褪黑素对海马CA1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制

侯尚伟^[1]2004年在《褪黑素对海马CA1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制》文中研究说明褪黑素对海马CA1神经元延迟外向整流钾电流的作用及其机制分析褪黑素(melatonin)是一种主要由脑内松果体合成和分泌的神经激素,离体和在体实验均已证实褪黑素具有强大的神经保护作用,主要机制在于其清除自由基和抗氧化功能。钾离子通道对于维持细胞膜兴奋性和神经元间的信息传递有着重要的作用。然而,近年来研究发现,延迟外向整流钾离子通道(IK)活性增加参与了脑缺血后神经元的死亡过程。而其特异性通道阻断剂具有神经保护作用。海马是中枢神经系统记忆和认知形成和巩固的重要结构,同时也是缺血缺氧极易累及的脑区。已有的电生理学实验已经表明,褪黑素可以调节海马神经元的兴奋性和突触可塑性。然而,褪黑素是否能调节海马神经元IK尚未见报道。因此,本实验采用脑片全细胞膜片钳记录技术,观察了褪黑素对出生后14-18天SD大鼠海马CA1锥体神经元IK的作用,并分析了其可能的机制。结果显示:(1)为了研究褪黑素对IK的作用,我们将细胞膜电位钳制于-50mV,在-110mV的前置脉冲电压之后插入一段时间为50ms,幅度为-50mV的中间电压,使IA完全失活,然后使膜电位去极化到+60mV记录到IK,在此基础之上,我们观察了褪黑素对IK的作用,发现褪黑素可以剂量依赖地抑制IK,其半数抑制剂量(IC50)为3.75mM(n=8)。从褪黑素对IK作用的时程曲线可以看到,褪黑素发生作用较迅速且具有可逆性,一般在给药后1分钟内起效,在冲洗后6分钟恢复到给药前水平。(2)为了研究褪黑素对IK激活和失活的电压依赖性的影响,我们绘制了IK的正态化的电导(或电流)与膜电位的关系曲线,用Boltzman公式拟合后发现,给予褪黑素前后IK的半激活电压(VH)分别为11.6 ± 1.5 mV和9.6 ± 1.2 mV,两者相比无显着性差异。相反,IK的半失活电压(Vh)分别为-52.8 ± 1.1 mV和 –61.0 ± 1.4 mV (P<0.05,n=6)。该结果提示褪黑素不影响IK的电压依赖性激活却使IK的失活向超极化方向偏移。(3)为了研究褪黑素的作用是否与其细胞膜特异性受体有关,我们分别观察了MT1/MT2受体阻断剂-luzindole和MT3受体阻断剂-prazosin对褪黑素抑制效应的影响。结果显示,40,100,250 μM的luzindole可以剂量依赖性的抑制IK,且不能减弱2.5mM的褪黑素对IK的抑制效应。 而prazosin在100和300μM的剂量下既不影响正常IK的幅度,也不能减弱2.5mM的褪黑素对IK的抑制效应。该结果提示褪黑素对IK的抑制效应与其特异性细胞膜受体无关。(4)因为褪黑素在高浓度时也可以激活5-HT受体,那么其对IK的抑制是否与5-HT受体有关呢?我们观察了广谱的5-HT受体激动剂5-HT在10,100,500 μM时对IK的作用,发现该作用剂量的5-HT不能模拟褪黑素对IK的抑制效应,也不能减弱褪黑素对IK的抑制。该结果间接提示褪黑素对IK的作用不是通过激活5-HT 受体完成的。(5)为了研究褪黑素对IK的作用是否与其清除自由基的作用有关,我们观察了羟自由基的前体H2O2对IK的作用,发现H2O2能快速、剂量依赖地抑制IK,给予1mM和4mM的H2O25分钟后,IK的幅度分别为给药前IK幅度的86.5±4.5%和44.2±3.4%,与对照组相比,P<0.01。由于H2O2对IK的影响与褪黑素对IK的效应方向一致,因此可以排除褪黑素对IK的作用与清除自由基功能相关的可能。(6)为了研究褪黑素对IK的抑制效应是否与其结构特异性有关,我们进一步观察了褪黑素前体5-HT和 N-acetylserotonin以及其代谢产物6-hydroxymelatonin对IK的作用。发现在给予2.5mM的5-HT后5分钟,IK的幅度为94.6±3.4%,同对照组的97.9±3.1%相比,无显着性差异。相反,在给予相同剂量的N-acetylserotonin 和6-hydroxymelatonin后,IK的幅度分别下降为给药前的89.7±3.1%和86.0±3.5%,同对照组相比 P<0.01。从结构特征看,上述化合物与褪黑素一样都含有基本结构-吲哚环,所不同的是,在吲哚环上具有不同的侧链,为此我们又分析了吲哚对IK的作用,发现2.5mM的吲哚可以使IK下降到给药前的64.2±3.1%,同相同剂量的褪黑素的效应相比,无显着性差异。并且,吲哚可以剂量依赖性的抑制IK,其IC50为3.44mM。比较上述各种物质对IK的抑制效果可见,褪黑素=吲哚>N-acetylserotonin=6-droxylmelatonin>5-HT。如前所述,这些化合物都含有吲哚这一基本结构,所不同的是吲哚上的侧链的极性不同而造成了脂溶性的不同。它们对IK抑制效应的差别恰恰反应了与这些化合物本身的脂溶性有很大的关联。为此,我们设想,把脂溶性最小的5-HT导入细胞内,也可能出现对IK的抑制效应。结果显示,电极内给予2.5mM的5-HT可以迅速抑制IK,在给药后5分钟,IK的幅度降低为刚形成封接时幅度的57.75 ± 2.4%,同对照组的94.3 ± 1.0%相比,P<0.001。该结果提示褪黑素对IK的作用可能与其吲哚结构有关,且发生作用的部位可能在细胞内部。综上所述, 褪黑素可以快速、可逆且剂量依赖地抑制海马CA1神经元IK。褪黑素对IK的抑制与其细胞膜受体及清除自由基功能无关,很可能是通过其吲哚结构来完成的,且作用发生在细胞内。我们的结果提示对IK的抑制可能是褪黑素神经保护作用的一条新的途径。

李享元^[2]2005年在《基于离子通道动力学的神经药物作用机制的研究》文中指出阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是老年性痴呆中的一个主要类型,发达国家对此疾病的发病机制及预后研究较深入。许多研究表明胆碱能神经的功能缺失在AD 发病机制中具有重要的作用。目前,AD 已经和心、脑血管疾病、恶性肿瘤并列为导致老年人死亡的四大杀手。乙酰胆碱酯酶抑制药AChEI 获许用于AD 治疗,且今后仍是主要治疗用药。华中科技大学、香港科技大学、美国、台湾和上海药物研究所的不同学科和专业背景的学者,探索神经退行性疾病的发病机制和药物开发,取得了阶段性成果,并推出了第二代新型的乙酰胆碱酯酶抑制剂药物Bis(7)-tacrine。Bis(7)-tacrine [bis(7)-tetrahydroaminacrine] 是一种新型的二聚体乙酰胆碱酯酶抑制剂,两个tacrine 分子通过庚烯键连接而成。实验证明它的药理作用比tacrine 强150倍,对抑制乙酰胆碱酯酶的选择性是tacrine 的250 倍。Tacrine 是首先用于缓解治疗Alzheimer's disease 的乙酰胆碱酯酶抑制剂药物。Bis(7)-tacrine 可以有效逆转老鼠AF64A 诱导方向性记忆缺陷。Bis(7)-tacrine 是一种多功能/多靶点乙酰胆碱酯酶抑制剂,可以作用于酶、神经递质、受体和离子通道等靶点。除了乙酰胆碱酯酶抑制作用,Bis(7)-tacrine 对几种配体门控离子通道也有调制作用,如大鼠海马神经元的GABAAR 受体,大鼠叁叉神经元的5-HT3R 受体,和大鼠海马神经元的NMDAR 受体等等。本文的研究旨在探索bis(7)-tacrine 是否象FDA(美国食品和药物管理局)批准的乙酰胆碱酯酶抑制剂tacrine 一样对多种神经元的通道和受体具有调制作用及其对离子通道的动力学参数的影响。为此,综合利用膜片钳、电压钳和基因表达技术,进行了相应实验工作,验证了bis(7)-tacrine 神经药理作用,并且比tacrine 强两个数量级左右。本文创新性的研究工作如下:(1) 充分利用电子技术和计算机技术的成就和进步,研制了国内首台基于USB(Universal Serial Bus)的卵母细胞双电极电压钳和数据采集分析系统。在广泛听取电生理科研人员的意见和建议的基础上,研制的仪器易于操作,软件界面友好,并在试验中验证其性能指标,具有高输入阻抗、低噪声、低漂移、精度高和跟随响应速度快且性价比高。由于采用USB 接口,使仪器便于安装和调试。卵母细胞双电极电压钳系统,国内一直依赖进口,如NPI 的一个电压钳放大器价格达到八千到一万美

参考文献：

[1]. 褪黑素对海马CA1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制[D]. 侯尚伟. 复旦大学. 2004

[2]. 基于离子通道动力学的神经药物作用机制的研究[D]. 李享元. 华中科技大学. 2005

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