导读:本文包含了双表达质粒论文开题报告文献综述及选题提纲参考文献，主要关键词:禽流感,DNA疫苗,双价表达质粒,活体成像
双表达质粒论文文献综述
黄冬[1]（2016）在《禽流感DNA疫苗双表达质粒的构建及其表达产物在BALB/c小鼠中的组织分布》一文中研究指出禽流感(Avian influenza)是由A型禽流感病毒(AIV)引起的烈性传染病,不仅对养禽业造成严重的经济损失,还危害人类的健康。接种疫苗是降低AIV发病率和死亡率最有效措施之一。基因工程疫苗技术在过去的20年之内有较大的发展,应用基因工程技术开发的DNA疫苗成本低,免疫效果好,易于生产和保存,是防控AIV的一种新型有效的途径。表达H5亚型AIV A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GS/GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗pCAGGoptiHA5免疫效果良好,正在进行复核检验。本研究基于DNA疫苗质粒pCAGGSoptiHA5,研究构建DNA双价疫苗的可能性,并探索DNA疫苗的表达产物在动物体内的分布,为DNA疫苗的应用与开发提供有效的理论与数据支撑。本研究首先以增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因作为报告基因,利用双启动子启动、内部核糖体进入位点(IRES)介导以及蛋白Linker连接的3种方法插入到DNA疫苗质粒pCAGGoptiHA5中,构建出双启动子表达质粒pHA5-eGFP、IRES介导的表达质粒pHIE以及融合表达质粒pH6E3种双价表达质粒。利用脂质体介导将这3种质粒转染293T细胞,通过间接免疫荧光(Immunofluorescence assay,IFA)和western blot方法检测瞬时表达的HA蛋白和eGFP。结果显示,成功构建出了3种双价表达质粒,间接免疫荧光和western blot检测表明3种表达质粒均可正确表达HA蛋白和eGFP;pH5-eGFP和pHIE分别表达出两个独立的目的蛋白,而且互相不影响各自的表达和细胞定位;pH6E则表达出一个双价的融合蛋白,由于HA蛋白具有膜定位信号,所以融合蛋白主要在细胞膜上表达。结果表明,双启动子表达质粒和融合蛋白双价表达质粒适用于构建禽流感病毒(AIV)以及其他相关病原的双价DNA疫苗。为直观观察DNA质粒免疫后在组织中的分布,在以上研究基础上,我们重新构建了以荧光素酶(Luciferase)为报告基因的融合表达质粒pH6L。利用脂质体介导将质粒转染293T细胞,IFA和western blot鉴定质粒在细胞内的表达。将100μg重组质粒pH6L以及表达荧光素酶的质粒pLuc分别通过肌肉接种或电转导接种的方法免疫BALB/c小鼠,于免疫后的不同时间点取小鼠腹腔注射D-荧光素(D-Luciferin)底物,利用动物活体成像系统观察DNA质粒在小鼠体内的表达情况;同时取不同时间点的不同组织用福尔马林固定,石蜡切片后进行免疫组化分析(Immunohistochemistry,IHC),并且采集血清进行HI抗体测定。结果显示,成功构建了高效表达HA蛋白和Luciferase的重组质粒,活体成像结果发现,进行电转导处理的免疫组小鼠免疫后3 h于注射部位可见明显的发光,肌肉接种的小鼠于免疫后1周在注射部位可见发光,免疫的小鼠均于免疫后6周发光减弱直至8周时消失;IHC发现,小鼠脾脏中有DNA疫苗表达产物分布;HI试验发现,电转导接种的小鼠于免疫后1周即可检测到HI抗体,肌肉接种的小鼠于免疫后3周也可检测到HI抗体。本研究结果表明,利用双启动子和融合蛋白双价表达质粒构建双价DNA疫苗是可行的,并可在动物体内高效表达,免疫后进行电转导处理可以缩短免疫反应周期,可以大幅度提高免疫效率。本研究构建的双价表达质粒有望可以成为构建双价流感DNA疫苗的基础质粒,为开发高效的抗AIV DNA疫苗提供重要的理论基础,但双价禽流感DNA疫苗的免疫保护水平需要进一步的研究。(本文来源于《中国农业科学院》期刊2016-06-01）
侯沙沙,高燕,王宇,武帅,朱晓明[2]（2014）在《HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用》一文中研究指出目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。(本文来源于《细胞与分子免疫学杂志》期刊2014年09期）
吕艳[3]（2014）在《CD44与ALDH1真核双表达质粒构建和体外表达》一文中研究指出[目的]本实验以CD44及ALDH1基因及其表达产物为研究对象,构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1,并分别转染MCF-7细胞,观察实验各组CD44及ALDH1基因和蛋白表达情况及活性并进行统计学分析,用于以CD44及ALDH1为基础的肿瘤靶向治疗研究,为进一步实验提供理论支持。[内容]本课题主要由两部分组成：本文第一部分通过RT-PCR方法检测叁种肿瘤细胞系MCF-7、PC3、A542中CD44及ALDH1目的基因的表达情况,依据实验结果选取合适细胞作为克隆目的基因片段的来源,通过DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44、PBudCE4.1-ALDH1、 pBudCE4.1-CD44-ALDH1,并通过PCR、酶切、基因测序方法验证重组质粒构建是否成功。本文第二部分通过重组质粒转染MCF-7细胞,并细胞分组A：空白对照组B：空质粒组C:pBudCE4.1-CD44转染组D:pBudCE4.1-ALDH1转染组E:pBudCE4.1-CD44-ALDH1转染组,应用RT-PCR及Western blot检测目的基因CD44及ALDH1的体外表达变化；应用CCK-8法检测目的基因CD44与ALDH1对细胞增殖能力影响,MTT法检测其对细胞-基质粘附能力的影响,并应用统计学方法分析。[方法]1. MCF-7、PC3、A542叁种肿瘤细胞系培养,并应用RT-PCR检测叁种细胞系中基因CD44及ALDH1的表达情况。2.依据上步检测结果选取MCF-7及A542细胞系作为外源基因克隆来源,应用RT-PCR获得目的基因：含Not1/XhoI酶切位点CD44转录子4及含HindⅢ/Xbal酶切位点ALDH1片段。3.利用DNA重组技术构建真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、 pBudCE4.1-CD44. pBudCE4.1-ALDH1。4.转化大肠杆菌DHa5后取阳性克隆子培养并提取质粒,应用PCR、酶切、基因测序等方法鉴定重组质粒。5.上述重组质粒应用lp2000方法转染MCF-7细胞,并细胞分组A：空白对照组B：空质粒组C:pBudCE4.1-CD44转染组D:pBudCE4.1-ALDH1转染组E：pBudCE4.1-CD44-ALDH1转染组,应用RT-PCR及Western blot检测目的基因CD44及ALDH1的瞬时表达变化。6.应用CCK-8及MTT法检测目的基因CD44与ALDH1对细胞增殖能力及细胞-基质粘附能力的影响,并应用统计学方法分析。[结果]1.RT-PCR结果显示：CD44在MCF-7、PC3中表达,在A542中未见表达；ALDH1仅在A542细胞中微弱表达,在PC3、MCF-7细胞中未见表达。2.RT-PCR获取CD44转录子4及ALDH1基因片段。3.构建获得真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、 pBudCE4.1-ALDH1。4.经PCR、酶切、基因测序等方法鉴定重组质粒构建正确。5.各组重组质粒的体外表达及活性检测显示：RT-PCR及Western blot行半定量分析表明：CD44蛋白水平的表达,A、B组与D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异有统计学意义(P<0.05)；ALDH1蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05)。6.细胞体外增殖实验显示：单基因转染组C组和D组细胞的增殖能力与A组、B组(未转染组细胞、空载体组)相比明显提高(P<0.05),同时双基因转染组E细胞的增殖能力较C组和D组细胞更进一步提高(P<0.05)。在粘附实验中,与A组和B组细胞相比,单基因转染组C组和D组细胞与基质的粘附能力均显着提高,差异具有统计学意义(P<0.05),运用双基因共表达载体进行转染后,E组肿瘤细胞的基质粘附能力得到显着提高,且提高较单基因转染组C组和D组细胞更为明显(P<0.05)。[结论]1.成功构建了真核表达重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1。2.CD44及ALDH1基因及其表达产物使肿瘤细胞体外增殖能力提高、肿瘤细胞-基质粘附性增加,在肿瘤细胞的发生发展中起重要作用。3.重组质粒pBudCE4.1-CD44-ALDH1、pBudCE4.1-CD44、pBudCE4.1-ALDH1用于多种肿瘤的基础研究,具有很好的前景。(本文来源于《天津医科大学》期刊2014-05-01）
叶玉秀[4]（2011）在《生长抑素原核真核双表达质粒的构建与鉴定及作用机理研究》一文中研究指出原核真核双表达系统与单一的原核或真核表达系统相比,具有较大的优势,可以同时启动原核和真核双表达外源基因。以减毒猪霍乱沙门氏菌为运载菌的原核真核双表达系统,可以同时在细菌和真核细胞中表达同一蛋白质,且原核表达产物可以刺激机体免疫应答；同样,真核表达质粒在机体中的表达产物也可以刺激机体产生免疫应答反应。因此,理论上原核和真核双表达质粒可以刺激机体提高其免疫应答能力。本研究应用基因克隆、细胞培养、RT-PCR、SDS-PAGE、Western blot和ELISA等技术,将原核启动子Ptrc片段克隆到非抗性筛选生长抑素真核表达质粒pGS/2SS-M4GFP-asd,构建生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd,分别转化asd-大肠杆菌χ6097和crp-/asd-双缺失减毒猪霍乱沙门氏菌C500,得到x6097 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)和C500 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)工程菌。接着对pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd质粒和C500 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)工程菌进行原核、真核表达鉴定。将重组菌免疫4周龄昆明小鼠,检测小鼠血浆中抗SS抗体和抗C500水平,旨在探讨以减毒猪霍乱沙门氏菌为载体的生长抑素原核真核双表达质粒的免疫效力,为提高现有生长抑素基因疫苗的免疫效果,开发高效、安全的促生长疫苗奠定理论基础,并提供技术支撑。1.生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd的构建与筛选人工合成启动子Ptrc序列片段,将其亚克隆入pGS/2SS-M4GFP-asd真核表达质粒CMV启动子下游,成功构建了生长抑素原核真核双表达质粒(pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd);分别转化大肠杆菌X6097和减毒猪霍乱沙门氏菌C500,经双酶切和测序鉴定结果表明,基因的插入位点、方向和序列完全正确,成功得到分别以大肠杆菌x6097 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)和减毒猪霍乱沙门氏菌C500 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)为载体的工程菌各1株。2.生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd的表达与鉴定将构建好的生长抑素工程菌C500 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)和非IPTG诱导培养3h后,培养物中检出S/2SS-M4GFP融合蛋白,大小为55KDa；用Western blot方法鉴定证明,表达的融合蛋白可与抗生长抑素抗体结合；将生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd转染293FT细胞,48h后观察到绿色荧光,RT-PCR检测证实转录产物有S片段(352bp)、S/SS片段(491bp)和S/2SS(795bp),表明该质粒既可在原核细胞又可在真核细胞中进行表达。3.生长抑素原核真核双表达重组菌免疫对小鼠免疫应答和生长的影响将生长抑素原核真核双表达C500 (pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd)工程菌分叁个免疫剂量(高剂量0.2×1010CFU/只,中剂量0.2×109CFU/只,低剂量0.2×108CFU/只)免疫雌性昆明小鼠。在整个实验阶段,高剂量组增重分别比中剂量组、低剂量组和真核对照组(pGS/2SS-M4GFP-asd)提高5.5%、8.2%和7.1%,但组间差异不显着(P>0.05),且高剂量组料肉比最低(25.9：1)。初免后3w高剂量组产生了高于真核对照组6.7%的IgG抗体效价；加强免疫后高剂量组IgG抗体效价比真核对照组提高8.2%。初免后3w高剂量组比真核对照组IgG1抗体效价提高25%,但IgG1>IgG2a,表明免疫疫苗菌后机体倾向于产生Th2型免疫应答,以介导体液免疫反应为主。由此说明,生长抑素原核真核双表达质粒pPtrc-S/2SS-M4GFP-asd与生长抑素基因疫苗pGS/2SS-M4GFP-asd相比,能够引起更强的免疫应答反应尤其是体液免疫反应,从而更好地促进机体生长。(本文来源于《华中农业大学》期刊2011-06-01）
邹建军[5]（2011）在《人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β双表达质粒的构建及鉴定》一文中研究指出背景据世界卫生组织最新资料,全世界大约有癌症病人1400万,每年约有200万新发癌症患者,死亡500万,每死亡10个人中就有一个死于癌症。恶性肿瘤是人类叁大死因之一,仅次于心脑血管病和意外事故。在发达国家中占各类死亡原因的第1或第2位。而肿瘤的发病一直呈上升趋势,美国NCI权威机构公布,美国近20年间癌症的死亡率从16%增长到23%。专家预测,由于人口老龄化、吸烟、生活方式城市化及工业化进程等多种原因,在今后的二叁十年内肿瘤的发病及死亡率仍将继续呈上升趋势。当然,肿瘤发生是一个极其复杂的过程。以往的肿瘤研究往往着重于肿瘤细胞自身,试图从癌细胞本身基因与表型改变来解释肿瘤的发生及进展。随着基因、分子生物学技术的进展,人们发现,肿瘤的形成和进展不单只与肿瘤细胞本身有关,也与肿瘤微环境有关。肿瘤微环境是肿瘤细胞在其发生发展过程中所处的内环境,由肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞,如树突状细胞、巨噬细胞等共同组成。微环境与肿瘤细胞之间关系复杂,它们相互作用,并反映、改变甚至逆转了肿瘤生物学特性,对肿瘤表观遗传学、干细胞、免疫逃逸、转移潜能等产生重要的影响。浸润在肿瘤微环境中的免疫细胞,其抗肿瘤效应的下降有利于恶性肿瘤的进展、新生血管的形成及向远处的转移。如何打破肿瘤微环境的抑制状况,是肿瘤治疗一重要途径。长期以来,肿瘤的治疗多采用手术,放疗和化疗叁大常规方法。在一百多年前,Caley用细菌疫苗免疫机体时,就观察到肿瘤会缩小。随后人们逐渐认识到肿瘤细胞可以激发机体产生免疫反应,而免疫系统本身对肿瘤也具有监视作用。机体抗肿瘤免疫由先天性免疫(非肿瘤特异性免疫)和获得性免疫(肿瘤特异性免疫)组成,二者共同参与机体免疫监视和抗肿瘤效应。随着人们对基础免疫研究的深入,对免疫系统针对肿瘤的识别和肿瘤逃避免疫监视等的机制有了更深的理解。肿瘤细胞作为抗原引起机体免疫反应通常需要两个步骤,第一步是抗原提呈细胞(antigen presenting cells, APCs)摄取并加工肿瘤抗原以MHC-Ⅰ肽或MHC-Ⅱ肽提呈给CD8或CIM T淋巴细胞。第二步是APCs表达高水平的共刺激分子(B7-、ICAM-1、LFA-1等)与抗原特异性T淋巴细胞表面的受体(CD28、TJFA-1、CD2等)结合,进而诱发机体的抗肿瘤细胞免疫应答。根据机体免疫监控和肿瘤抗原的表达原理,肿瘤在恶变和转移过程中理论上应引起免疫反应,抑制肿瘤的生长。也正是根据免疫系统对肿瘤有抑制作用,肿瘤的免疫治疗越来越受到重视。细胞过继免疫治疗曾被认为是最有前景的免疫治疗法,该方法是将患者的免疫细胞进行体外培养,加入肿瘤特异性抗原和细胞因子刺激,筛选出具有高度特异性肿瘤杀伤效应的免疫细胞并进行大量扩增,然后再回输到患者体内以杀灭肿瘤。由于此方法克服了人体内肿瘤免疫耐受中肿瘤抗原呈递效率低下和效应性淋巴细胞不足的两个关键问题,通过此方法,在体外研究中,得到了较好的肿瘤杀伤效应,但体内应用效果却远逊于体外,并不能得到显着的免疫杀伤效应。因为肿瘤细胞不仅被动的逃避免疫系统的攻击,同时也主动的抑制其生长环境中的免疫细胞的正常功能。最近研究表明,肿瘤微环境内的免疫耐正受是导致这种情况发生的最关键原因。肿瘤微环境内可以导致肿瘤局部免疫耐受发生的因素有多种,机制也不一样,大致有以下几种：局部效应细胞功能障碍、抑制性免疫调节细胞Treg、细胞因子的免疫负调节作用、抑制性配体受体反应以及肿瘤微环境中T细胞代谢活性的负调节等。由于肿瘤微环境处于免疫抑制状态,免疫系统不能有效呈递肿瘤抗原,因此针对肿瘤的特异性免疫过程无法启动,也就无法激活免疫效应细胞。正是因为这种情况,重建体内的免疫反应过程,促使特异性识别肿瘤细胞抗原的T细胞增殖与分化,是肿瘤免疫治疗的核心。在肿瘤的免疫治疗中,肿瘤疫苗的研究越来越多,其设计策略的思路是应用各种技术,增强免疫系统对肿瘤抗原的识别能力,改善免疫微环境,引发有力的特异性抗肿瘤细胞免疫,阻止肿瘤进展,最终消除肿瘤。目前人们尝试在基因水平上来进行抗肿瘤治疗,其方法主要是通过注射肿瘤基因疫苗,特别是用非病毒载体如质粒载体等来携带目的基因制作的疫苗,来观察其抗肿瘤免疫反应。基因疫苗(genetic vaccine)治疗肿瘤是利用基因工程技术将编码肿瘤特异性抗原的基因结合于表达载体上,再将疫苗直接注入机体,借助载体本身和机体内的基因表达系统表达出期望的抗原,从而诱导特异性的细胞免疫应答。其抗肿瘤免疫机制包括直接诱导特异抗肿瘤作用和间接增强机体免疫反应两方面。在肿瘤基因疫苗研究中,如何选择针对性强的肿瘤相关抗原编码基因,以及如何有效保证目的基因在体内充分表达,是该基因疫苗研制的关键。目前的各种肿瘤的治疗方法均不能很好地改善肿瘤微环境中免疫功能抑制状态,现在尚没有较好的方法打破肿瘤内环境对免疫细胞的抑制作用。针对这一问题,我们从临床器官移植后发生的超急性排斥反应得到启发,在受者体内预先存在有抗供者组织抗原的抗体,它们能与抗原相结合,并通过激活补体而迅速破坏靶细胞,或通过补体激活所产生的活性片段引起炎性反应,从而导致毛细血管和小血管内皮细胞损伤、纤维蛋白沉积和大量血小板聚集,并形成血栓,导致移植器官发生不可逆性坏死。血型抗原可以引起很强的抗血型免疫反应,能激发和增强机体的特异与非特异免疫功能。血型抗原是一类具有很强的免疫原性和抗原性的同种异型抗原,我们构想将抗血型免疫反应引入肿瘤局部,可能会增强机体的特异与非特异免疫功能,也试图改善肿瘤局部免疫抑制状态,促进DC呈递肿瘤抗原,激发CTL杀伤肿瘤细胞活性。本研究就是建立在这种设想上设计实验的。具体实验包括以下几方面：(1)人血型A抗原模拟多肽的获取；(2)人血型A抗原模拟多肽FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒的构建及鉴定。第一部分人血型A抗原模拟多肽序列的获取目的：模拟人血型A抗原模拟多肽,获得阳性克隆。方法：使用随机12肽库筛选试剂盒,按照试剂盒说明书应用常规M13方法筛选人血型A抗原模拟多肽,并行ELISA检测,挑选阳性克隆。结果：筛选得到的人血型A抗原模拟多肽基因序列为CCTAACCACAGCCCTAAAAGCCTTAGAATCCACATA,其氨基酸序列为：YVD-SKA-FRA-VVR。结论：应用随机12肽文库成功获得了人血型A抗原模拟多肽。第二部分人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒的构建及鉴定目的：人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒的构建及鉴定。方法：扩增巨噬细胞炎症蛋白3β基因,经双酶切后克隆入质粒pIRES的多克隆位点B(MCS B),构建人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β-pIRES表达质粒。PCR扩增血型A抗原模拟多肽和Fas基因的融合基因,酶切后连接克隆入真核表达质粒pIRES的多克隆位点A (MCS A)结果：成功地构建了人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒。结论：构建了人血型A抗原模拟多肽/FAS融合基因、Mip3β-pIRES双表达重组质粒,并经初步鉴定,重组质粒构建成功。(本文来源于《南方医科大学》期刊2011-04-01）
朱前磊,崔保安,陈红英,刘金朋,王淑娟[6]（2010）在《PCV2 ORF2与猪IL-2真核双表达质粒的构建》一文中研究指出根据GenBank发表的猪白细胞介素-2(pIL-2)、PCV2ORF2基因核苷酸序列分别设计并合成2对引物,PCR扩增pIL-2、PCV2ORF2基因。将回收纯化的ORF2经XhoI和MluI酶切、回收,克隆到同样处理的pIRES载体的外源基因插入位点MCSA上,构建重组质粒pIRES-ORF2。经SalI和NotI酶切、回收的pIL-2基因插入到同样处理的重组质粒pIRES-ORF2的MCSB位点上,构建pIRES-ORF2/IL2,转化入大肠杆菌DH5α。重组质粒经PCR、酶切及测序证实,含有目的片段,且连接、构建正确,表明ORF2、pIL-2已连接到pIRES真核表达载体中的指定位置,为PCV2核酸疫苗的研制、开发奠定基础。(本文来源于《中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集》期刊2010-10-12）
唐春晖,倪卫东,高仕长[7]（2010）在《LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达》一文中研究指出目的:构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,并检测其在体外的表达。方法:采用人工设计合成人LIM矿化蛋白-1(LIM mineralization protein-1,LMP-1)和LIM矿化蛋白-3(LIM mineralization protein-3,LMP-3)基因片段,分别连接于中介质粒Puc57,经酶切、测序鉴定后,LMP-1和pBudCE4.1先连接,经酶切鉴定,再连接LMP-3,重组双表达质粒行酶切、测序鉴定。用脂质体包裹转染骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs),按转染情况分为5组:未转染组(A组)、转染空载体组(B组)、转染LMP-1基因组(C组)、转染LMP-3基因组(D组)、转染LMP-1和LMP-3双基因组(E组)。采用RT-PCR和Western blot检测LMP-1和LMP-3的表达。结果:酶切及测序证实质粒Puc57-LMP-1、Puc57-LMP-3及其pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核双表达质粒构建成功。该双表达质粒在体外转染骨髓MSCs后可表达LMP-1和LMP-3分子。对RT-PCR及Western blot检测结果行灰度值测量显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.001),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05),C组及D组在LMP-1及LMP-3的表达上的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建真核双表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3,证实转染的骨髓MSCs能在体外同时表达LMP-1和-LMP-3分子。(本文来源于《重庆医科大学学报》期刊2010年08期）
贺欢,梁伟波,张林[8]（2010）在《CVB3-VP1基因与IL-15双表达质粒的构建》一文中研究指出目的构建IL-15/CVB3-VP1的基因双表达重组质粒。方法从人胚肺二倍体细胞中提取IL-15的mR-NA,逆转录后将产物与pGEM-Teasy载体连接,转化DH5a大肠杆菌,筛选重组子并提取质粒进行酶切鉴定和测序。取双酶切的目的基因片断,与经过同样两种酶切的pcDNA3载体连接,经过转化、筛选和酶切鉴定后,构建成真核表达重组质粒PcDNA3-IL-15。用自行设计的引物从PcDNA3-VP1质粒上扩增出带有启动子的VP1基因,插入到PcDNA3-IL-15质粒上,构建成真核重组质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。结果构建的PcDNA3-VP1/IL-15重组质粒目的基因与CVB3-VP1和IL-15的标准序列相同。结论成功构建了柯萨奇病毒VP1基因和人白细胞介素15基因双表达质粒PcDNA3-IL-15/CVB3-VP1。(本文来源于《四川医学》期刊2010年07期）
唐春晖[9]（2010）在《LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达》一文中研究指出目的:基因工程和组织工程技术的不断发展,为修复骨缺损及促进脊柱融合提供了更多的治疗选择。其中LIM矿化蛋白(LIM mineralization protein,LMP)是近年来研究的热点。本实验通过构建真核表达质粒pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3、pBudCE4.1- LMP-1和pBudCE4.1-LMP-3,并分别转染兔骨髓间充质干细胞,观察实验各组LMP-1与LMP-3基因和蛋白表达情况,比较携带双基因与携带LMP-1或LMP-3单基因的骨髓间充质干细胞在表达上的差别,为进一步动物实验提供理论支持。方法:1、将人工合成含HindⅢ/BamHⅠ酶切位点的人LMP-1基因片段及含Xhol/kpnⅠ酶切位点的人LMP-3基因片段分别与中介质粒Puc57进行连接反应,构建质粒Puc57-LMP-1和Puc57- LMP-3,并行酶切和测序鉴定。2、LMP-1和LMP-3基因分别和真核双表达质粒pBudCE4.1进行连接反应,分别构建质粒pBudCE4.1 -LMP-1和pBudCE4.1-LMP-3 ,经过酶切和测序证实,并在重组质粒pBudCE4.1-LMP-1的基础上再进行与LMP-3的连接反应,再经酶切及测序鉴定。3、分离、培养兔骨髓间充质干细胞,对细胞进行镜下形态学观察。将细胞分为五组即A:空白对照组B:pBudCE4.1组C:pBudCE4.1-LMP-1组D : pBudCE4.1-LMP-3组E: pBudCE4.1- LMP-1-LMP-3组。用脂质体法将四种质粒按分组在体外分别转染至兔骨髓间充质干细胞。4、对上述五组分别进行RT-PCR和Western Blot检查其基因和蛋白表达,并比较其组间差异性。结果:1、酶切及测序证实质粒Puc57-LMP-1、Puc57-LMP-3、pBudCE4.1-LMP-1、pBudCE4.1-LMP-3及pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核双表达质粒构建成功。2、该双表达质粒在体外转染MSCs细胞后可表达LMP-1和LMP-3分子。3、对RT-PCR及Western Blot检测结果行灰度值测量显示:LMP-1 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.05),C组与E组差异无统计学意义(P>0.05);LMP-3 mRNA及蛋白水平的表达,A、B组与C、D、E组间差异有统计学意义(P<0.001),D组与E组差异有统计学意义(P<0.05),C组及D组在LMP-1及LMP-3的表达上的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1、成功构建pBudCE4.1-LMP-1、pBudCE4.1-LMP-3和pBudCE4.1-LMP-1-LMP-3真核表达质粒。2、转染pBudCE4.1- LMP-1-LMP-3的骨髓间充质干细胞能在体外同时表达LMP-1和LMP-3分子。3、双基因转染显着提高了LMP-3的表达水平,LMP-1与LMP-3之间存在互表达作用。(本文来源于《重庆医科大学》期刊2010-05-01）
邢艳莉[10]（2010）在《巯基烷基化壳聚糖介导pIRES-hVEGF_（121）cDNA/hBMP-4真核双表达质粒修复兔桡骨缺损的初步研究》一文中研究指出外伤或肿瘤等原因造成的骨缺损、骨不连的再生与修复一直是困扰修复重建外科的重要难题,其治疗方法种类繁多并各有利弊。目前在基础研究和临床治疗领域,基因治疗是其研究热点。骨缺损的局部基因治疗是将具有成骨作用目的基因携带病毒或非病毒表达载体或质粒通过体内直接转移或体外扩增途径转入靶细胞,由靶细胞转录成mRNA并翻译成蛋白质。依靠蛋白质的作用,靶细胞被刺激分化,通过自分泌或旁分泌的方式促进成骨。随着细胞重组技术的发展,越来越多参与骨修复的生长因子的基因被成功克隆,使得基因治疗骨缺损成为一种可能。该方法的优点是:基因产物可以局部和靶向释放;可最大限度地增加局部治疗效果,减少全身副作用;多种基因可分别转导,并分别调控内源性合成的蛋白质比外源性重组蛋白具有更强的生物活性等。基因治疗被认为是维持骨缺损局部生长因子有效治疗浓度最有希望的一种方法。自Urist (1965年)首先发现并制备出了牛的骨形态发生蛋白(Bone Morphogenetic Protein, BMP)粗提物以来,BMP被广泛应用于骨缺损和异位成骨的研究。BMP是骨生长的启动因子,能诱导骨髓基质细胞分化为成骨细胞和骨细胞,促进钙化作用,产生钙化的骨基质。但骨缺损的修复是一个复杂的受多种细胞因子调控的过程,每一种分子都有特定的作用时间和特定的功能范围,其中再生骨组织中的血管再生是关键环节。目前国内外研究较多的是采用BMP和血管内皮细胞生长因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)协同作用来修复骨缺损。VEGF是属于血小板源性生长因子家族中的一个成员,是机体内促进血管生长的最主要的生长因子,能特异地作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成,参与骨的再生与修复过程,在骨折愈合的不同阶段几乎都有表达,可直接或间接影响骨修复及血管再生的各个环节。众多研究表明VEGF与BMP可通过联合方式促进骨组织的再生与修复,但是其相互协同作用机制尚不十分明确,因选择基因载体的差异而导致转染效率也不尽相同。因此,各种骨再生生长因子间是如何相互作用促进骨再生的;选择何种副作用小转染效率高的载体,并改造基因载体提高基因转染效率,实现基因转染的靶向性和可调控性是目前需深入研究的内容。本课题组前期构建的pIRES-hVEGF_(l2lc)DNA/hBMP-4真核双表达质粒向成骨方向的研究已明确,本研究旨在将制备的巯基烷基化壳聚糖(Thiolated N-alkylated chitosan,TACS)介导的pIRES-hVEGF_(l2lc)DNA/hBMP-4双核共表达质粒应用于动物实验,观察其在骨缺损修复中的作用。(本文来源于《安徽医科大学》期刊2010-03-26）
双表达质粒论文开题报告
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
目的构建能同时表达HBsAb靶向干扰素(dsFvα)和人白细胞介素12(hIL-12)的新型基因治疗质粒pVAX-HBVE。方法将pEE14.1-dsFvα质粒双酶切获得dsFvα片段,克隆入经同样双酶切后的载体pVAX-IRES-hIL-12 IRES序列的上游,构建重组表达质粒命名为pVAX-HBVE。将重组质粒瞬时转染HEK293T细胞,ELISA检测目的基因表达;提取重组质粒pVAXHBVE,注射到乙肝转基因小鼠腿部肌肉并采用电穿孔递送,定量PCR检测注射前后转入1.3拷贝HBV全基因组的BALB/c小鼠体内HBV基因拷贝数的变化。结果 pVAX-HBVE经酶切和测序分析与预期设计完全一致,显示重组质粒构建成功;ELISA检测显示dsFvα和IL-12基因在细胞上清中获得表达;注射重组质粒pVAX-HBVE 30μg仅1次即可使转基因小鼠体内的HBV基因拷贝数降低2个数量级。结论成功构建能够含有靶向干扰素(dsFvα)和hIL-12的双表达质粒,为慢性乙肝基因治疗提供新的策略。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
双表达质粒论文参考文献
[1].黄冬.禽流感DNA疫苗双表达质粒的构建及其表达产物在BALB/c小鼠中的组织分布[D].中国农业科学院.2016
[2].侯沙沙,高燕,王宇,武帅,朱晓明.HBsAb靶向干扰素和IL-12双表达质粒pVAX-HBVE的构建与应用[J].细胞与分子免疫学杂志.2014
[3].吕艳.CD44与ALDH1真核双表达质粒构建和体外表达[D].天津医科大学.2014
[4].叶玉秀.生长抑素原核真核双表达质粒的构建与鉴定及作用机理研究[D].华中农业大学.2011
[5].邹建军.人血型A抗原模拟多肽/Fas融合基因-Mip3β双表达质粒的构建及鉴定[D].南方医科大学.2011
[6].朱前磊,崔保安,陈红英,刘金朋,王淑娟.PCV2ORF2与猪IL-2真核双表达质粒的构建[C].中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第四次猪病防控学术研讨会论文集.2010
[7].唐春晖,倪卫东,高仕长.LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达[J].重庆医科大学学报.2010
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[9].唐春晖.LMP-1与LMP-3真核双表达质粒的构建及体外表达[D].重庆医科大学.2010
[10].邢艳莉.巯基烷基化壳聚糖介导pIRES-hVEGF_（121）cDNA/hBMP-4真核双表达质粒修复兔桡骨缺损的初步研究[D].安徽医科大学.2010