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草鱼TBK1通过IRF7激活先天免疫应答

2020-12-08阅读(207)

草鱼TBK1通过IRF7激活先天免疫应答

论文摘要

先天免疫应答可以保护宿主细胞免受病原微生物的入侵。在这一信号通路中,有大量的细胞因子参与其中,最终使IFN和ISGs表达激活先天免疫反应。在哺乳动物中,IRF3和IRF7在可变致病性感染下诱导I型IFN作出反应的信号途径中至关重要。而IRF7也是IFN-α表达反应的中心调节因子。致病传感器监测到病原体侵入,可以激活多种信号转导途径。其识别和信号转导是宿主免疫反应中的关键事件,并且与许多炎症疾病有关,这些传感器通过不同的途径触发IRF7介导的反应。TANK结合激酶1（TBK1）是病原体感染后IRF7活化的关键介质。在鱼类中,有许多关于TBK1,IRF3和IRF7的报道,特别是关于TBK1-IRF3信号通路。然而,TBK1-IRF7在先天免疫信号通路中的作用机制尚不清楚。在本研究中,我们探讨了TBK1如何上调IFN、ISG表达,以及在LPS刺激下,TBK1如何通过IRF7在鱼类体内启动先天免疫应答。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。用LPS刺激细胞后,草鱼IRF3和IRF7的表达量均有不同程度明显上调现象,表明IRF3和IRF7都参与了TLR介导的抗病毒信号通路。有趣的是,草鱼IRF3对LPS的刺激反应时间要早于IRF7。此外,IRF7而不是IRF3在草鱼肾细胞（CIKs）中充当IFN和ISG转录的更强阳性调节剂。显示了在LPS感染后鱼类IRF3和IRF7之间的功能差异。双荧光素酶测定还显示草鱼IRF7和TBK1的过表达更大程度地上调了IFN和PKR的转录水平,与IRF3相比,鱼类IRF7能够更显著地增加IFN和PKR启动子活性。为了进一步了解鱼类TBK1-IRF7介导的先天免疫应答机制,发现过表达TBK1会使IRF7,PKR和PKZ蛋白水平明显上调,然而,敲除IRF7会抑制ISG表达,表明草鱼TBK1通过IRF7调节ISG的转录。之后,免疫共沉淀和GST pull-down实验证明了草鱼IRF7可以与TBK1结合。荧光共定位实验也进一步证实了它们可以直接在体内组合。我们的研究发现TBK1与IRF7结合后会使IRF7活化,在正常条件下,鱼类IRF7和TBK1具有相似的亚细胞定位,都存在于细胞质中,但用LPS或是TBK1转染之后,激光共焦显微镜和细胞核-质提取实验都表明IRF7会从细胞质易位至细胞核中,同时,还检测到IRF7的二聚化也增加。综上所述,我们的研究发现当外来物刺激宿主细胞,经过一系列的信号转导之后,TBK1可以与IRF7结合后使IRF7活化,并易位至细胞核与IFN和ISGs启动子结合激活先天免疫反应。

论文目录

  • 摘要
  • abstract
  • 第1章 前言
  •   1.1 先天免疫的模式识别受体
  •     1.1.1 TLR家族
  •     1.1.2 RLR家族
  •   1.2 干扰素（IFN）和干扰素刺激基因（ISG）
  •   1.3 Ⅰ型干扰素的转录调控
  •   1.4 TBK1研究概述
  •     1.4.1 TBK1的结构特征
  •     1.4.2 TBK1的相关功能
  •   1.5 干扰素调节因子和干扰素调节因子7（IRF7）
  •   1.6 IRF7参与调控Ⅰ型IFN表达的信号通路
  •   1.7 研究目的与意义
  • 第2章 实验仪器、试剂与材料
  •   2.1 实验主要仪器设备
  •   2.2 主要试剂与试剂盒
  •     2.2.1 主要试剂
  •     2.2.2 主要试剂盒
  •   2.3 质粒载体、菌种与细胞
  •   2.4 抗体
  •   2.5 引物表
  •   2.6 实验材料
  •   2.7 相关软件
  •   2.8 实验方法
  •     2.8.1 细胞培养
  •     2.8.2 LPS诱导草鱼IRF3和IRF7的表达分析
  •     2.8.3 载体构建
  •     2.8.4 草鱼IRF3和IRF7在激活先天免疫方面的差异
  •     2.8.5 草鱼TBK1上调IRF7和ISG的表达
  •     2.8.6 草鱼TBK1通过IRF7上调IFN和PKR的表达
  •     2.8.7 草鱼TBK1与IRF7的相互作用
  •     2.8.8 TBK1促进IRF7的核易位和二聚化
  • 第3章 结果与分析
  •   3.1 LPS诱导草鱼IRF3和IRF7的表达分析
  •   3.2 载体构建
  •     3.2.1 真核表达载体pCMV-HA-CiIRF7和pCMV-FLAG-CiIRF7和原核表达载体带GST标签的pGEX4T-1-CiTBK1的构建
  •     3.2.2 真核表达载体pCMV-HA-CiIRF7和pCMV-FLAG-CiIRF7的鉴定
  •   3.3 草鱼TBK1-IRF7启动先天免疫
  •   3.4 草鱼TBK1上调IRF7和ISG的表达
  •     3.4.1 草鱼TBK1上调IRF7、PKR和PKZ表达
  •     3.4.2 TBK1上调IFN和PKR的转录水平
  •   3.5 草鱼TBK1通过IRF7上调IFN和PKR的表达
  •   3.6 草鱼TBK1与IRF7的相互作用
  •     3.6.1 免疫共沉淀实验
  •     3.6.2 GST-pull down实验
  •     3.6.3 免疫荧光共定位实验
  •   3.7 TBK1促进IRF7的核易位和二聚化
  • 第4章 讨论
  • 第5章 主要结论、创新点及研究展望
  •   5.1 主要结论
  •   5.2 创新点
  •   5.3 展望
  • 致谢
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表论文

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 余宁理

    导师: 毛慧玲

    关键词: 先天免疫,硬骨鱼

    来源: 南昌大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学

    专业: 生物学,生物学

    单位: 南昌大学

    分类号: Q953

    DOI: 10.27232/d.cnki.gnchu.2019.000618

    总页数: 56

    文件大小: 2527K

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