽培种(Solanum tuberosum L.)的遗传基础狭窄，常规的育种手段难以突破其种质范围，扩大马铃薯的基因库是加速马铃薯育种进程的关键。马铃薯野生资源具有对病虫害、霜冻、干旱和病毒等广泛的抗性，但由于倍性水平或胚乳平衡数(EBN)的差异，大多数野生种与栽培种杂交困难，限制了这些优良基因的利用。体细胞杂交技术为利用这些野生资源开辟了一条新途径，不仅可以克服远缘有性杂交不亲和的障碍，而且可以实现胞质基因的重组和转移。 青枯病(Ralstonia solanacearum)是一种重大的细菌性病害，在热带、亚热带、部分温带、甚至一些冷凉地区普遍发生，寄主范围涉及50多个科的200多种植物，尤其易侵染马铃薯和番茄。目前，生产上对马铃薯青枯病还没有药物进行防治，综合防治措施虽可以起到一定的效果，但难以大面积推广，因此，选育抗青枯病品种无疑是最经济、有效的途径。但马铃薯栽培种没有抗源，少数具有抗性或耐性的野生种和原始栽培种又与栽培种存在杂交障碍，抗病种质资源缺乏成为马铃薯抗青枯病育种的最大障碍。本实验旨在利用体细胞杂交技术转移青枯病抗性性状，创造抗青枯病的马铃薯新种质，为马铃薯的抗病育种和倍性育种奠定基础。主要的研究结果如下： 1．建立了高效的马铃薯叶肉原生质体融合技术体系。以马铃薯栽培品种“中薯二号”经授粉诱导产生的无性系3~#、8~#(2n=4x=48)和野生种S.chacoense(2n=2x=24)的无菌苗为原生质体来源，系统研究了电融合和化学融合因素，优化了马铃薯高效融合的参数。研究表明，电融合法在交变电场(AC)100 V／cm、AC作用时间10s、直流脉冲电压(DC)1100 V／cm、DC脉冲时间60 μs、脉冲个数1次时双核融合率为4500％左右；化学融合法(PEG法)在融合诱导液(FA)作用时间15 min和固定液(FB)作用10 min条件下，其双核融合率最高为42.7％。同时比较了PEG融合和电融合两种方式对马铃薯原生质体融合效果的影响，结果显示，两种融合方式的细胞融合率和再生植株的杂种比率没有显着差异，但电融合细胞的植板率和愈伤组织分化能力均显着高于PEG融合。在本实验条件下，从四个不同的融合处理中共筛选了1212个生长旺盛的愈伤组织进行分化培养，结果有128个愈伤组织分化出芽，并发育形成完整植株，愈伤组织的平均分化频率为10.6％，不同融合处理间的愈伤组织分化频率在9.2％～16.8％之间。 2．获得了两个组合共154个体细胞杂种株系，其中略低于一半的株系为双亲的倍性之和，近90.0％的株系为单亲叶绿体类型。将首先分化形成完整植株的160个株系，经RAPD标记鉴定，表明有154个株系为真正的体细胞杂种，杂种植株的比例为96.3%，不同融合组合的杂种率在94.4%一100%之间。进一步用流式细)Jkl仪分析细胞杂种植株的倍性水平，结果表明，47.1%为六倍体、1 0.7%为八倍体、17.1%为非整倍体和25.0%为混倍体。同时将叶绿体SSR引物NTCP一9用于杂种植株的叶绿体类型检测，结果显示，大多数杂种的叶绿体并不同时具有双亲类型，89.0%的杂种植株只含有单一亲本的叶绿体类型，其中46.1%的株系为栽培种亲本类型，42.9%的株系为野生种亲本类型。具有双亲叶绿体类型的株系只占11.0%。实验还观察到由同一个愈伤组织分化形成的不同植株，其倍性水平和叶绿体类型亦存在差异。 3.具有双亲叶绿体类型的体细胞杂种，在继代培养中其叶绿体类型的传递存在分离。对两亲本的叶绿体扩增差异片段进行克隆、测序和序列比较分析，结果表明，野生种5 chacoense的特异片段大小为242bp，与Nicotianazabacum叶绿体DNA序列(登录号:200044.1)的10 220一10 408区段有92.4%的同源性。栽培种亲本特异片段大小为303 bp，与Atropa beZladonna叶绿体DNA序列(登录号:AJ316582.l)的大片段比较，有91.5%的相似性。并且与本实验克隆的差异片段具有较高同源性的序列，均为叶绿体基因组序列，由此确定扩增片段确为马铃薯叶绿体DNA。进一步跟踪分析具有双亲叶绿体类型的杂种植株，其叶绿体在继代培养中的稳定性，结果表明，其叶绿体类型在继代培养过程中存在分离。 4.病原菌接种鉴定证明，约50%的体细胞杂种重组了野生种的青枯病抗性基因。利用青枯病生理小种1号对体细胞杂种及其亲本的试管苗进行伤根接种，试验表明，体细胞杂种株系具有从高度感病到高度抗病等一系列不同程度的抗性水平。33个体细胞杂种株系的抗病性方差分析表明，有12.1%的株系比野生种S:hacoens。更抗或更耐青枯菌生理小种1号菌株，39.4%的株系其抗性水平与野生种及chacoens。没有显着差异，21 .2%的株系其抗性水平介于两融合亲本之间。另有27 .3%的杂种株系其抗性水平与栽培种亲本没有显着差异‘进一步分析植株的抗病性水平与其倍性水平和叶绿体类型之间的关系，结果表明，体细胞杂种植株的抗病性水平与其倍性和叶绿体类型之间均无直接关系。 5.马铃薯体细胞杂种的遗传变异普遍存在，其变异来源于外植体的变异程度及融合和培养过程的影响。对体细胞杂种株系的RAPD标记分析表明，相同组合的体细胞杂种间其遗传变异普遍存在，以不同的外植体为原生质体分离材料，其杂种的遗传?
柳蓉[3]2007年在《马铃薯的再生及其再生植株遗传稳定性研究》文中研究说明马铃薯再生体系的建立是利用生活的植物细胞具有全能性的理论基础，通过愈伤组织阶段，再分化形成新的植株。它是进行诸多研究的基础，特别是近年来发展起来的转基因技术，更有赖于一个遗传稳定性高的再生体系。但在植物组织培养过程中，经常会发生体细胞无性系变异。为进一步了解马铃薯再生过程及其再生植株的变异情况，为进行其他研究奠定基础，本试验以马铃薯10个品种为供试材料，先以马铃薯大西洋品种为基础对其再生过程中的激素种类、浓度、愈伤培养天数等影响因素进行了研究，再将建立起的再生体系应用于其他9种材料，比较不同基因型之间的再生差异；最后对大西洋品种的再生植株的遗传变异进行测定。研究结果如下：1．马铃薯大西洋品种的叶片与茎段愈伤组织诱导的最佳培养基分别为MS+6-BA 2.5mg／L+NAA 0.3mg／L、MS+6-BA 2.5mg／L+NAA 0.4mg／L，诱导率均可达100％；叶片与茎段愈伤诱导不定芽分化的最佳培养基都为MS+6-BA 5.0mg／L+NAA 0.1mg／L+GA_3 10mg／L，其不定芽的分化率分别达100％、73.3％。将上述再生体系用于其它9个品种，发现不同基因型马铃薯的再生存在较大差异，该再生体系只适用于其中两个品种。2．2，4-D对诱导愈伤的效果较好，但它对不定芽的分化具有一定的抑制作用；而IAA对愈伤的诱导率不佳，其诱导的愈伤在诱导不定芽分化时的频率却比较高。将不同培养天数的愈伤用于不定芽分化，发现叶片愈伤在培养14天后用于不定芽分化效果最好，而茎段愈伤则在培养21天后的效果最佳，但普遍叶片愈伤的分化率要高于茎段的。3．同时还发现GA_3在不定芽的分化阶段是必不可少的。在未添加GA_3的分化培养基上无芽分化，只要在分化培养基中添加有GA_3，基本上都有芽分化，但其最佳浓度为10mg／L。4．通过农艺学性状的观察，100个再生植株不存在很大程度的变异，只有少数植株发生几个性状的微小变化或有极个别的在个别性状上出现较大差异。通过RAPD分析，100个再生植株中叶片愈伤再生植株只有1个发生了RAPD扩增产物的变异，茎段愈伤再生植株中有4个发生了变异。说明再生植株的变异并不普遍。
张延红, 何春雨, 柳俊[4]2008年在《马铃薯原生质体再生植株遗传变异研究进展》文中研究表明通过引证有关文献,从马铃薯原生质体再生植株的主要变异类型、变异原因以及影响因素等方面介绍了马铃薯原生质体再生植株遗传变异的研究进展。
汪静儿[5]2007年在《棉花原生质体培养与体细胞杂交研究》文中研究指明棉花不但是主要的纤维作物之一,而且是仅次于大豆的重要油料和蛋白质资源。棉花生产的稳定与否,直接关系到整个农业生产、农民收入和棉纺工业的发展,需要对棉花品种进行不断的改良和创新,培育出更多高产、优质、抗逆的棉花新品种,满足市场的需求。棉花组织培养是棉花育种研究中十分有效的手段,可以加速育种进程,提高育种效率,创造新的品种和类型,并可为现代分子育种和基因工程研究提供实验平台。棉花体细胞培养工作起步较晚,而且是被公认的难于进行体细胞植株再生和体外遗传操作的作物之一。本研究在前人工作的基础上进行了棉花体细胞培养、陆地棉原生质体培养及栽培棉种和野生棉种间的原生质体融合等研究,主要结果如下:1、通过对棉花体细胞培养过程中愈伤组织诱导、体细胞胚胎发生、植株再生和再生植株的移栽等技术体系的系统研究,成功获得陆地棉和多个野生棉种的大量胚状体和再生植株优化和完善了棉花体细胞培养体系。研究结果表明,以下胚轴为外植体,用0.1 mg L~(-1)KT+0.1 mg L~(-1)2,4-D的激素组合诱导产生的愈伤组织较松脆鲜艳,分化潜力高,但不利于胚胎的发生。胚性愈伤组织的增殖使用0.2 mg L~(-1)KT+0.5 mg L~(-1)IBA的激素组合。在培养基中添加0.3 mg L~(-1)MgSO_4+0.3 mgL~(-1)AgNO_3能够增加胚胎发生频率,而培养基MSB_5+0.1 mg L~(-1)KT+0.5 mg L~(-1)NAA+2%活性碳+8%琼脂粉就可以使植株正常生长。此外,棉花体细胞培养过程中的碳源种类对于培养效果具有重要的作用,在愈伤组织诱导培养时宜用葡萄糖作碳源,而在胚性愈伤组织诱导和胚状体萌发过程中则改用麦芽糖。该培养体系具有一定的广泛适应性,再生周期较短,陆地棉从外植体愈伤组织的诱导到再生植株约需210 d,从胚性愈伤组织到再生植株仅需90 d。2、以陆地棉品种珂字棉312和ZDM-3的胚性细胞悬浮系为材料,系统地研究原生质体分离、纯化、培养和植株再生的各个影响因素,成功获得了珂字棉312和ZDM-3原生质培养的再生植株,并进行了克劳茨基棉和澳洲棉的原生质体培养,获得了大量体细胞胚胎,初步建立了棉花原生质体培养体系。研究结果表明,纤维素酶3.0%(w/v)和离析酶1.0%(w/v),或者3.0%(w/v)纤维素酶,1.5%(w/v)果胶酶和0.5%(w/v)半纤维素酶的酶液组合酶解20～23h得到的原生质体产量和活力都较理想,适合于原生质体培养。原生质体用培养基KM8P+0.1 mg L~(-1)2,4-D+0.2 mg L~(-1)KT+1.5%(w/v)葡萄糖+1.5%(w/v)麦芽糖+9.0%(w/v)甘露醇进行液体浅层培养。此外,以麦芽糖为糖源诱导的体细胞胚胎,其畸形率低、正常植株的获得率高。再生植株经过嫁接移栽,成活率达95%以上。该原生质体培养体系具有较高的愈伤组织形成率、体细胞胚胎发生能力和移栽成活率的特点,RAPD检测结果表明,原生质体再生植株与亲本植株间无明显的差异谱带,即获得的再生植株遗传具有稳定性。3、通过陆地棉与野生棉种间的原生质体融合,成功获得了ZDM-3和克劳茨基棉,珂字棉201和叁裂棉及珂字棉201和澳洲棉的叁个组合的体细胞杂种植株。体细胞杂种植株形态上介于融合亲本之间,偏向于野生棉亲本,盆栽当年能开花但未结铃。RAPD和SSR分子标记分析表明,体细胞杂种植株的谱带皆具双亲的特异谱带;细胞流式仪检测结果表明,体细胞杂种植株的核DNA的总量基本上是两亲本核DNA的总和;细胞遗传学研究结果表明,杂种的染色体数量为双亲之和。说明获得的原生质体融合再生植株为真正的体细胞杂种,可用于育种实践。
盛小光[6]2009年在《花椰菜和大白菜新种质创制》文中指出花椰菜(Brassica oleracea var. botrytis)为十字花科(Cruciferae)芸薹属甘蓝种的一个变种,生产中常遭受多种病、虫害的威胁,如黑腐病、黑胫病、根肿病和蚜虫等,严重影响其产量和品质。在花椰菜常规种中,上述病、虫害的抗性资源匮乏或者单一,而在十字花科野生植物中存在丰富的异源高抗基因资源。应用体细胞杂交技术,可以克服常规种间杂交不亲和性,获得种间杂种,转移来自不同物种的异源抗性基因,丰富育种材料抗性基因的遗传多样性,创制新的抗病、虫种质。本研究第一部分是利用体细胞杂交技术向芸薹属甘蓝类蔬菜转移野生抗病、虫等优良性状。紫罗兰(M. incana)为十字花科紫罗兰属的一个野生种,具有很高的ω-亚麻酸含量以及优良的蚜虫抗性等。本实验建立了花椰菜和紫罗兰原生质体的PEG融合及培养技术,首次成功获得了紫罗兰与花椰菜的属间体细胞杂种再生植株,并对再生株的形态学,分子标记特征,染色体数目,细胞DNA含量等指标进行了系统的分析,为异源优异种质的利用建立了体细胞杂交技术基础。黑芥(B. nigra)为芸薹属叁个基本种之一,多为野生状态存在。黑芥中存在对黑腐病、黑胫病、根肿病等病害高抗、多抗性的基因型。本实验室通过体细胞杂交技术,获得了众多花椰菜与黑芥体细胞杂种。本研究对利用非对称体细胞杂交技术获得并成功移入温室的79个花椰菜和黑芥的杂种进行全生育期的生物学特性调查,内容包括植株形态学观察、细胞DNA含量测定、染色体计数、基因组组成、育性调查等。通过胚挽救技术获得了部分杂种的回交后代植株并对其部分生物学特性也进行了调查,同时对杂种一代及其回交后代进行了黑腐病抗性鉴定。本研究第二部分是利用远缘有性杂交手段向白菜中转移野生种黑芥的抗病性状。大白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis)是我国重要的蔬菜作物之一。在种植过程中,常遭受黑腐病、黑胫病和根肿病等病菌的侵染,致使产量下降。通过远缘有性杂交手段把黑芥的抗病性转移到白菜中,对白菜的育种将具有重要意义。本实验以品质优良的感病大白菜为母本,黑芥为父本进行杂交,并对获得的F1代植株进行了形态学,细胞学和分子标记叁种手段分析鉴定。通过胚珠和子房培养等胚挽救技术成功获得了回交后代,初步的黑腐病菌人工接种鉴定结果表明,部分回交二代杂种植株中仍具备良好的黑腐病抗性。主要实验结果如下：1.成功建立了紫罗兰和花椰菜属间体细胞杂交体系,获得了118株再生植株,并对它们进行了形态学调查、RAPD和SRAP分子标记鉴定,同工酶谱分析,染色体计数和流式细胞术核DNA含量检测,表明二株为真杂种,且均为混倍体,染色体数变化范围为26到48条。对不同鉴定方法的比较显示,形态学鉴定直观、简便,有较高的判断率,但SRAP分子标记鉴定更准确可靠。获得的紫罗兰和花椰菜属间体细胞杂种植株在移栽入地后,生长缓慢,没有达到成株期。2.对成功移栽入温室的79株花椰菜和黑芥的体细胞杂种进行了全生育期性状调查分析,内容包括细胞DNA含量测定、染色体计数、植株形态学观察和育性调查等。杂种形态变异广泛,多数呈中间类型,少数呈偏亲性状；杂种细胞DNA含量不一致,呈现大于、等于和小于双亲细胞DNA含量之和的叁种类型；DNA含量大于双亲之和的杂种中,有较高比例的材料叶型出现畸形和(或)植株生长势弱,育性差。显示出杂种植株的生长势和育性与细胞的DNA含量具有一定的相关性。通过染色体计数,发现所检测杂种多为混倍体,即同一植株的细胞有多种染色体数目构成。在79个杂种中,筛选出13个目标材料,生长势较强,有较好或一定程度的育性,表明采用体细胞杂交技术手段来改良甘蓝类蔬菜的遗传多样性具有可行性。3.根据结实与否选取了可育和不育杂种各二株,对其生物学特性进行了对比分析。不育杂种的花粉母细胞(PMCs)减数分裂行为异常的比例远高于可育杂种,出现了大量的染色体桥,染色体滞后,染色体不均等分裂等异常行为；对PMCs终变期观察表明：不育杂种中出现了大量单价体；可育杂种中,二价体数目明显提高,单价体数目较少。基因组原位杂交(GISH)结果显示：可育杂种的体细胞染色体数为供、受体染色体数之和,为对称杂种；不育杂种细胞中含有受体花椰菜的全部基因组以及附加的3-12条供体完整染色体,为低度非对称杂种。且附加的黑芥染色体在减Ⅰ期均出现染色体滞后,染色体不均等分裂等异常行为。对可育和不育杂种的基因组SRAP分子标记分析表明：杂种DNA均有重组发生,且可育杂种的平均新带比例略大于不育杂种。4.对10个株系的15株BC1杂种进行了生物学特性调查,内容包括细胞DNA含量测定、染色体计数、植株形态学观察和花粉活力调查等。杂种形态多呈中间类型,有叁棵植株形态明显趋向于受体花椰菜。核DNA含量和染色体数目均不一致,显示出混倍特性,但相比于体细胞杂种一代,其变化范围明显变窄,且有接近于受体花椰菜的趋势。以花椰菜为父本,共有4个BC1植株获得自交和回交种子,一颗植株通过胚挽救技术获得回交二代胚苗。5.采用从北京,湖南等全国六个省份收集并经过鉴定确定的8个黑腐病菌种以及从英国引进的分别属于RaceⅠ和RaceⅣ的二个生理小种,共10个黑腐菌种对融合亲本花椰菜和黑芥进行苗期抗病性鉴定。筛选出了一个受体(花椰菜)的病情指数为70.4,为“高感(HS)”级别,同时供体(黑芥)的病情指数为8.8,达到“高抗(HR)”级别的黑腐菌种CH5。用筛选的黑腐菌种CH5对体细胞杂种一代及其回交后代植株进行抗病性鉴定,结果显示部分回交二代杂种植株仍具有良好的黑腐病抗性,病情指数为15.7,达到“抗病(R)”级别。6.对获得的10株白菜×黑芥的F1代植株,经形态学,细胞学和SRAP等方法鉴定出6株为真杂种。其中有一株杂种(H1)体细胞含有26条染色体,GISH结果显示其基因组组成为ABB型,育性相对较高,获得了175粒回交一代种子；其它5株杂种50%以上的体细胞含有18条染色体,GISH结果显示其基因组组成为AB型,花粉完全败育,通过胚挽救技术也未获得回交后代。由此推测,染色体数目的增多和同源染色体的配对有利于提高杂种的育性。7.白菜-黑芥杂种与白菜的BC1代植株形态学上趋向于母本大白菜,表现出明显的杂种优势。细胞学观察发现不同BC1代杂种细胞染色体数目略有不同,但多为28条,GISH结果显示其基因组组成为AAB型,花粉活力明显提高,得到大量的回交二代种子；BC2代杂种细胞染色体数目不同,从22-28条不等。对回交一代和回交二代杂种植株的黑腐病抗性鉴定结果显示：部分回交二代植株仍然保留良好的黑腐病抗性。
郭玉琼[7]2007年在《龙眼、荔枝胚性培养物超低温保存研究》文中指出龙眼、荔枝同属无患子科，是我们南方重要热带亚热带特产果树。本研究以龙眼、荔枝胚性培养物为材料，进行龙眼、荔枝玻璃化超低温保存方法研究；同时，以龙眼胚性培养物为材料，进行超低温保存过程中低温预培养的蛋白质组学研究，以进一步探索超低温保存机理。主要研究结果如下：1．龙眼、荔枝胚性培养物的玻璃化超低温保存技术体系以龙眼胚性培养物为供试材料，探讨继代培养时间、化冻方式、不同发育阶段低温预培养对龙眼胚性培养物玻璃化超低温保存的影响。试验结果表明，继代培养12～15d的龙眼胚性愈伤组织用于玻璃化超低温保存，可获得较高的细胞活力；40℃温水浴、25℃左右室温和自来水冲洗3种不同的化冻方式对龙眼胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后的存活率影响差异不大；球形胚玻璃化超低温保存后的细胞活力，比正常的胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后的细胞活力高。以荔枝胚性愈伤组织为供试材料，探讨低温预培养、化冻方式以及光照条件对荔枝胚性愈伤组织玻璃化超低温保存的影响。结果表明荔枝胚性愈伤组织5℃低温预培养2d再进行超低温保存，采用40℃温水浴化冻和自来水流水冲洗化冻都能明显提高保存后的细胞活力；超低温保存后的培养物置于黑暗中进行为期15d的恢复生长，然后转到正常光照条件下进行培养，能使超低温保存后的荔枝愈伤组织较快地恢复生长，细胞存活率较高。2．龙眼、荔枝胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后的体胚发生与植株再生龙眼、荔枝胚性愈伤组织经玻璃化超低温保存后均能进行正常的体细胞胚胎发生，与超低温保存前正常的胚性愈伤组织体胚发生数量接近，并且体胚能完成正常分化，形成形态正常、粗壮的完整再生植株，表明龙眼、荔枝胚性愈伤组织经玻璃化超低温保存后，在体胚发生与再生植株能力方面没有产生明显变化。3．龙眼、荔枝胚性愈伤组织玻璃化超低温保存后遗传稳定性的检测利用RAPD技术从DNA分子水平对玻璃化超低温保存的龙眼、荔枝胚性愈伤组织进行遗传稳定性检测。筛选了10条随机引物，对玻璃化超低温保存前和保存后的胚性愈伤组织基因组DNA进行扩增。检测结果表明，超低温保存的体细胞无性系遗传稳定性基本得到保持，但也发现存在小量的变异现象，有个别引物扩增的谱带，在超低温保存前和超低温保存后存在一些差异。其中，龙眼胚性愈伤组织超低温保存后的变异率为3.0～3.5％，荔枝胚性愈伤组织超低温保存后的变异率为7.48％。玻璃化超低温保存后产生的遗传变异与超低温保存过程中环境胁迫有关。4．低温预培养对龙眼球形胚存活力和蛋白质表达的影响玻璃化超低温保存前的低温预培养对保存后球形胚活力与蛋白质的表达有直接的关系。在5℃预培养4d时，超低温保存后的球形胚活力最高，达82.58％，此时蛋白质表达情况为新诱导4个蛋白点，上调表达1个蛋白点，新诱导与上调表达的蛋白点数最多，共5个蛋白点；在低温预培养6d时，超低温保存后的球形胚活力反而下降，为70.25％，此时蛋白质表达情况为消失4个蛋白点，下调表达153个蛋白点数，消失与下调表达的蛋白点数达157个。新诱导和上调表达的蛋白增强了细胞的抗冻能力，使超低温保存后的存活率提高。消失和下调表达的蛋白导致细胞的抗冻能力减弱，由此引起超低温保存后的存活率下降。表明龙眼体胚超低温保存前的低温预培养以5℃、4d为最佳。5．低温预培养特异表达蛋白的生物质谱鉴定与功能分析对龙眼LC_2球形胚5℃低温预培养过程中出现的特异表达蛋白LLT1、LLT2、LLT3和LLT4，应用基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)进行肽质量指纹分析，匹配分析结果表明：LLT3可能为抗性蛋白，推测是龙眼的抗冻蛋白，对细胞具有直接保护作用，并且由PI演变而来；LLT4可能是龙眼的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶，通过改变代谢途径，提高抗冻能力。通过蛋白质的功能分析推测龙眼球形胚5℃低温预培养4d时可能有抗冻蛋白和与物质合成有关的蛋白质的表达。
郭英华[8]2005年在《生姜原生质体培养与体细胞变异》文中研究说明生姜(Zingiber.officinale Rosc.)是姜科、姜属能形成根状茎的一个栽培种。广泛分布于亚洲热带、亚热带地区,在南非、北美和澳大利亚也有栽培,是集调味品、食品加工原料和药用为一体的高效多用途蔬菜。生姜以根状茎作为繁殖材料,繁殖系数低,容易通过种姜传播病害,而且长期无性繁造成种性退化。由于姜很少开花结籽,因此无法通过有性杂交手段进行种质创新和品种改良。本论文以河南鲁山县张良姜、陕西城固黄姜、湖北枣阳生姜、四川竹根姜为试材,建立了生姜胚性愈伤组织诱导和植株再生体系、胚性悬浮系再生体系,获得了原生质体再生植株,分析了离体培养过程中的体细胞变异情况,获得如下结果: 1 以各生姜地方品种的茎尖组织为材料,诱导产生了胚性愈伤组织,建立了高频再生体系。筛选出了适于胚性愈伤诱导及扩增最佳培养基MSN+1.0mg·L~(-1)2,4-D+0.2mg·L~(-1)KT+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;胚性愈伤组织分化培养基MS+0.2mg·L~(-1)2,4-D+5.0mg·L~(-1)BA+3.0%蔗糖+0.7%琼脂;根状茎形成培养基MS+3.0mg·L~(-1)BA+0.1mg·L~(-1)NAA+6.0%蔗糖+0.7%琼脂。植物激素、氮源对生姜茎尖胚性愈伤组织形成和再分化有较大影响。蔗糖比葡萄糖更利于根状茎的诱导,活性炭对根状茎诱导没有明显作用。不同品种间胚性愈伤组织诱导、愈伤组织再分化以及植株再生能力存在一定的差异。 2 以胚性愈伤组织为材料,建立了胚性细胞悬浮系,并获得了再生植株。结果表明悬浮细胞干重和pH之间有一定的相关性。接种量和AgNO_3含量对悬浮细胞的生长都有影响:最佳接种量为1.0%,最适AgNO_3浓度为6.0mg·L~(-1)。不同品种间胚性细胞悬浮系的生长能力不同。悬浮系愈伤组织的分化能力低于其对应的胚性愈伤组织分化能力。 3 利用生姜胚性细胞悬浮系成功分离得到原生质体,获得SC姜再生植株。酶种类和浓度、渗透压调节剂种类和浓度对分离原生质体有重要影响,最佳酶液组成为4.0%纤维素酶、1.0%离析酶、0.1%果胶酶、11%甘露醇、0.5%CaCl_2和0.1%MES。原生质体产量达到6027×10~6g~(-1),原生质体活力为90.7%。悬浮培养时间对分离原生质的产量和活力有影响。葡萄糖比蔗糖更利于纯化后原生质体分裂和生长。低浓度的AgNO_3(2.0-6.0mgl~(-1))可以降低原生质愈伤组织褐化速度。不同品种间在原生质体分裂、愈伤组织分化、植株再生方面有显着差异。 4 对各品种生姜的胚性愈伤组织再生植株、胚性悬浮系再生植株、原生质体再生植株进行形态学、细胞学、分子生物学鉴定。结果表明,再生植株外部形态没有明显变异。再生植株的染色体数目没有变异。RAPD多态性分析表明,再生植株存在较广泛的体细胞变异。对各品种胚性愈伤组织、胚性悬浮系愈伤组织、原生质体再生愈伤组织进行细胞学鉴定和RAPD分析表明,愈伤组织的体细胞变异率远远高于再生植株的体细胞变异率。继代次数对体细胞变异率也有影响,随着继代时间的延长,体细胞变异率有上升趋势。
邹剑锋[9]2007年在《用试管苗低温保存马铃薯种质及其遗传稳定性研究》文中提出马铃薯(Solanum tuberosum L.)属茄科(Solanacase)作物。由于组织培养离体保存继代时间短，而超低温保存的某些关键性的技术没有突破，使得马铃薯种质资源保存进展研究缓慢。本研究以马铃薯品种Shannon's Blue(Solanum tuberosum L.)试管苗为材料，对其在4℃低温下保存时间和生理变化以及保存后再生植株的遗传稳定性进行了深入的研究，旨在延长马铃薯试管苗离体保存的继代时间，建立起较完善的马铃薯种质资源低温保存体系，为降低马铃薯种质保存成本，提高保存质量提供理论依据和新的方法。主要研究结果如下：1．MS培养基内添加不同浓度的CCC、PP_(333)、MH和SUC等，结合4℃的低温处理，发现MS+CCC 600mg.L~(-1)结合4℃的低温处理显着将马铃薯试管苗的继代时间由100天左右延长到240天以上。而且，保存后的材料转接到新鲜的培养基中通过常规继代培养后很快即可恢复生长。2．初步对马铃薯低温保存过程中的生理变化进行了研究，发现随着培养时间的延长，4℃低温能显着抑制马铃薯试管苗的株高，其叶绿素、Vc、Pro和SOD的含量逐渐下降，但在4℃条件下下降的速度比较缓慢；POD活性随着时间的延长先上升后下降，在4℃条件下POD活性较低；MDA含量随时间的延长而上升，4℃条件下MDA含量较低。3．首次采用RAPD技术对低温离体保存后的马铃薯再生植株进行遗传稳定性研究。初步优化了马铃薯DNA的RAPD反应体系。通过对120条随机引物进行筛选检测，发现马铃薯试管苗在经过CCC处理和低温保存的过程中可能没有发生遗传物质的改变，在遗传性状上表现相对稳定，无明显的变异条带。4．通过马铃薯脱毒试管苗和种薯生产的田间生物学检测经过CCC处理和低温保存的马铃薯试管苗在叶形、株形、叶长、株高和单株结薯率等性状上未发现明显的变异，其遗传多样性和期望性状是比较稳定。
李贵[10]2012年在《结球甘蓝的离体再生以及体细胞无性系变异的RAPD分析》文中研究表明结球甘蓝(Brasssica oleracea L.Var.capitata L.)是我国最主要的蔬菜作物之一现如今随着分子生物技术的快速发展,基因工程技术近年来已在植物育种中得到广泛应用,植物基因工程技术在农业上的应用为有效改良结球甘蓝的性状提供了新途径。建立高频率的植株再生体系,对于利用外源基因进行遗传转化及育种亲本的无性快繁是十分必要的。本研究首先利用结球甘蓝下胚轴原生质体和无菌苗下胚轴为材料建立了高效的植株再生体系,获得了最大的再生系数,为遗传转化技术及品种改良与创新等研究奠定了基础；其次利用RAPD分子标记技术分析了两种方式再生的植株之间的体细胞无性系变异。其研究结果如下：1.以两个早熟结球甘蓝品种‘新夏50’(XX50)、‘强力50’(QL50)的无菌苗下胚轴为材料,对影响原生质体分离、纯化与培养的主要因素进行了研究,实验结果表明：‘QL50’原生质体的分裂频率和植板率都比‘XX50’高,更适合做遗传转化与非对称细胞融合的研究材料；‘XX50’以2.5%纤维素酶R-10+0.05%果胶酶Y-23+9CPW+5mmmol·L-1MES的混合酶液,从4d苗龄的下胚轴上分离出高产率的原生质体,40d后的植板率达到0.43%；‘QL50’以2%纤维素酶R-10+0.05%果胶酶Y-23+9CPW+5mmol·L-1MES的混合酶液,从3d苗龄的下胚轴上分离出高产率的原生质体,40d后的植板率达到0.57%。两种材料的原生质体培养在改良B5附加2,4-D0.5mg·L-1.6-BA0.2mg·L-1、NAA0.2·L-1的液体培养基上,分裂旺盛。形成愈伤组织后经芽诱导和生根培养,获得了再生植株。2.以结球甘蓝‘强力50’(QL50)和“甘19cms"下胚轴为外植体,研究了不同激素配比、苗龄和AgN03浓度等对其不定芽再生的影响,实验结果表明：在不含任何激素以及单独附加不同浓度的6-BA和NAA的MS培养基上,均不能诱导外植体不定芽的分化。QL50'下胚轴在MS6-BA2mg·L-1+NAA0.02mg·L-1+AgN036mg·L-1分化培养基上再生频率最高,为93.00%,最适宜的苗龄为9d,再生系数为9.17。‘甘19cms’在MS+6-BA2mg·L-1+NAA0.2mg·L-1+AgNO36mg·L-1分化培养基上再生频率最高,为73.80%,最适宜的苗龄为6d,平均再生系数为4.27。外植体在1/2MS生根培养基中添加0.5mg·L-1NAA时,不定芽的生根效果较好,生根率达100%,且根系生长健壮。3.以结球甘蓝‘强力50’(QL50)原生质体再生植株和无菌苗下胚轴再生植株为材料,利用RAPD分子标记技术对其再生过程中产生的体细胞无性系变异进行分析检测。结果表明：从50条随机引物中筛选出条带清晰、多态性丰富、表现稳定的引物14条,在此基础上共扩增出DNA片段253条,其中具多态性的片段73条,表现为新增加带和缺失带,多态率为28.85%,每引物平均扩增的多态位点为5.21个。各植株间遗传相似系数的计算使用聚类分析软件NTsys2.10e完成,采用非加权类平均法(UPMGA)对统计数据进行聚类分析,结果表明：材料间的遗传相似系数介于0.8340-0.9842之间,各再生植株与母本间平均遗传相似系数为0.9304,植株之间存在遗传变异,RAPD分子标记适于结球甘蓝体细胞无性系变异的初步筛选。
参考文献：
[1]. 马铃薯原生质体再生植株遗传变异鉴定及RAPD稳定性研究[D]. 张延红. 甘肃农业大学. 2003
[2]. 原生质体融合创造抗青枯病的马铃薯新种质及其遗传分析[D]. 蔡兴奎. 华中农业大学. 2003
[3]. 马铃薯的再生及其再生植株遗传稳定性研究[D]. 柳蓉. 湖南农业大学. 2007
[4]. 马铃薯原生质体再生植株遗传变异研究进展[J]. 张延红, 何春雨, 柳俊. 甘肃农业科技. 2008
[5]. 棉花原生质体培养与体细胞杂交研究[D]. 汪静儿. 浙江大学. 2007
[6]. 花椰菜和大白菜新种质创制[D]. 盛小光. 南京农业大学. 2009
[7]. 龙眼、荔枝胚性培养物超低温保存研究[D]. 郭玉琼. 福建农林大学. 2007
[8]. 生姜原生质体培养与体细胞变异[D]. 郭英华. 中国农业大学. 2005
[9]. 用试管苗低温保存马铃薯种质及其遗传稳定性研究[D]. 邹剑锋. 湖南农业大学. 2007
[10]. 结球甘蓝的离体再生以及体细胞无性系变异的RAPD分析[D]. 李贵. 南京农业大学. 2012
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