乔永[1]2007年在《湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积相关基因表达的发育性变化研究》文中研究说明为了给绵羊肌内脂肪(Intramuscular fat，IMF)沉积规律及相关基因表达规律的研究提供基础资料，本文以0～6月龄的雄性湖羊羔羊为试验对象，探讨了湖羊羔羊不同部位肌肉(背最长肌、腰大肌、后腿股二头肌和前腿肱二头肌)肌内脂肪沉积的发育性变化以及脂肪沉积和代谢相关基因表达的发育性变化特点。本研究用索氏抽提法测定肌内脂肪含量；以GAPDH基因为内标，用real time PCR法对影响肌内脂肪含量的部分相关基因的表达进行了相对定量分析；并对基因表达与肌内脂肪含量的相关性进行了分析。研究结果如下：1．湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积的发育性变化(1)湖羊羔羊不同部位肌肉肌内脂肪含量在0-6月龄间均呈上升趋势，5月龄时极显着高于前面各月龄(P＜0.01)；在背最长肌中，2月龄时IMF显着高于初生时(P＜0.05)；腰大肌IMF在3月龄时显着高于初生时(P＜0.05)；后腿股二头肌IMF在前4个月龄时差异均不显着；在0～6月龄间，背最长肌IMF量均高于腰大肌和股二头肌；表明肌内脂肪沉积在绵羊不同部位肌肉沉积的速度有较明显差异，湖羊肌内脂肪的沉积有较明显的组织特异性。(2)4～5月龄是湖羊羔羊肌肉脂肪沉积最快的时期，5月龄时的肌内脂肪含量在不同肌肉部位都极显着高于前面各月龄(P＜0.01)，表明4～5月龄时是湖羊羔羊肌内脂肪迅速沉积的一个重要时期。2．湖羊羔羊肌肉OB基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)在湖羊羔羊背最长肌中，OB基因mRNA表达水平3月龄时极显着高于其余各月龄(P＜0.01)；在腰大肌中，初生时表达水平最高，显着高于2～3月龄(P＜0.05)，3月龄时下降到最低，到4月龄后回升；在前腿肌肉中，初生羔羊的OB基因表达量最高，显着高于3、5和6月龄(P＜0.05)，然后随月龄增加而波动下降，6月龄时降到最低；后腿肌肉中，初生时OB基因表达量较低，随月龄的增加而上升，3月龄时升到最高，极显着高于初生时(P＜0.01)，显着高于其余各月龄(P＜0.05)，然后4月龄时回落，并保持这种低水平表达；(2)初生时腰大肌和前腿肌肉OB基因表达水平极显着高于背最长肌和后腿肌肉(P＜0.01)，3月龄时背最长肌极显着高于腰大肌和前腿肌肉(P＜0.01)，后腿肌肉显着高于腰大肌和前腿肌肉(P＜0.05)；表明OB基因mRNA表达水平发育性变化在湖羊羔羊肌肉中表现出较明显的组织特异性；(3)背最长肌中OB基因的表达与IMF在3～6月龄间成负相关(r=-0.405，P=0.119)，股二头肌OB基因的表达量与IMF在3～6月龄间成负相关(r=-0.303，P=0.194)，表明OB基因在肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积起着一定的负作用。3．湖羊羔羊肌肉OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)OBR基因mRNA在湖羊羔羊不同部位肌肉中的发育变化模式基本相同，即在刚出生时表达量均较低，然后随月龄增加而上升，到3月龄时各部位均升到最高，然后又下降，保持一个相对较低的水平；腰大肌中，2月龄时OBR mRNA的表达水平极显着高于0～1月龄和4～6月龄(P＜0.01)；背最长肌中OBR表达水平在3月显着高于2和6月龄(P＜0.05)；OBR基因在肱二头肌中的表达水平在3月龄时极显着大于其余各月龄(P＜0.01)；在股二头肌中，3月龄时OBR基因表达水平极显着大于0～1和5～6月龄(P＜0.01)，显着高于4月龄(P＜0.05)，6月龄水平显着低于2月龄(P＜0.05)；(2)2月龄时股二头肌OBR基因mRNA表达量极显着高于背最长肌(P＜0.01)，3月龄时肱二头肌和股二头肌均高于腰大肌和背最长肌(P＜0.05)，4月龄时股二头肌极显着高于腰大肌(P＜0.01)，表明OBR基因在湖羊羔羊肌肉中的表达呈现出组织特异性和时序性发育变化模式；(3)股二头肌中OBR基因的表达量与IMF在本研究中的各月龄均呈明显的负相关(r=-0.433，P=0.012)；在背最长肌(r=-0.128，P=0.209)和腰大肌中(r=-0.254，P=0.168)也发现成负相关，表明OBR基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积也起一定的负作用。4．湖羊羔羊下丘脑OBR基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊下丘脑OBR基因在0～6月龄间保持稳定表达水平；(2)湖羊下丘脑OBR基因表达水平与各部位肌肉肌内脂肪含量无明显相关性。5．湖羊羔羊肌肉FAS基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊背最长肌中FAS基因mRNA表达在初生时较低，然后波动上升，到5月龄时升到最高(P＜0.01)；在腰大肌中，FAS基因mRNA水平变化呈现出先高后低的趋势，2月龄时最高，极显着高于4～6月龄(P＜0.01)，4月龄时最低，极显着低于0～2月龄(P＜0.01)；前腿肌肉中，FAS基因mRNA水平随月龄的增加先上升后下降，到3月龄时升到最高，极显着高于其余各月龄(P＜0.01)，然后下降保持相对较低水平的表达；后腿肌肉中FAS基因表达量初生时较低，波动上升，到3月龄时最高，然后4月龄时下降到最低，极显着低于3和6月龄(P＜0.01)，5～6月龄缓慢回升；(2)除4月龄时，腰大肌FAS基因mRNA水平均极显着高于其余各部位肌肉(P＜0.01)；2月龄和5～6月龄时背最长肌FAS表达也极显着高于其余各部位(P＜0.01)；3月龄时前腿肌肉FAS mRNA水平极显着高于其它部位肌肉(P＜0.01)。表明FAS基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性；(3)背最长肌FAS基因表达量与IMF在0～6月龄呈极显着正相关(r=0.606，P=0.005)，腰大肌中FAS基因表达量与IMF在4～6月龄呈正相关关系(r=0.360 P=0.187)，股二头肌中FAS基因表达量与IMF在4～6月龄呈正相关关系(r=0.471，P=0.076)，表明FAS基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着正向调控的作用。6．湖羊羔羊肌肉HSL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)HSL基因在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化表现为：背最长肌中初生时最低，然后随月龄的增加上升，3月龄时出现峰值，显着高于0～1月龄(P＜0.05)，然后又下降，6月龄时升到最高，极显着高于以前各月龄(P＜0.01)；腰大肌中表现为“下降-上升-下降-上升”的模式，3月龄时最高，极显着高于1和4月龄(P＜0.01)；前腿肌肉中先下降，后上升，再下降保持稳定，2月龄时最低，极显着低于刚出生时(P＜0.01)；后腿肌肉表现为先上升，后下降，又上升的模式，3月龄时最高，显着高于0～1月龄(P＜0.05)，4月龄时最低，极显着低于3月龄(P＜0.01)；(2)在0～6月龄，腰大肌中HSL基因mRNA表达量均极显着高于其它部位(P＜0.01)，0月龄时背最长肌极显着低于其它部位．(P＜0.01)，4月龄时股二头肌极显着低于其余部位(P＜0.01)，6月龄时背最长肌极显着高于前腿和后腿肌肉(P＜0.01)；表明HSL基因表达在湖羊羔羊肌肉中的发育性变化有明显的组织特异性，其中在腰大肌中的表达量显着高于其余各肌肉部位；(3)对湖羊羔羊不同部位肌肉中HSL基因的表达量和IMF的相关性分析表明：各部位肌肉中两者均呈正相关关系，其中背最长肌在0～6月龄呈极显着相关(r=0.630，P=0.0003)，腰大肌和股二头肌中4～6月龄两者的相关系数分别为0.589(P=0.020)和0.280(P=0.121)，表明HSL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪沉积的调控可能不是在mRNA水平，可能在蛋白水平上。7．湖羊羔羊肌肉LPL基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)LPL基因在湖羊羔羊不同肌肉部位表现出较明显的差异：在背最长肌中LPL基因的表达随月龄的增加而上升，到5月龄时升到最高，显着高于1～4月龄(P＜0.05)，极显着高于0月龄(P＜0.01)；在腰大肌中LPL水平初生时较高，到1月龄时上升，到3月龄间稳定，4月龄时下降到最低，5～6月龄回升到1～3月龄时的水平，各月龄间差异不显着；前腿肌肉中，0～2月龄保持稳定，3月龄时升到最高，4月时下降，5月龄时上升，到6月又下降，其中3和5月龄时的表达量极显着高于其余各月龄(P＜0.01)；后腿肌肉中，LPL基因初生时较高，然后下降，到3月龄时升到最高，4月龄时下降，5～6月龄又回升，各月龄间差异不显着；(2)在刚出生时，股二头肌中LPL mRNA水平极显着高于其余部位肌肉(P＜0.01)，1～2月龄时腰大肌和股二头基因表达量均高于另外两个研究部位(P＜0.05)，3月龄时股二头肌极显着高于背最长肌(P＜0.01)，4月龄时背最长肌和股二头肌均显着高于另外两个部位(P＜0.05)，6月龄时肱二头肌极显着低于其余叁个部位(P＜0.01)；(3)湖羊羔羊背最长肌中LPL基因的表达量与IMF在0～6月龄呈极显着正相关(r=0.503，P=0.005)，在股二头肌肌肉中，LPL基因mRNA水平与IMF呈正相关(r=0.294，P=0.102)，表明LPL基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积有一定的积极作用。8．湖羊肌肉UCP3基因表达的发育性变化及其对IMF的影响(1)湖羊羔羊不同部位肌肉中UCP3基因表达的发育性变化表现为：在背最长肌中，初生时较高，到1月龄时升到最高，然后随月龄增加下降，6月龄时降到最低，各月龄间差异不显着；腰大肌中表现为先上升后下降的模式，3月龄时出现峰值，各月龄间差异不显着；前腿肌肉中初生时较高，1月龄有所下降，2月龄升到最高值，3月龄下降到最低，4月龄回升后又逐渐下降，各月龄间差异不显着；后腿肌肉在各月龄间保持较稳定的水平，没有较大差异；(2)在3月龄时腰大肌中UCP3基因表达水平显着高于其余叁个肌肉部位；表明UCP3基因在湖羊不同部位肌肉中的发育性变化有差异，但差异不明显。(3)湖羊羔羊背最长肌中UCP3基因的表达量与背最长肌IMF在0～6月龄呈负相关(r=-0.211，P=0.262)；在股二头肌肌肉中，UCP3基因mRNA水平与股二头肌中IMF在2～6月龄间呈负相关(r=-0.209，P=0.328)；在腰大肌中，UCP3基因的表达量与IMF在3～6月龄成负相关(r=-0.286，P=0.266)，表明UCP3基因在湖羊肌肉中的表达对肌内脂肪的沉积可能起着负向调控的作用。
廖江铨[2]2017年在《冠心病血瘀证相关IncRNA-miRNA-mRNA调控网络研究》文中研究指明背景及目的随着社会经济的发展,人口老龄化进程的加快等,心血管疾病的危险因素水平持续增加,冠心病已成为致死率最高的慢性疾病之一。在我国乃至全球,冠心病发病率和造成的社会经济负担日益增加,对冠心病病理机制的持续探讨并以此进行治疗策略的优化显得极为迫切。在现代中医学理论中,冠心病属于"胸痹"、"心痛"的范畴,血瘀是临床上冠心病心绞痛的最主要证候要素。从瘀血角度探讨冠心病血瘀证的病理发生发展,有助于深层理解冠心病血瘀证。随着近十年组学技术和生物信息学处理技术的高速发展,对冠心病血瘀证证候本质的研究,已进入基因组学、转录组学层面。利用基因组学信息量大、指标客观而层次深、具有网络关联性的特点,可以从多角度深入挖掘冠心病血瘀证证候本质。本研究在既往研究基础上,通过高通量测序筛选冠心病血瘀证相关基因表达谱,以shRNA转染技术验证基因间调控关系,构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,定位该基因调控网络中的关键节点,从转录组学层面对冠心病血瘀证的病理机制和证候本质进行探索,为未来开发冠心病血淤证生物标志物和活血化瘀作用靶点提供客观科学依据。方法1文献研究近40年对中医证型的相关研究,从宏观到微观,从量表研究到实验研究,从以疾病、症状、组织、细胞等为主体,目前已逐渐发展至分子水平、基因水平。检索中国知网、维普网、万方数据、Pubmed和Web of Science数据库,获取中医证型相关基因组学研究(对具体疾病、证型、干预手段无限制)。研究范围包括临床试验、动物及细胞实验,使用基因芯片、高通量测序等组学技术,研究SNP、DNA、mRNA、ncRNA(包括 miRNA、lncRNA、circularRNA)等基因组/转录组学指标。提取纳入研究的出版资料、研究内容(包括研究物种、研究疾病、涉及证型、是否干预)、组学技术(包括检测指标、检测技术、使用技术最大读数、差异判断标准、差异基因个数、是否进行验证、进一步分析方法)以及研究特点进行文献综述研究,总结相关研究趋势,并为本研究的研究思路与方法提供参考。2实验研究使用高通量测序技术,分别检测冠心病血淤证、冠心病非血瘀证和正常对照人群外周血有核细胞中lncRNA、miRNA和mRNA表达情况,使用生物信息学算法筛选出冠心病血瘀证与正常对照、冠心病血淤证与冠心病非血淤证之间的差异表达基因,并使用关联分析,获取冠心病血瘀证相关的lncRNA、miRNA、mRNA表达谱。对获得的差异基因进行聚类分析、主成分分析、GO和KEGG功能通路分析。通过starBase在线靶基因预测数据库和基因测序表达量相关分析,获取基因间调控关系,构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。在另一匹配队列中对基因调控网络中的关键节点进行qRT-PCR验证。使用慢病毒介导的shRNA转染技术,对冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络中关键基因进行干扰,检测其上下游调控节点表达水平,对lncRNA、miRNA、mRNA之间的调控作用及该基因网络进行验证,从转录组调控层面对冠心病血瘀证的证型本质和病理机制进行探索。结果1中医证型相关基因组学研究分析通过检索获得30篇中医证型相关基因组学研究文献,其中中文期刊论文17篇,英文期刊论文13篇,最早发表年份为2005年,最近发表年份为2016年。对纳入的30项研究进行文献综述研究,发现中医证型相关基因组学研究历经十余年,在13种疾病/状态和11种证型中开展,通过基因芯片或高通量测序技术,从DNA/cDNA、mRNA、miRNA、lncRNA和SNP等多个角度对中医证型物质基础、基因表型进行了探索。研究最多疾病为冠心病、脑卒中、乙型肝炎、糖尿病以及衰老;研究最多证型为血瘀证与肾阳虚证(各8项),其次为湿浊中阻证与肝郁脾虚证(各4项)。研究最多指标为mRNA,近年来miRNA或lncRNA联合mRNA进行的研究日益增多。从研究方法与结果来说,中医证型相关基因组学研究目前仍处于发展阶段,如缺乏统一、公认的证型诊断标准或证型造模方法,结果分析仍停留在表层的差异基因筛选,未能进行更深层次的功能分析,未对研究结果进行PCR验证等。中医证型相关基因组学研究在取得一定成果的同时,需要在实验设计、实验方法、研究规划方面提高其合理性、严谨性和科学性,并对研究结果进行深化研究,深入探索差异基因的生物学功能以及作用途径,为中医证型客观化、标准化、探索其物质基础提供科学证据与研究新思路。2冠心病血瘀证丨ncRNA-miRNA-mRNA调控网络研究使用高通量测序技术及生物信息学分析方法,对冠心病血瘀证、冠心病非血瘀证和正常对照进行两两比较和交联比较,最终获得39个lncRNA(3个上调,36个下调),229个miRNA(138个上调,91个下调)和221个mRNA(105个上调,116个下调)在冠心病血瘀证中差异表达。分层聚类分析和主成分分析显示冠心病血淤证与正常对照、冠心病非血淤证与正常对照之间在lncRNA、miRNA和mRNA均有较明显的差异表达基因谱,lncRNA、miRNA和mRNA可将该3组样本区分,各个样本被正确归类。通过对相关基因进行功能与通路分析,发现冠心病血瘀证差异表达基因主要与免疫和炎症相关,如免疫反应的激活信号转导、γγ-干扰素介导的信号通路、T细胞共刺激、白细胞介导的免疫反应、Toll样受体信号通路等。利用starBase和相关分析获得的基因间互作关系显示,冠心病血瘀证相关差异基因间共有76个调控关系,涉及9个lncRNA(均为下调)、31个mRNA(11个上调,20个下调)和24个miRNA(14个上调,10个下调)。根据此调控关系集构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,经过网络拓扑分析和韦恩分析,3个lncRNA(CTA-384D8.35、CTB-114C7.4 和 RP11-567M16.6)和 1 个 miRNA(hsa-miR-3158-3p)被认为是网络中的关键节点。相同人群队列的qRT-PCR验证支持上述结果。挑选基因调控网络中关键节点(CTA-384D8.35和CTB-114C7.4)和miRNA(miR-3196和miR-3656)进行基因干扰,检测受调控的mRNA(NR4A1、EGR1、IER2和IER3),对冠心病血瘀证基因调控网络进行验证。结果显示该网络中主要存在以下调控方式:①LncRNA上调mRNA的表达;②LncRNA下调部分mRNA的表达水平;③miRNA抑制mRNA的表达;④miRNA亦可促进mRNA的表达;⑤lncRNA和miRNA之间存在双向调控模式;⑥lncRNA-miRNA-mRNA的共调控模式。结论冠心病血瘀证存在lncRNA、miRNA、mRNA差异表达基因谱,相关基因功能与涉及通路多与免疫和炎症反应相关。上述差异表达基因间存在相互调控关系,并可依此构建冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。RNAi研究证实了 lncRNA、miRNA、mRNA之间的多向、交联、复杂调控模式,验证了该调控网络的真实性。冠心病血瘀证相关lncRNA-miRNA-mRNA调控网络及其中调控关系的探索研究,为冠心病血瘀证的物质基础研究提供一定的科学基础。
李玉成[3]2008年在《ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控及其机理研究》文中研究说明脂肪组织中的甘油叁酯在维持机体能量平衡过程中起着重要的作用。它的水解是一系列有序调控的过程,在不同的过程中有不同的酶参与。新近发现的脂肪酶ATGL特异性地水解甘油叁酯,是甘油叁酯水解的主要限速酶。同时它与游离脂肪酸的浓度、葡萄糖耐受性及胰岛素敏感性紧密相关。因此,它的表达调控很受关注。脂肪细胞因子leptin可以提高脂肪细胞的脂肪分解,诸多现象表明,ATGL在leptin调控脂解过程中可能发挥着重要的作用。但ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化及其机理至今还没有被直接和系统地研究。因此,本实验以与人类生理生化等方面最为相似的猪为模式动物,采用RT-PCR、细胞培养、甘油和FFA释放量测定、半定量RT-PCR、Western Blot等方法克隆了猪ATGL的全长CDS,研究了ATGL在leptin促脂解中的表达变化,并初步探讨了其机理。取得以下主要结果:1成功克隆了猪ATGL基因全长CDS,长度为1446 bp,GenBank登陆号为EU373817。与GenBank已发表的人和小鼠的ATGL基因进行序列比对,同源性分别为87%和82%,这说明猪ATGL基因与人和小鼠在核苷酸水平有较高的同源性,暗示他们之间具有相似的功能和表达调控。猪ATGL基因全长CDS的克隆为研究ATGL在leptin促脂解过程中的表达变化奠定了一定的基础。2明确了leptin呈浓度依赖性促进猪脂肪细胞的脂解。与对照组相比,5、20和50 ng/mL的Leptin均可显着促进甘油的释放( P< 0.01),并且leptin呈浓度依赖性促进甘油的释放,其中促进甘油最大释放的浓度为50 ng/mL;而与对照组相比,5、20和50 ng/mL的leptin均可降低FFA的释放,但差异不显着( P>0.05)。3从体内和体外两个水平研究了ATGL mRNA和蛋白在leptin介导脂解过程中的表达调控,首次发现了在leptin介导脂解的过程中, ATGL mRNA表达升高的同时却伴随ATGL蛋白表达的下降。在体外猪脂肪细胞上的研究表明,ATGL mRNA的表达随着leptin浓度的增加不断升高,而ATGL的蛋白却不断降低;在活体皮下脂肪组织上的研究表明,ATGL mRNA和蛋白的表达与血清中leptin的水平密切相关,高水平的leptin伴随ATGL mRNA的高表达,但同时伴随ATGL蛋白的低表达。4初步研究了ATGL在Leptin介导脂解过程中的表达调控机理,发现了ATGL在leptin介导脂解中的表达受到JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路和PPARγ的共同调控。JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路的特异性抑制剂AG490和SB205380分别使ATGL mRNA的表达下调35.02%和23.26%,但与对照组相比,都显着提高ATGL蛋白的表达;PPARγ的特异性抑制剂GW9662和激动剂rosiglitazone分别使ATGL mRNA的表达上调9.16%和下调18.26%,并相应地使ATGL蛋白表达显着下调和上调。
于杰[4]2017年在《基于RAS/RAF/ERK信号通路探讨艾灸促进压疮组织血管新生的分子调控机制研究》文中指出目的:明确艾灸促进压疮组织创面愈合的作用;阐明艾灸促进压疮组织血管新生的分子调控机制,为临床艾灸治疗压疮,乃至皮肤溃疡提供理论和实验依据。方法:采用自制压疮造模装置通过缺血-再灌注损伤方式建立2～3期压疮动物模型,将造模成功的70只SD雌性压疮缺血-再灌注损伤模型实验大鼠采用随机数字表法随机分为模型组和艾灸组,每组35只。每组根据干预时间的长短再分为1d、3d、5d、7d、10d五个亚组,每个亚组分别纳入7只实验大鼠。将35只正常健康大鼠不予造模处理,在模拟其他两组大鼠造模部位处给予碘伏处理,采用随机数字表法随机分为1d、3d、5d、7d、10d五个亚组,每个亚组纳入7只大鼠。模型组在模型制备成功后只给予碘伏常规处理,捆绑方式同其他两组。艾灸组在模型制备成功后,先给予碘伏常规处理,而后施以艾灸干预,采用直接艾灸压疮局部,以压疮创面为中心,1cm长度为半径,进行回旋灸操作,其中艾条燃烧端距压疮创面3cm左右。每日艾灸治疗1次,每次持续15min。通过非接触式电子温度仪及时调整艾条燃烧端与压疮创面的距离,使温度计的显示数值控制在(40℃～42℃)的适宜范围内,每0.5min测量一次创面的皮肤表面温度,温度仪探头距离创面中心3cm左右。自造模第5d开始对造模成功的实验大鼠进行干预方法的介入,分别于1d、3d、5d、7d、10d五个时间点取材前对压疮创面进行面积的测定以及创面局部平均血流灌注量的测定。采用HE染色法及透射电镜分别观察压疮创面组织的病理形态学变化及压疮皮肤组织的超微结构。利用激光共聚焦显微镜通过免疫荧光双标染色技术观察各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中CD31+PCNA+(即新生血管)的数量变化。通过免疫组织化学法检测各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中VEGF、RAS、P-ERK1/2蛋白的表达情况。利用实时荧光定量(Real-time PCR)技术从基因层面对各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中VEGF mRNA、VEGFR2 mRNA、RAS mRNA、RAF-1mRNA 以及 ERK mRNA 的表达水平进行检测。通过蛋白质印迹法(WesternBlot)从蛋白层面对各组大鼠在不同时间点压疮创面组织中VEGF、VEGFR2及RAS蛋白表达水平、RAF-1与ERK1/2蛋白的磷酸化水平进行检测。结果:1.各组大鼠在不同时间点压疮创面愈合率比较发现,治疗1d后,各组组间进行压疮创面愈合率比较无明显差异(P>0.05),无统计学意义。与模型组比较,艾灸组在3d、5d、7d、10d四个时间点的创面愈合率均明显高于模型组,同一时间点进行两组组间比较,差异均显着(P<0.01),具有统计学意义。2.压疮损伤出现后,创面局部平均血流灌注量明显升高。经过艾灸干预后,艾灸组组内创面局部平均血流灌注量呈现先降低后升高的趋势,模型组组内趋势与艾灸组大致相同,两组均在7d时降至最低血流灌注量,但艾灸组在10d的创面局部平均血流灌注量已接近正常皮肤血流灌注量,而模型组创面局部平均血流灌注量恢复至正常皮肤血流灌注量所需时间明显超过10d。与空白组比较,模型组在1d～5d叁个时间点碘伏处理前创面局部平均血流灌注量明显升高。模型组在7d～10d两个时间点碘伏处理前创面局部平均血流灌注量明显降低,同一时间点进行两组组间的比较,差异均显着(P<0.01)。与模型组比较,艾灸组在3d、5d两个时间点治疗前创面局部平均血流灌注量明显降低,同一时间点进行两组组间的比较,差异均显着(P<0.01)。艾灸组在1d、7d、10d叁个时间点治疗前创面局部平均血流灌注量明显升高,模型组大鼠在1d～10d五个时间点碘伏处理前与碘伏处理后即刻创面局部平均血流灌注量比较,均无显着性差异。艾灸组大鼠在1d～10d五个时间点治疗前与治疗后即刻创面局部平均血流灌注量比较,治疗后即刻血流灌注量均显着提升,两者间均存在显着性差异。3.通过肉眼观察压疮创面的愈合过程可以发现,压疮大鼠创面中肉芽组织无论是在出现时间点方面,还是在其生长状态方面,艾灸组较模型组均具有明显的优势,艾灸组大鼠压疮创面一般在治疗3d后出现肉芽组织,而模型组在碘伏处理7d左右出现,艾灸组大鼠压疮创面中肉芽组织的生长状态也优于模型组,同时艾灸组大鼠压疮创面收缩速度更快,面积缩小更为明显。通过HE染色观察压疮创面组织病理形态学变化发现,与模型组比较,艾灸组的炎症细胞浸润高峰提前,成纤维细胞出现时间点更早,其增生程度及数量更为明显,肉芽组织出现时间提前,新生血管形成及表皮结构恢复的时间更早。4.通过透射电镜观察艾灸干预对大鼠压疮创面组织超微结构的影响,结果发现,与空白组比较,造模后表皮脱落或萎缩,原有正常皮肤结构发生改变。与模型组比较,艾灸组对于表皮结构的修复具有明显优势,在治疗5d后可见表皮结构,部分完整,部分仅可见基底层及棘层,在7d后可见表皮的完整全层结构。而模型组在碘伏处理10d后少部分表皮结构完整,大部分未见全层表皮结构,仅见基底层及棘层,未见颗粒层、透明层、角质层。艾灸组组内不同时间点,随着艾灸干预刺激的累积,5d～10d组中基底细胞及棘细胞的线粒体的结构、数量、形态由损伤后的肿胀、数量较少、不丰富、结构不清逐渐向修复后的不肿胀、数量较多、丰富、结构清晰的方向发展转变。模型组组内不同时间点,呈现了压疮创面损伤及经碘伏处理后自身修复中的基本病理状态变化,直至碘伏处理10d后,基底细胞及棘细胞的线粒体仍呈肿胀、数量较少、不丰富、大而空的形态特点。在炎性细胞的镜下改变方面发现,艾灸组从1d的大量中性粒细胞浸润,3d中等量的中性粒细胞,5d的不新鲜、陈旧性中性粒细胞,7d吞噬细胞及淋巴细胞,10d的淋巴细胞。模型组在碘伏处理5d后为急性炎症的高度浸润阶段,模型组的炎症细胞浸润期延长。与模型组比较,艾灸组从整体上提前急性炎症浸润的高峰,从整体进程上缩短压疮创面修复时间。5.免疫荧光双标染色结果显示,1d～10d后,与空白组相比,模型组创面组织中CD31+PCNA+(新生血管)数量明显增多,两者组间比较差异均显着(P<0.01),具有统计学意义。1d～7d后,艾灸组压疮创面组织中的CD31+PCNA+(新生血管)数量均高于模型组,但其增高的程度各有不同,由1d的显着→3～5d的极显着→7d的不显着,10d后,模型组的压疮创面组织中CD31+PCNA+(新生血管)数量高于艾灸组,但其增高程度不明显,差异不显着。艾灸组与模型组两组组内CD31+PCNA+(新生血管)均呈先升高,而后降低的趋势,但两组组内高峰出现的时间不同,前者的组内CD31+PCNA+(新生血管)数量高峰出现于治疗5d后,而后者则为碘伏处理7d后。6.免疫组化结果显示,VEGF蛋白在压疮皮肤组织中的阳性表达部位位于细胞浆中,在上皮细胞、巨噬细胞中均有表达。1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平明显升高,3d～5d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平显着升高,两组组间比较差异均显着,7d～10d,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平发生变化,低于模型组,但两组组间比较均无明显差异。RAS蛋白在压疮皮肤组织中的阳性表达部位位于细胞浆中。1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中RAS蛋白表达水平明显降低,3d～10d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中RAS蛋白表达水平显着升高,两组组间比较差异均显着。艾灸组与模型组两组组内RAS蛋白均呈现逐渐升高的趋势。P-ERK1/2蛋白在压疮皮肤组织中的阳性表达部位位于细胞浆中。3d～10d后,与空白组比较,模型组压疮创面组织中P-ERK1/2蛋白表达水平明显升高,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中P-ERK1/2蛋白表达水平均出现不同程度地升高,于3d～5d呈显着增高,7d～10d呈略微升高。艾灸组与模型组两组组内P-ERK1/2蛋白表达均呈现先升高后降低的表达趋势,但两组组内表达高峰值存在区别,艾灸组组内高峰值出现在治疗3d后,而模型组组内高峰值出现在碘伏处理5d后。7.通过Real-time PCR实验结果显示,1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中VEGFmRNA表达水平明显升高,3d～5d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中VEGFmRNA表达水平显着升高,两组组间比较差异均显着,7d～10d,艾灸组压疮创面组织中VEGFmRNA表达水平发生变化,低于模型组,但两组组间比较均无明显差异。VEGFR2 mRNA结果与VEGF mRNA整体上相似,体现了 VEGF发挥生物学效应的前提是与其受体结合,VEGF与受体VEGFR2发生特异性结合,从而促进血管内皮细胞的增殖、分裂以及新生血管的形成。1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中RAS mRNA表达水平明显降低,3d～10d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中RAS mRNA表达水平显着升高,分别进行两组组间比较,差异均显着。艾灸组与模型组组内RAS mRNA表达均呈现逐渐升高的趋势。当压疮损伤出现后,创面组织中RAF-1mRNA、ERKmRNA表达水平均未见明显变化,经过艾灸干预后,各组组间均未见明显变化。8.通过WesternBlot结果显示,1d～10d五个时间点,与空白组比较,模型组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平明显升高,3d～5d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平显着升高,两组组间比较差异均显着,7d～10d,艾灸组压疮创面组织中VEGF蛋白表达水平发生变化,低于模型组,但两组组间比较均无明显差异。VEGFR2蛋白结果与VEGF蛋白整体上相似,体现了 VEGF发挥生物学效应的前提是与其受体结合,VEGF与受体VEGFR2发生特异性结合,从而促进血管内皮细胞的增殖、分裂以及新生血管的形成。1d～10d,与空白组比较,模型组压疮创面组织中RAS蛋白、磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平均明显降低,3d～10d后,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中RAS蛋白、磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平显着升高,两组组间比较差异均显着。模型组组内RAS蛋白、磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平均呈现逐渐升高的趋势,艾灸组组内RAS蛋白亦呈逐渐升高趋势,磷酸化RAF-1(ser338)/总RAF-1表达水平则为1d-7d升高,7d～10d降低。3d～10d后,与空白组比较,模型组压疮创面组织中磷酸化ERK1/2/总ERK1/2表达水平明显升高,与模型组比较,经过艾灸干预后,艾灸组压疮创面组织中磷酸化ERK1/2/总ERK1/2表达水平均出现不同程度地升高,于3d～5d呈显着增高,7d～10d呈略微升高。艾灸组与模型组两组组内磷酸化ERK1/2/总ERK1/2表达水平均呈现先升高后降低的表达趋势,但两组组内表达高峰值存在区别,艾灸组组内高峰值出现在治疗3d后,而模型组组内高峰值出现在碘伏处理5d后。结论:1.艾灸能够有效促进压疮创面的愈合。2.艾灸对压疮组织创面局部平均血流灌注量具有双向良性调整作用。艾灸干预即刻后能够显着增加压疮组织创面局部平均血流灌注量。3.艾灸干预能够有效促进血管内皮细胞的增殖,增加新生血管的数量,促进压疮组织的血管新生。4.艾灸干预分别从蛋白、基因层面上调压疮创面组织中VEGF及其受体VEGFR2的表达水平。5.RAS/RAF/ERK信号通路参与压疮的修复过程,艾灸干预通过激活RAS/RAF/ERK信号通路,上调RAS蛋白及其mRNA的表达水平、促进RAF-1蛋白与ERK1/2蛋白的磷酸化水平,增强RAS/RAF/ERK信号通路的活性,发挥促进血管内皮细胞增殖的作用。6.RAS/RAF/ERK信号通路是艾灸干预作用的重要靶点,可能是艾灸促进压疮组织血管新生的作用机制之一。
曹春莉[5]2016年在《miRNA-21在伊马替尼敏感型胃肠间质瘤中的表达及通过B淋巴细胞瘤-2基位点作用机制研究》文中认为背景胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是较常见的胃肠道间叶细胞瘤,其发病率占整个胃肠道肿瘤的2%,最初在上个世纪60年代,病理学层定义为平滑肌肿瘤或神经源性肿瘤,直到1983年Mazur研究确定以胃肠道间质瘤命名,其命名主要是依据肿瘤的分化特征而提出。胃肠道间质瘤多见于中老年人,40岁以下病人极少见,发病中位年龄为50岁到60岁。一般60-70%多发于胃,20%到30%发生在小肠,只有10%以内发生在食管、结肠和直肠。胃肠道间质瘤在CT上主要表现为T1上肿块实质部分呈低信号,与肌肉信号相当,在T2上呈高信号,肿瘤中央可以发现含气的坏死腔和肿瘤钙化的无信号区域,如果肿瘤中央内出现出血,会出现时间不同的混杂信号。胃部的胃肠道间质瘤占胃部肿瘤的2%-3%,发病部位一般位于胃体,胃窦发病率较低,形态大小不一,大者还可以超过30cm,大多数病变肿瘤瘤体可以向胃外生长,或者向腹膜腔蔓延。生长在小肠的胃肠道间质瘤占整个胃肠道间质瘤的20%,全段小肠均可发生,其中30%的病变多发生于十二指肠,空肠病变多于回肠,通常发生在小肠的胃肠道间质瘤,其肿瘤体积较大,恶性程度较高,其病变一般位于肠腔外,病变多为偏心性,有些小肠壁可见像动脉瘤样扩张,其主要机制是肿瘤引起肠管皱缩及神经丛受损,影像学口服造影剂检查多可以发现肠瘘管,向管腔内生长者,表现为肠梗阻；发生于肛门和直肠的胃肠道间质瘤发病率不足十分之一,一旦发生绝大部分为恶性,其中2/3以上恶性程度高,具有侵袭的可能,肿瘤组织多为向肠腔内生长,境界清晰,中心可见坏死病变和囊腔。结肠的胃肠道间质瘤的发病率最低,通常是小肠或胃部的恶性间质瘤瘤体转移到结肠,一般结肠的间质瘤同上,损伤结肠壁,向腹腔蔓延。食管的胃肠道间质瘤占整个胃肠道间质瘤的1/4,患病年龄中位数是63岁,通常恶性程度高,食管的胃肠道间质瘤要与食管的其他病变鉴别,小型的食管肿物,多为食管平滑肌瘤,如果肿瘤体积较大,要与晚期食管癌和淋巴瘤或者纵膈肿瘤侵犯食管鉴别。胃肠道间质瘤转移以肝脏转移最常见,转移灶CT扫描,可呈低密度,也可呈等密度,转移灶的坏死病变较多,但是坏死后很少出血,如果胃肠道间质瘤出现转移,多表现为全腹部多发性肿块,病变一般较小,境界清楚,一般不出现肠系膜的侵润和牵拉。胃肠道间质瘤淋巴结转移很少见,因此如果在肿瘤组织周围间淋巴结肿大,则胃肠道间质瘤的可能性不大,胃肠道间质瘤肺转移很少见,因此,胃肠道间质瘤一般是沿着静脉转移,这个特征也是胃肠道间质瘤与平滑肌肉瘤的主要不同之处。从病理组织学上看,瘤细胞狭长,呈波浪状,胞浆略嗜酸性,细胞界限不清,核梭形,两端细。胃肠道间质细胞瘤最具特征的标记物是CD117,主要应用免疫组织化学的方法即可检测,还有部分胃肠道间质细胞瘤还可以表达CD34,正常胃肠道肌层内CAJAL细胞核肥大细胞CD117阳性,而平滑肌细胞、血管平滑肌细胞核神经纤维不表达CD117。胃肠道间质瘤细胞起源于胃肠壁肌层的卡哈尔间质细胞,其主要作用是胃肠道神经丛节律起搏细胞。电镜下,瘤细胞表面有较多树突状突起,胞浆内有少量细丝和神经内分泌颗粒,与CAJAL细胞相似。通常胃肠道间质细胞瘤在胃部直径大于5.5cm,在肠部大于4cm,核分裂现象在胃部大于5/50HPE,在肠道大于1/50 HPE,肿瘤表现为坏死样外观,核异型性明显,肿瘤细胞丰富,生长活跃,上皮样细胞呈细胞巢或腺泡样排列一般恶性化程度高,但现今尚无有效的指标能有预测胃肠道间质细胞瘤的转移和恶化行为,有些专家推荐使用肿瘤的大小和核分裂作为转移的危险性评估指标,但是方法尚不可靠。胃肠道间质细胞瘤长期以来一直被诊断为平滑肌肉瘤或恶性神经鞘瘤,随着免疫组织化学、电子显微镜和分子生物学技术的发展,发现该肿瘤存在C-kit基因突变及蛋白表达,才有突破新进展,组织学上多有未分化或多功的梭形细胞或上皮样细胞组成。间质瘤在性质上与其他肿瘤不甚相同,从其生物学性质上可分为良性、交界性和恶性肿瘤。胃肠道间质瘤恶性的表现主要是肿瘤具有浸润侵蚀性,常常在基层侵润或粘膜层侵润,或者发现肿瘤有远处脏器和淋巴结转移。潜在的恶性的指标有肿瘤直径大于5cm,核分裂相大于5/50hpf,肿瘤组织内出现坏死,肿瘤细胞有明显的核异型性。我们通常应用以下依据来判定胃肠道间质瘤的良恶性,具备恶性指标1项或2项以上潜在恶性指标诊断为恶性胃肠道间质瘤,如果仅仅有一项潜在的恶性指标为交界性胃肠道间质瘤,如果没有上述指标即可诊断为良性。胃肠道平滑肌瘤与间质瘤的区别主要有：胃肠道平滑肌瘤一般发病年龄较轻,瘤细胞较稀少,形态单一,A-Mat(+),CD 117(-),CD34(-),无C-KIT基因突变,而胃肠道间质瘤一般发病年龄大,瘤细胞形态多变,排列结构多样,A-Mat(-),CD 117(+),CD34(+),有C-KIT基因突变。胃肠道间质瘤目前主要临床治疗方法,以外科治疗为主,由于微创技术的发展,内镜下ESD的剥离越来越让到广大患者接受。完整切除是手术疗效提高的表现,在手术中无瘤操作,并在术中要防止肿瘤破溃,术后复发或不能手术的病人一般可以选择肿瘤分子靶向药物的治疗。胃肠道间质瘤的大小其直径可以从1-2cm大到20cm,一般呈局限性生长,多数肿瘤没有完整的包膜,有时具有假包膜,恶性化程度高,有时伴有坏死局灶性出血和肿瘤组织破裂,有时可以穿破粘膜层导致消化道溃疡。消化道间质瘤一般见于粘膜下层,通常占整个间质瘤的百分之六十,比例最少的是局限于肌层,仅仅占整个胃肠道间质瘤的十分之一。一般胃肠道间质瘤外形呈息肉状,息肉常伴有溃疡,多向胃肠道腔内生长,向浆膜层生长一般形成浆膜下肿瘤。位于腹腔内的间质细胞瘤肿块一般体积较大,粘膜面一般有溃疡形成,可有出血、坏死粘液和囊性变等等,切开肿瘤呈结节状或分叶状,切面呈红色或灰白色,内部坚硬。手术切除是唯一可以治愈早期胃肠道间质瘤的方式,一般可以做局部切除和楔形切除,一般切除的范围要大于肿瘤包膜外2厘米,胃肠道间质瘤高危患者手术后复发率较高,据相关报道,复发率可以到达80-91%,约85%的患者在手术后2-3年可以复发,通常复发的过程还伴有肝脏的转移,一旦复发,其再治疗的可能性就很低,据相关研究,即便再次手术切除,也很难提高患者的生存率,如果胃肠道间质瘤发现较早,包膜完整没有转移,其手术切除后5年生存率达到一半,如果切除时包膜不完整,向粘膜层侵袭,或者切除不彻底,其手术切除后5年生存率小于35%,不能切除者总生存时间为一年。伊马替尼为蛋白络氨酸激酶小分子抑制剂,而络氨酸激酶能催化底物磷酸化,在细胞内传递信号,激发细胞增殖,络氨酸激酶的活性部位均有ATP结合口袋,络氨酸激酶的活性即是通过催化ATP转移磷酸基团到底物的络氨酸残基上,也就是通常所说的激酶的磷酸化。伊马替尼第一个适应症是慢性粒细胞性白血病,而第二个适应症是胃肠道间质瘤。伊马替尼能够选择性的使PDGERA受体络氨酸激酶抑制,对于胃肠道间质瘤中晚期或者手术不能治疗,或存在恶性转移危险的患者的预防性治疗,对于提高患者的预后和延长生存时间具有重要的意义。伊马替尼耐药主要是由于胃肠道间质细胞瘤表达野生型的KIT或者是外显子9突变,其主要机制是突变导致KIT结构的稳定,阻止了其与伊马替尼的结合。伊马替尼作为选择性KITPDGFRA受体络氨酸激酶抑制剂,主要应用于不能手术切除,或者切除后转移的病例,或者是切除后复发的病患,或者是完整切除后预防性的治疗,以防止胃肠道间质瘤的复发。通常,如果手术治疗后发现以下现象则高度怀疑复发,首先是在切除部位或者是原发灶又发现新的肿瘤组织,或者是原发灶的周围出现远处转移,或者是患者正在实施伊马替尼治疗的过程中发现肿瘤灶还在逐渐增大,影像学诊断发现,原发灶密度增高。如果能够直接进行手术治疗的,要尽早手术切除,如果不能进行手术治疗的,要先行伊马替尼治疗后如果可能再行手术治疗。有研究表明,手术联合伊马替尼及化疗药物联合治疗可以显着的提高胃肠道间质细胞瘤的预后。但是在伊马替尼治疗过程中,胃肠道间质瘤的耐药率较高,甚至高到70%,有些患者表现为治疗之初就耐药,一般发生率为20%,通常伊马替尼在连续性用药治疗胃肠道间质瘤半年后发现肿瘤继续生长,而且呈多病灶生长,一般患者耐药其基因型多表现为GIST野生型KIT的外显子9突变；继发性耐药现在学术界主要的观点是突变导致KIT的稳定,KIT的稳定阻滞了KIT结构域与伊马替尼的结合,还有其他突变的部位是外显子12、14和17。miRNA最早是在1993年由LEE在线虫中发现了长约22nt的非编码单链小RNA-lin-4,该实验首次发现由不编码蛋白质的单链小分子RNA能够调控生物体发育的过程,后来将该小分子RNA命名为miRNA,2000年有学者又在线虫中发现了另外一个miRNA基因称异时开关基因let-7,发现其主要功能是控制线虫向成虫生长,2002年,CALIN在临床慢性淋巴细胞白血病患者血液中发现miRNA部分缺失或者表达下降,2005年,有研究发现miRNA与某些肿瘤的发生相关,也有发现miRNA与特定的靶基因例如MiR15/16h和let-7作用对于癌症的发生发展发挥重要的作用,研制新的癌症药物基因靶点具有重要的意义和价值。miRNA分子链较小,一般为19-25个核苷酸分子的单链小RNA分子,成熟的miRNA的5’端有磷酸基团,3’端为羟基,miRNA主要在DNA的修复过程中抑制或组织正常细胞DNA修复产生致癌作用,同时抑制或阻止癌细胞DNA修复达到治疗的效果。miRNA基因序列和位置高度保守,表达和结构多样性,可以作为mRNA的调节因子,主要对细胞发育、细胞凋亡、细胞分化及细胞增殖起到调节作用,同时与应激反应、病毒感染、脂肪代谢及癌症和心血管疾病均有相关性,人类基因组中有一半以上的已知miRNA成簇表达,其表达彼此相关。miRNA分子序列短小,其基因组中存在较多的互补序列,在不同的生物体内与靶基因结合的方式也不一样,一般与多种蛋白结合,至今,miRBase公布miRNA的总数大约为3200余种,一般现阶段miRNA的检测主要通过基因克隆或者生物学筛选所得。miRNA对于癌症相关的作用主要表现在,影响癌基因的表达,主要是通过let-7miRNA调节RAS蛋白的表达水平,其次,通过研究慢性淋巴细胞性白血病发现,miR-15/16靶向调节BCL2而诱导肿瘤细胞的凋亡,再次,通过C-myc在激活E2F1介导的转录同时,通过miR-17/20也减少E2F1的表达,最后,有研究报道可以通过miRNA表达谱用于人类肿瘤的分类,miRNA作为肿瘤的分类依据,不但能够显示区分正常和肿瘤,还可以进一步区分不同的肿瘤组织类型和正常组织类型。miRNA的检测方法是对miRNA在生物细胞调控作用研究的关键和基础,如何快速、准确的定量检测miRNA是揭示细胞生长、凋亡、死亡或者异常生长的关键。通常的方法是Northern blotting法,全部的生物信息学分析都是需要Northern blotting法来验证和确认。但该方法灵敏度低,检测效率低。RT-PCR或者称为反转录PCR法也可以检测miRNA前体的表达含量,但前体的表达与成熟miRNA的表达往往水平不等,实时荧光定量PCR能够较为精确的定量分析miRNA的表达,通常可以通过延生引物的方法,在5’端进行标记,可以定量的测量丰度较低的RNA的含量。原位杂交技术可以确定miRNA的空间结构及表达的差异。但近期的研究我们也发现,新的miRNA发现频率越来越高,但是miRNA的功能研究相对缓慢,主要是由于miRNA作用靶点难以确认。大量的研究发现癌症组织存在异常的miRNA, miRNA在癌症的发生发展过程中起到特定的调节作用,尤其是在抑制某类蛋白质表达方面起到重要的作用。研究miRNA对于癌症的治疗具有重大意义。尤其是近年来发现,癌症的发生与某些蛋白关系密切,这类蛋白能激活癌基因,因此miRNA与蛋白质的结构域相关,目前RNAi技术可以在体外培养细胞中沉默内源性基因,利用RNAi技术降低恶性癌症细胞中癌基因成为肿瘤药物治疗的新的思路。因此,未来如果能够进一步深入的研究miRNA在生物发育中的作用,揭示其基因表达调控机制和生命发展过程,并通过对肿瘤发生发展中作用机制的研究,为进一步认识肿瘤的起因,为肿瘤的诊断和靶向治疗奠定基础。近年来对于miRNA-21与癌症的研究较多,大量的实时荧光PCR实验或者免疫印迹实验发现,miRNA-21在多种癌症组织或细胞中阳性表达,主要包括神经胶质细胞瘤,消化系统肿瘤(胃癌,食管癌,胆管癌,肝癌、口腔癌)生殖系统癌症(卵巢癌、宫颈癌)等等。如上所说miRNA-21的致癌机制尚不清楚,主要是由于其作用靶点难以确认,但近年来随着利用Northern blotting法,全部的生物信息学分析技术的深入研究,现主要发现miRNA-21靶基因主要有33个的位点,其主要的位点有PTEN,主要的作用是抑制细胞迁移。增殖等,NFTB,主要发挥转录抑制因子作用,STAT3,调控转录,细胞运动等。APAF-1,调控细胞凋亡等。以上因子都是确认由miRNA-21直接的靶基因,以上因子的动态变化都受miRNA-21的直接调控。但是也有一些不是miRNA-21的直接靶基因,但也受miRNA-21的调控,例如,BCL-2和TIMP3等,他们往往通过别的介导因子从而受miRNA-21的调控。以上因子的调控虽然都与miRNA-21相关,但是许多过程也不仅仅和miRNA-21相关,是1miRNA-21协同其他miRNA共同作用调控,因此,miRNA-21的调控过程是较为复杂的网络结构,有学者研究对酒精敏感的靶基因,发现JAG-1是miRNA-153, miRNA-335和miRNA-21共同的基因靶点,单独敲除其中的一项,都不会影响神经细胞对酒精的敏感性。miRNA-21的表达过程通常是在细胞核内由RNA聚合酶生成转录前体,通过加工成发卡结构转运到细胞质,最后剪切成熟。上个世纪八十年代末,由日本人十本等首先从非霍其金淋巴瘤细胞染色体中分离出Bcl-2基因,而该基因的存在与Bcl-2蛋白的表达相关。Bcl-2蛋白大小为26KD,其中含有BH4同源结构,该结构与抗凋亡蛋白的结构类似,BH3结构与其他促凋亡的蛋白结构类似,因此Bcl-2蛋白的作用与其两个同源结构的比例相关,抗凋亡结构的比例高,Bcl-2蛋白就呈现抗凋亡的作用,反之亦然。Bcl-2主要存在于线粒体外膜,核膜和内质网膜上。Bcl-2蛋白家族分为两类,一类是抗凋亡蛋白,例如Bcl-XL, Bcl-W,A1等,另一类促凋亡的蛋白有BAX,BAK等。通常Bcl-2家族分为叁大类,抗凋亡的Bcl-2蛋白主要结构中包含BH1/BH2/BH3/BH4等,直接或间接抑制细胞死亡,促凋亡蛋白BAX,BAK,其结构中主要含有BH1/BH2/BH3,具有促进细胞凋亡,抑制癌细胞生成的作用。BH3-only,其主要的功能为增敏剂和诱导剂的作用,既可以促进凋亡作用,又可以促进抑制凋亡的作用。Bcl-2的抑制凋亡作用主要有五个通路,分别为维持细胞钙的稳定状态,阻止线粒体膜电位下降；抑制促凋亡BAX/BAK的细胞毒性作用,维持二者的稳定性,阻止其二聚体的形成。保护线粒体膜的功能抑制线粒体释放细胞色素C、AIF等促凋亡蛋白的释放,同时可以减少细胞氧化和氧化物的形成。而以上的分析说明,对于miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤样本的表达情况尚未有相关报道,探索miRNA-21的表达与伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤临床病理特征的相关性尚未有相关研究,探索研究的miRNA-21与Bcl-2在胃肠道间质细胞瘤的相互关系及作用机制,为进一步研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤中的作用基因靶点提供新的实验证据,而胃肠道间质细胞瘤的发生、发展均较为隐匿,药物治疗效果不很理想,因此,临床急需对于胃肠道间质细胞瘤相关发生发展机制进行深入研究,为开发靶向治疗药物,提高其治疗效果,减少病患痛苦提供新的思路和方法。目的本文预通过研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤样本的表达情况,探索miRNA-21的表达与伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤临床病理特征的相关性,为寻找伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤治疗新的药物靶点提供有效的基础实验研究,我们又进一步研究的miRNA-21与Bcl-2在胃肠道间质细胞瘤的相互关系及作用机制,为进一步研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤中的作用基因靶点提供新的实验证据,其研究成果可以直接应用到胃肠道间质细胞瘤药物开发和临床治疗,无论是对于提高胃肠道间质细胞瘤的治疗效果,降低其患者医疗花费和社会家庭的负担均具有重大意义。为其相关miRNA-21与Bcl-2靶点的抗癌药物的开发在临床应用的进一步推广提供科学依据。方法1.胃肠道间质瘤组织样本获取,胃肠道间质瘤T1细胞培养我们收集了2013年10月至2015年10月期间,在内蒙古医科大学附属医院及广州南方医科大学南方医院就诊并诊断为胃肠道间质瘤的患者31例,整个实验过程均经内蒙古医科大学附属医院及广州南方医科大学南方医院伦理委员会审核通过,全部患者在进行标本获取前均签署知情同意书,收集的病例标本我们统计了病患的性别、年龄、临床表现、肿瘤位置,大小及其病理分型。于Cosmo Bio Co. Ltd (Tokyo, Japan)公司购买胃肠道间质瘤T1细胞,细胞用DMEM配方其主要组成为细胞溶液中添加10%的胎牛血清,1% v/v的青霉素和1%v/v的链霉素(Ameresco, Framingham, MA, USA).将细胞种植在培养瓶中,在5% CO2、370C的加湿培养箱中进行培养。将浓度为85%的胃肠道间质瘤T1细胞在加有2%小牛血清和5uM的伊马替尼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的DMEM培养液中共培养,培养的细胞作为伊马替尼药物干扰细胞组。我们利用Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)试剂盒转染生成含有非特异靶标miRNA和含有miRNA-21的85%胃肠道间质瘤细胞,并在DMEM培养液中共培养。2.RNA的提取与定量测量利用TRIzol试剂盒(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)从胃肠道间质瘤细胞,正常胃组织作为照组组标本中提取总mRNA,并滴加核糖核酸酶抑制剂SUPERase·InTM(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)lul,通过RT-qPCR对目标基因进行扩增,42℃C,5 min,接着95℃,10秒钟逆转录,95℃,5秒,60 ℃,20秒,共40个循环。用Takara One Step RT-PCT kit (Takara, Tokyo, Japan)试剂盒定量分析Bcl-2 mRNA和miRNA-21的含量。胃肠道间质瘤细胞的miRNA用miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX,USA)试剂盒进行提取,利用1nirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)试剂盒和Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR仪对miRNA-21的表达进行定量测量,Bcl-2 or miRNA-21倍数变化以β-actin orU6为内参采用△△Ct= ACt(stimulus)-ACt(solvent), ACt= Ct (target gene)-Ct(contol gene)公式进行计算,基础表达水平利用2-(△Ct)公式进行计算3.荧光素酶印迹实验我们用荧光素酶把载体插入叁个相同的miRNA-21的靶位点Bcl-2基因3’UTR位点,利用脂质体2000将Bcl-2位点和Bcl-2mut位点转染到浓度为85%胃肠道间质瘤细胞,同时将30和60 nM miRNA-21和对照小RNA进行转染,转染共培养24小时后利用双荧光素试剂盒(Promega, Madison, WI, USA)进行检测实验。4.细胞增殖实验、MTT比色法和细胞凋亡实验胃肠道间质瘤T1细胞种植在12孔细胞培养板,每个孔有300个细胞,12小时后培养板分为两组,第一组加入0 μM伊马替尼,第二组加入5μM伊马替尼,并且将60 nM非特异靶标miRNA和miRNA-21对细胞进行转染,转染后将细胞培养于37摄氏度5%C02箱中96个小时,(0.005%)结晶紫染色胃肠道间质瘤细胞30分钟,记录克隆数量。用MTT比色法主要检测处理后的胃肠道间质瘤细胞活力,其过程简单描述如下,将胃肠道间质瘤细胞种植于96孔培养板上,12小时后培养板分为两组,第一组加入0μM伊马替尼,第二组加入5 μM伊马替尼,并且将60 nM非特异靶标miRNA和miRNA-21对细胞进行转染,转染后将细胞培养于37摄氏度5%C02箱中48个小时,细胞培养液换成MTT溶液在37摄氏度培养2小时,在分光光度计上在450nm的光波下测量其光密度。细胞活性主要测量胃肠道间质瘤细胞和对照组细胞活性相对比值,用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abeam, Cambridge, UK)试剂盒对胃肠道间质瘤细胞进行染色,通过流式细胞仪检测胃肠道间质瘤细胞在伊马替尼处理miRNA转染后细胞凋亡水平结果1.胃肠道间质瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的含量及两者的相关性分析我们分析比较了全部31例胃肠道间质瘤病例特征(表1示),在胃肠道间质瘤细胞内,定量测量了miRNA-21和Bcl-2表达,其中miRNA-21/U6相对量为0.6729±0.07632,其含量显着低于正常胃组织细胞的含量(1.0000±0.1085)差异具有统计学意义(p=0.0129),而Bcl-2 mRNA水平在胃肠道间质瘤组中(1.500±0.1484)显着性高于正常胃组织细胞的含量(1.0000±0.1085)(p=0.0103),差异具有统计学意义。接着比较了miRNA-21和Bcl-2 mRNA之间的相关性,我们发现miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈显着性负相关关系,(R2=0.2450,p=0.0046),总之,在胃肠道间质瘤细胞中,miRNA-21水平下调,Bcl-2上调,两者呈显着性负相关。2.在胃肠道间质瘤中iRNA-21的作用位点Bcl-2的3’端非编码区与Bcl-2上调的机制的关系为了进一步研究在胃肠道间质瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的相关性及Bcl-2上调的机制,我们通过对胃肠道间质瘤-TI细胞转染miRNA-21 mimics,然后测量Bcl-2的表达。表2显示,与转染miRNA相比,转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞miRNA-21水平显着上调(p<0.001 or p<0.0001 for 30or 60 nM),而与miRNA-21相反,Bcl-2 mRNA的水平在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显着性下调,(p<0.05 or p<0.01 for the 30 or 60 nM,).同样,我们在蛋白水平也证实了Bcl-2蛋白在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显着性下调(p<0.05 or p<0.01).为了证实否是由于miRNA-21作用于Bcl-2的3’非编码区,而使Bcl-2的下调,我们在转染miRNA-21 mimics和转染对照miRNA的胃肠间质瘤细胞进行比较,采用了荧光素酶活性检测来研究Bcl-2的3’非编码区质粒报告和单纯Bcl-2的3’非编码区报告,图3为质粒报告和Bcl-2mut报告结构流程图,荧光素酶报告显示,与对照组转染RNA的胃肠间质瘤细胞比较,转染30和60 nMmiRNA-21 mimics的胃肠间质瘤细胞荧光素酶活性显着降低(p<0.001 for 30 or 60nM),而Bcl-2mut报告miRNA-21 mimics并无降低荧光素酶,以上研究证实了在胃肠间质瘤细胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非编码区,而使Bcl-2的下调。3.miRNA-21可以使胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼敏感我们采用克隆实验进一步验证胃肠道间质瘤细胞中miRNA-21是否能使细胞对伊马替尼治疗敏感,5 μM伊马替尼显着降低胃肠道间质瘤细胞克隆(p<0.01),同样,与对照组转染miR的胃肠道间质瘤细胞比较,5μM伊马替尼显着降低转染60 nM miR-21 mimics胃肠道间质瘤细胞克隆(p<0.001,p<0.05).,同时,我们检测了转染60 nM miR-21 mimics和miR Control对照的并用伊马替尼处理的胃肠道间质瘤细胞的活性和细胞凋亡率,转染60 nM miR-21 mimics和miR Control对照的并用胃肠道间质瘤细胞细胞活性无差异,而转染60nM miR-21 mimics和miR Control对照的并用5μM伊马替尼处理24或48小时候,胃肠道间质瘤细胞细胞活性显着性降低。(p<0.05 or p<0.01),转染60 nMmiR-21 mimics并用伊马替尼处理的胃肠道间质瘤细胞下降的幅度比miR对照更大(p<0.05伊马替尼处理24小时或48小时),同时我们检测到伊马替尼诱导转染60 nM miR-21 mimics胃肠道间质瘤细胞的凋亡,(p<0.05伊马替尼处理24小时或48小时),因此,miRNA-21可使胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼药物的敏感性增强。结论1、我们成功的培养了胃肠道间质瘤细胞T1的模型,为进一步研究胃肠道间质瘤细胞的特性奠定了基础。2、miRNA-21在胃肠道间质瘤细胞内表达较正常胃粘膜细胞降低,而Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白在胃肠道间质瘤细胞内比正常胃粘膜细胞增高,miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈显着性负相关关系。3、转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞miRNA-21水平显着上调,而Bcl-2 mRNA的水平在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显着性下调,在蛋白水平也证实了Bcl-2蛋白在转染miRNA-21 mimics后的胃肠道间质瘤-T1细胞显着性下调。4、在胃肠间质瘤细胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非编码区,而使Bcl-2的下调。5、伊马替尼显着降低胃肠道间质瘤细胞克隆。6、伊马替尼显着降低转染miR-21 mimics胃肠道间质瘤细胞克隆。7、转染miR-21 mimics和miR Control对照的并用胃肠道间质瘤细胞细胞活性无差异,而转染miR-21 mimics和niR Control对照的并用伊马替尼处理可以使胃肠道间质瘤细胞细胞活性显着性降低。因此本文通过研究miRNA-21在胃肠道间质细胞瘤样本的表达情况,探索miRNA-21的表达与伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤临床病理特征的相关性,为寻找伊马替尼敏感性胃肠道间质细胞瘤治疗新的药物靶点提供有效的基础实验研究,同时我们发现miRNA-21与Bcl-2在胃肠道间质瘤中的表现显着性负相关,miRNA-21通过作用于Bcl-2的3’非编码区使其下调,并且miRNA-21可提高胃肠道间质瘤细胞对伊马替尼的敏感性。本研究其研究成果可以直接应用到胃肠道间质细胞瘤药物开发和临床治疗,无论是对于提高胃肠道间质细胞瘤的治疗效果,降低其患者医疗花费和社会家庭的负担均具有重大意义。
田玫[6]2016年在《子痫前期中PD-1/PD-L1信号通路对Treg/Th17免疫平衡调控的机制研究》文中进行了进一步梳理第一部分PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγt在子痫前期患者胎盘组织中表达的研究目的：通过检测PD-1与其配体PD-L1,以及Treg和Th17细胞的特异性核转录因子Foxp3和RORγt在子痫前期患者和正常孕妇胎盘组织中的表达水平及其差异,探讨PD-1/PD-Ll信号通路在子痫前期发病机制中的作用。方法：以正常晚孕妇女为对照组(n=16),临床确诊为子痫前期的患者为研究对象(n=10)。收集两组孕妇的胎盘,采用免疫组化法检测胎盘中PD-1、PD-L1、 Foxp3和RORγt蛋白的表达,荧光定量PCR法和Western blot法分别检测胎盘中PD-1、PD-L1、Foxp3和RORyγt mRNA和蛋白表达水平。结果：1.PD-1、PD-L1、Foxp3和RORγ蛋白在子痫前期患者和正常孕妇的胎盘组织中均有表达,PD-1和PD-L1主要位于胎盘绒毛滋养细胞中,主要在细胞浆和细胞膜中表达；Foxp3和RORγt主要位于胎盘绒毛滋养细胞及绒毛间质细胞中,主要在细胞核和细胞浆中表达。2.与正常妊娠组相比,子痫前期组胎盘中PD-1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PD-L1 mRNA表达水平明显降低(P<0.05),Foxp3 mRNA表达水平明显降低(P<0.01),RORγt mRNA表达水平明显升高(P<0.05)。3.与正常妊娠组相比,子痫前期组胎盘中PD-1蛋白表达量明显降低(P<0.01),PD-L1蛋白表达量明显降低(P<0.01),Foxp3蛋白表达量明显降低(P<0.01),RORγt蛋白表达量明显升高(P<0.01)。结论：胎盘组织中PD-1和PD-L1主要表达于绒毛滋养细胞,子痫前期患者胎盘中Foxp3表达水平明显降低,RORγt表达水平明显升高,提示Treg/Th17免疫失衡可能在子痫前期中发挥作用,PD-1和PD-L1表达水平的下降可能与子痫前期的发生有关。第二部分PD-L1 Fc活化PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期样大鼠的治疗效应及分子机制研究目的：采用一氧化氮合成酶抑制剂-亚硝基左旋精氨酸甲酯(L-NG-Nitroarginine Methyl Ester, L-NAME)建立子痫前期样大鼠模型,从孕鼠血压、尿蛋白、体重增长、肝肾功能、外周血及胎盘中Treg/Th17细胞平衡的改变和子代结局等方面评价PD-L1 Fc融合蛋白在治疗子痫前期样大鼠中的疗效,并进一步探讨其作用机制。方法：1.将20只SD雌鼠随机分为4组：正常妊娠组、子痫前期样组、硫酸镁(MgSO4)治疗组及PD-L1 Fc治疗组,每组5只大鼠。后叁组分别给予皮下注射L-NAME建立子痫前期样大鼠模型。在妊娠第16天,分别给予前两组生理盐水,后两组分别给予MgSO4和PD-L1 Fc融合蛋白,均为皮下注射给药方式。2.在大鼠妊娠前、妊娠后隔日采用无创大鼠尾动脉测压仪测量大鼠血压,收集妊娠前,妊娠第10、17、20天的24小时尿液进行尿蛋白定量分析；从妊娠第2天开始,每隔一日称量大鼠体重,至妊娠第21天。3.妊娠第21天,取母鼠肝肾组织,进行HE染色及分析；取母鼠脾脏,采用流式细胞技术检测脾脏淋巴细胞中Treg和Th17细胞的数量。4.免疫荧光法检测胎盘Foxp3、RORγt蛋白的表达。5.荧光定量PCR及Western blot法检测PD-1/PD-L1信号通路相关分子mRNA及蛋白的表达。6.计数仔鼠数量和胚胎吸收率,称量仔鼠及胎盘重量,测量仔鼠体长。结果：1.正常妊娠组大鼠在整个孕期收缩压较稳定,妊娠第16天为116.0±1.581 mmHg;大鼠注射L-NAME后收缩压升高,妊娠第16天时为138.8 ±1.643 mmHg,明显高于正常妊娠组(P<0.001)。子痫前期样组的收缩压从妊娠第14天开始一直持续高位到妊娠结束,MgSO4治疗组和PD-L1 Fc治疗组的收缩压在治疗后下降,MgSO4的治疗效果迅速但短暂,PD-L1 Fc的治疗效果稳定且持久,降压效果可持续到妊娠第18天。2.注射L-NAME后,子痫前期样大鼠的尿蛋白明显升高(P<0.001),MgSO4治疗对此无明显改善作用,经过PD-L1 Fc治疗后,大鼠在妊娠第20天时尿蛋白水平明显降低(P<0.05)。与正常妊娠组相比,子痫前期样大鼠组在妊娠期间体重增长减少(P<0.05),PD-L1 Fc治疗后体重增长有相对升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。子痫前期样大鼠的肝肾病理损伤评分相比正常妊娠组均显着升高(P<0.001,P<0.001),PD-L1 Fc治疗组的肝肾病理损伤评分相比其他造模组均明显下降。3.与正常妊娠组相比,子痫前期样大鼠组外周中Treg细胞比例明显下降(P<0.01),Th17细胞比例明显增加(P<0.01),Treg/Th17比例明显下降(P<0.01),PD-L1Fc治疗后Th17细胞比例明显降低(P<0.01),Treg/Th17比例明显上升(P<0.01)。4.免疫荧光结果显示Foxp3、RORyt蛋白在胎盘上均有表达,与子痫前期样大鼠组相比,PD-L1 Fc治疗组胎盘上Foxp3 mRNA表达水平升高(P<0.05),RORyt mRNA表达量降低(P<0.01), PD-1、PD-L1 mRNA表达水平也分别升高(P<0.05,P<0.05)。PD-L1 Fc治疗后,PI3K/AKT/mTOR mRNA表达水平下降,PTEN mRNA表达水平升高。蛋白检测结果显示上述分子的蛋白水平变化与mRNA表达水平变化一致。5.子痫前期样大鼠的仔鼠表现为：肢体畸形,体重较轻,体长较短。与正常妊娠组相比,子痫前期样大鼠的胚胎吸收率明显增加(P<0.01),PD-L1 Fc对仔鼠发育的影响主要表现为仔鼠体重和体长有增加趋势,胚胎吸收率下降,与正常妊娠组相比无明显差异,胎盘重量明显增加(P<0.05)。结论：PD-L1 Fc融合蛋白可以改善L-NAME诱导的子痫前期样大鼠模型的临床症状,且治疗效果优于传统治疗药物MgSO4。PD-L1 Fc融合蛋白可以逆转大鼠外周和胎盘局部Treg/Th17细胞免疫失衡,这种调控作用主要通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进PTEN的表达实现。此外,PD-L1 Fc融合蛋白表现出对胎儿发育的保护性作用,提示其有潜在的治疗子痫前期的价值。第叁部分PD-1/PD-L1信号通路对子痫前期患者外周血初始CD4+T细胞分化的影响研究目的：通过激活或阻断PD-1/PD-L1信号通路,在不同干预条件下与初始CD4+T(Naive CD4+T)细胞共培养,以阐明PD-1/PD-L1通路对Naive CD4+T细胞分化为Treg和Thl7细胞的影响及作用机制。方法：采集正常晚孕妇女(n=15)和子痫前期患者(n=15)的外周血,采用免疫磁珠法分选出外周血中Naive CD4+T细胞,分别在Th0、Treg和Th17免疫环境下,单独培养或与PD-L1 Fc融合蛋白或anti-PD-L1 mAb共培养,采用荧光定量PCR方法检测PD-1/PD-L1信号通路相关分子Foxp3、RORγt、PI3K、AKT、m-TOR和PTEN mRNA的表达水平。结果：1.正常妊娠组中,在Th0培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.05),在加入anti-PD-L1 mAb后明显降低(P<0.05);在Th17培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.001),在加入anti-PD-L1 mAb后无明显改变,相比Th17+PD-L1 Fc组表达水平明显下降(P<0.001)；在Treg培养条件下,加入PD-L1 Fc或anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平均无明显改变；子痫前期组中,在Th0培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.05)：在Th17培养条件下,Foxp3 mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显升高(P<0.05)；在Treg培养条件下,加入PD-L1 Fc或anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平均无明显改变。2.正常妊娠组中,在Th0培养条件下,RORγt mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后明显降低(P<0.05),在加入anti-PD-L1 mAb后表达水平明显升高(P<0.05);在Th17培养条件下,加入PD-L1 Fc后RORyt mRNA表达水平明显下降(P<0.05);在Treg培养条件下,RORyt mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高(P<0.05)；子痫前期组中,在Th0培养条件下,RORyt mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高(P<0.001)；在Th17及Treg培养条件下,RORyt mRNA表达水平在加入PD-L1 Fc后有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。3.正常妊娠组中,在Th0培养条件下,加入PD-L1 Fc后PI3K、AKT、m-TOR mRNA表达水平分别明显降低(P<0.05,P<0.05,P<0.05),PTEN mRNA表达量升高(P<0.05),PTEN mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显降低(P<0.01)；在Th17培养条件下,加入PD-L1 Fc后AKT mRNA表达水平显着下降(P<0.05);在Treg培养条件下,加入anti-PD-L1 mAb后m-TOR mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；子痫前期组中,在Th0培养条件下,加入PD-L1 Fc后AKT mRNA表达水平明显降低(P<0.05),加入anti-PD-L1 mAb后PI3K、AKT、 m-TOR mRNA表达水平分别明显上升(P<0.01,P<0.05,P<0.01);在Th17培养条件下,PI3K mRNA表达水平在加入anti-PD-L1 mAb后明显升高(P<0.01);在Treg培养条件下,加入PD-L1 Fc后, PTEN mRNA表达量明显升高(P<0.01)。结论：在不同培养条件下,加入PD-L1 Fc后Foxp3 mRNA表达水平明显升高,RORyt mRNA表达水平明显降低,加入anti-PD-L1 mAb后Foxp3 mRNA表达水平明显降低,RORyt mRNA表达水平明显升高,提示PD-L1 Fc融合蛋白促进Naive CD4+T细胞向Treg细胞分化,anti-PD-L1 mAb促进Naive CD4+T细胞向Th17细胞分化,这两种效应分别是通过激活或抑制PD-1/PD-L1信号通路,调控信号通路相关分子PI3K、AKT、m-TOR和PTEN的表达实现。
任大鹏[7]2016年在《ERK1/2-Runx2信号通路介导周期性张应力作用下牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制研究》文中研究指明背景和目的正畸治疗过程中,牙齿在正畸力的作用下发生移动,其生物学基础在于牙周组织在应力刺激下发生改建。正畸力经牙齿传递到牙周组织,牙周膜在这一过程中发挥了桥梁作用。牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts, PDLFs)是牙周膜的主要构成细胞,在应力刺激下能合成细胞因子并通过胞内信号传递系统影响细胞行为(增殖,分化,凋亡等),从而介导牙周组织的改建,修复和再生。研究应力刺激在PDLF胞内的信号转导以及对PDLF行为的影响,对于阐明正畸力作用下牙周组织改建的分子机理,发现有利于促使牙齿移动的力学环境都具有重要意义。成骨细胞是促进骨基质分泌和矿化的主要细胞。核心结合因子a1 (core binding factor al, Cbfal),又称Runt相关转录因子2(]runt related transcription factor 2, Runx2),是学者们公认的最重要的成骨细胞特异性转录因子之一。Runx2蛋白能特异性结合许多成骨基因启动子上的顺式作用元件,并促进成骨靶基因的转录表达。虽然Runx2基因和蛋白的表达水平在矿化组织和成骨细胞系中远远高于一些非骨组织来源的细胞,但是目前越来越多的研究表明其基因和蛋白水平与成骨细胞的功能和分化并不是直接线性相关,而Runx2蛋白的活化状态也是其发挥功能的重要影响因素。目前,学者们一致认为Runx2是联系胞外成骨诱导因素和胞内影响成骨细胞功能分化的信号通路的枢纽。细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal regulated kinase 1/2, ERK1/2)是最先被发现并且最具有代表性的有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)家族的成员。经胞外刺激因素活化后的ERK1/2可以进一步影响其下游转录因子的表达和活化。有研究表明Runx2是 ERK1/2众多下游靶基因中的一员,但是ERK1/2-Runx2通路是否可以在应力刺激下的PDLF中被激活还未知；如果其确实参与了应力刺激下PDLF的成骨分化,其具体的分子机理也有待深入研究。本研究首先通过携带Runx2基因的慢病毒载体转染原代培养的PDLF,探究Runx2对PDLF成骨分化的作用,然后构建了PDLF体外培养一应力刺激模型,观察Runx2和其他相关成骨基因在应力刺激下的表达变化,以及ERK1/2通路在应力刺激下的激活情况；最后通过比较对正常PDLF 和P Runx2过表达PDLF实施应力刺激,以及特异性阻断ERK1/2通路对应力刺激PDLF成骨分化的影响,研究ERK1/2 和 Runx2在介导应力刺激促进PDLF成骨分化过程中发挥的作用,对应力刺激,ERK1/2, Runx2,以及PDLF的成骨基因表达这几个因素之间的关系进行阐述,以明确ERK1/2-Runx2通路介导应力刺激调控PDLF成骨分化的分子机理,为临床正畸矫治提供新的分子生物学基础。主要实验方法及结果1牙周膜成纤维细胞的分离培养及鉴定采用组织块联合酶消化法对牙周膜成纤维细胞进行分离培养,并绘制细胞生长曲线。免疫细胞化学染色结果显示角蛋白染色为阴性,波形丝蛋白染色为阳性,HE染色胞浆伊红,胞核嗜碱性。成纤维细胞特异性表面蛋白1(FSP1)免疫荧光染色阳性。2稳定过表达Runx2基因的PDLF的构建及Runx2对PDLF的成骨诱导作用利用Ⅱ型Runx2基因以及LV5慢病毒载体构建LV5-Runx2慢病毒载体。有限稀释法测定病毒液滴度为6x105TU/ml。通过靶细胞侵染预实验对MOI值以及Puromycin筛选浓度进行摸索,最终获取稳定过表达Ⅱ型Runx2的牙周膜成纤维细胞。荧光定量PCR以及Western Blot证实稳定转染LV5-Runx2的牙周膜成纤维细胞中Runx2的nRNA和蛋白水平都升高显着。荧光定量PCR结果显示Ⅱ型Runx2过表达可以有效促进PDLF中成骨转录因子SP7,骨钙素(OCN)和骨涎蛋白(BSP)的转录表达,但对1型胶原(COL-1)和碱性磷酸酶(ALP)的表达无影响,并且轻微抑制转录激活因子4(ATF4)的表达。茜素红染色实验证实Ⅱ型Runx2过表达的PDL F体外培养3周后可以观察到钙结节。3周期性张应力刺激体外培养的牙周膜成纤维细胞模型构建使用多通道细胞体外牵张应力加载系统,对体外培养的牙周膜成纤维细胞施加振幅10%,频率0.5HZ的周期性牵张力,加力作用时间为1h,3h,6h,12h,18h,24h,以不加力组作为对照组,采用荧光定量PCR测定并绘制成骨基因Runx2, SP7, OCN, BSP和ATF4的mRNA随加力时间延长而变化的表达曲线；利用Western Blot和免疫沉淀法测定Runx2蛋白水平在不同加力时间点的表达,以及Runx2 和 ERK1/2在不同加力时间的激活情况。结果证实了周期性张应力可以促使牙周膜成纤维细胞中上述成骨基因的表达,并且在这一过程中同时伴随Runx2和ERK1/2通路的磷酸化。4ERK1/2-Runx2通路介导了周期性张应力刺激下牙周膜成纤维细胞的成骨分化对正常PDLF和过表达Runx2的PDLF分别进行应力刺激3h,荧光定量PCR结果显示周期性张应力刺激以及Lunx2过表达对牙周膜成纤维细胞中成骨基因SP7, OCN和BSP的mRNA表达有协同促进作用,即对Runx2过表达的PDLF同时施加应力刺激比不加力的Runx2过表达PDLF或者加力的正常PDLF对上述成骨基因的转录刺激作用更强。对加力组PDLF同时应用ERK1/2通路的特异性抑制剂U0126后,上述成骨基因的转录表达水平较单纯加力组有所下降。通过对正常PDLF和过表达Runx2的PDLF中Runx2的mRNA和蛋白水平的测定,发现应力刺激都可以诱导Runx2基因的转录和翻译,但ERK1/2通路被抑制后,Runx2的mRNA水平显着下降,而蛋白水平无明显变化,说明应力刺激对Runx2的转录表达可以通过ERK1/2介导,但ERK1/2对Runx2蛋白的翻译过程影响不大。通过测定Runx2的蛋白磷酸化水平(p-Runx2),发现p-Runx2的表达趋势与上述成骨基因的表达趋势高度一致,从而推测ERK1/2-Runx2通路介导应力刺激对牙周膜成纤维细胞的成骨分化的机制在于提高Runx2蛋白表达水平的同时对其进行磷酸化修饰以提高Runx2蛋白的转录激活功能。进一步研究发现ERK1/2蛋白主要存在于胞浆中,而Runx2蛋白则存在于胞核中；应力刺激激活ERK1/2后促使p-ERK1/2进入胞核并与Runx2形成蛋白复合体,推测这为p-ERK1/2对Runx2的磷酸化修饰提供了条件；U0126抑制了应力刺激下ERK1/2的活化,从而阻止p-ERK1/2进入细胞核并激活Runx2。结论1. Runx2对牙周膜成纤维细胞的成骨分化具有促进作用,可提高下游成骨靶基因SP7, OCN和BSP的转录水平的表达。2.周期性张应力刺激可以促进牙周膜成纤维细胞成骨基因SP7, OC N和BSP的转录表达；Runx2基因的mRNA和蛋白表达水平也同时升高,并伴随Runx2蛋白和ERK1/2通路的磷酸化。3. ERK1/2-Runx2通路介导周期性张应力刺激促进牙周膜成纤维细胞成骨分化的机制在于提高胞内Runx2蛋白的磷酸化水平(p-Runx2),从而促进Runx2下游成骨基因的转录表达；Runx2总蛋白水平与下游成骨基因转录表达无相关性。应力刺激激活ERK1/2进入细胞核中与Runx2形成蛋白复合体,猜测这为p-ERK1/2对Runx2的磷酸化提供了条件；阻断ERK1/2通路影响了应力刺激对ERK1/2的激活以及入核,从而影响了Runx2蛋白的磷酸化修饰和成骨基因的转录表达。创新和意义本课题从细胞分子水平证实了ERK1/2-Runx2通路参与了周期性张应力刺激下牙周膜成纤维细胞的成骨分化,并进一步探讨了其具体的机制,认为Runx2的磷酸化水平的而非总蛋白水平在调控下游成骨靶基因转录表达方面起到至关重要的作用；而应力刺激下活化的ERK1/2则在转录水平提高Runx2的表达并同时进入细胞核与RLunx2蛋白结合以促使Runx2蛋白的磷酸化。以上观点为临床正畸治疗过程中牙周组织的骨改建提供新的分子靶点和思路。
刘文博[8]2017年在《BCAS2在小鼠精子发生中的功能和机制研究》文中认为精子发生是一个非常动态和复杂的过程,主要经历叁个阶段:精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂和精子细胞的变形,最终产生单倍体长形精子。精子发生的每个阶段都需要基因表达的精确调控。可变剪接作为非常重要的基因转录后调控方式,极大的增加了高等真核生物和复杂器官中转录和翻译产物的多样性。大量研究数据显示可变剪接调控了精子发生相关基因的表达和功能;此外,很多剪接因子在睾丸中呈现细胞或发育阶段特异性表达模式,这都说明可变剪接可能在精子发生过程中发挥着重要的调控功能。BCAS2(breast carcinoma amplified sequence 2)是Prp19相关复合体的核心组分,参与了前体RNA的剪接等重要生命活动。我们前期的研究发现BCAS2在雄性生殖细胞中具有特异性表达模式本课题采用精原干细胞特异性敲除BCAS2的小鼠模型,研究BCAS2是否参与精子发生过程中的剪接。通过对BCAS2在睾丸发育过程中的免疫染色观察和生精细胞的富集,发现BCAS2在小鼠睾丸的精原干细胞中相对高表达。Vasa-Cre介导生殖细胞特异性敲除BCAS2的雄性小鼠生长正常,具有正常的交配行为,但不能生育后代;进一步检测发现,BCAS2缺失导致精子发生明显异常,表现为减数第一次分裂前期的生殖细胞数目明显下调,并且基本观察不到减数分裂的关键事件(重组和联会)。通过对精原干细胞的数量、定位、增殖和凋亡进行染色和统计发现,BCAS2缺失的睾丸中精原干细胞发育基本正常,但减数第一次分裂前期的精母细胞大量缺失,减数分裂启动的关键因子STRA8的表达也明显下调,说明BCAS2缺失的睾丸无法正常启动减数分裂。为了进一步解析BCAS2的作用机制,我们对出生后第9天(P9)的正常和BCAS2敲除的小鼠睾丸进行了 RNA深度测序分析。结果发现BCAS2缺失的睾丸转录组水平的基因表达基本正常。但是作为剪接目标基因tubulin的表达明显变化,提示BCAS2可能通过剪接发挥功能。为了研究BCAS2在pre-mRNA剪接方面的功能,我们进一步研究了 BCAS2缺失睾丸中的可变剪接的变化。结果显示,在BCAS2缺失的睾丸中有245个基因的可变剪接发生了异常,其中包括6个在精子发生中具有重要功能的基因(Dazl、Ehmt2、Hmga1、Cit、Hs 和 Bcl2l11)。利用半定量 RT-PCR 和 real-timeRT-PCR,我们成功验证出Dazl、Ehmt2和Hmga1的可变剪接异常。此外,BCAS2的缺失会导致"减数分裂促进因子" DAZL不同转录本的表达异常:全长形式的转录本显着性下调,而缺失8号外显子的转录本表达量明显上升。而且DAZL蛋白总体的表达量明显下调。总之,本研究证明了 BCAS2参与小鼠精原干细胞中的可变剪接,并对减数分裂启动和雄性生育力的维持至关重要。该研究首次揭示了可变剪接在精子发生过程中调控减数分裂启动这一重要事件,为研究哺乳动物减数分裂启动提供了新的思路,并为可变剪接的生理功能研究提供了重要理论依据。
石常友[9]2008年在《哺乳藏猪肠道小肽及氨基酸转运载体mRNA表达的组织特异性和发育性变化的研究》文中指出蛋白质是叁大主要营养素之一,对动物的生长发育和新陈代谢起着至关重要的作用,小肽和游离氨基酸是蛋白质消化产物的主要形式,其中2-3个氨基酸组成的小肽的吸收是通过肠道上皮细胞上H+驱动小肽转运载体完成的,而游离氨基酸的吸收是通过肠上皮细胞上大量氨基酸转运载体实现的。本文意在探讨藏猪肠道小肽和氨基酸转运载体的组织分布以及发育性表达,为此,开展了①藏猪小肽转运载体PepT1 cDNA克隆,②藏猪哺乳阶段肠道小肽转运载体Pept1、酸性氨基酸转运载体EAAC1和碱性氨基酸转运载体CAT1 mRNA的组织特异性,③藏猪哺乳阶段肠道不同部位EAAC1、CAT1以及PepT1 mRNA表达的发育性变化研究。试验①:选取28日龄哺乳仔藏猪6头,以空肠中段为组织样本,运用RT-PCR技术对藏猪肠道小肽转运载体PepT1 cDNA进行了克隆。结果表明,首次成功克隆了藏猪小肽转运载体PepT1 cDNA的编码区,全长2127bp,Genbank基因序列号为:EU400159,预测该转运载体蛋白由708氨基酸组成。通过TMHMM软件对PepT1蛋白二级结构进行预测显示Pept1具有典型的膜蛋白结构,共有13个跨膜结构域,其中第10和11跨膜结构之间存在一个大的胞外环。试验②:选取体重接近并且健康的28日龄哺乳仔藏猪6头,屠宰后分离肠道(十二指肠、空肠前段、空肠后段和回肠),运用Real-Time PCR技术对藏猪不同肠段小肽转运载体PepT1,酸性氨基酸转运载体EAAC1和碱性氨基酸转运载体CAT1 mRNA的组织分布进行研究。结果发现,1)空肠后段PepT1 mRNA表达丰度最高,显着高于十二指肠、空肠前段和回肠(P<0.05);回肠PepT1 mRNA表达量最低,但与空肠前段以及十二指肠肠的差异不显着(P>0.05);2)从小肠近端到远端EAAC1 mRNA的表达丰度在小肠的表达呈升高趋势,即回肠表达最高,显着高于空肠前、后段和十二指肠(P<0.05);空肠后段次之,但与十二指肠、空肠前段差异不显着(P>0.05);3)不同肠段CAT1 mRNA表达格局与EAAC1相似,回肠中CAT1mRNA表达丰度最高,显着高于十二指肠(P<0.05);空肠前、后段差异不显着(P>0.05)。试验③:选取体重接近并且健康的哺乳仔藏猪30头,即1、7、14、21和28日龄各6头,运用实时定量PCR对PepT1、EAAC1、CAT1 mRNA表达的发育性变化进行了研究。结果表明,藏猪EAAC1、CAT1、PepT1 mRNA表达的发育性变化在十二指肠、空肠和回肠都有较大差异。其中十二指肠中CAT1、PepT1 mRNA表达的发育性变化相似,1-14日龄呈上升趋势并在14日龄达到最大值,21、28日龄均有所降低。1、7日龄EAAC1mRNA表达量显着大于14、21和28日龄;空肠中EAAC1、CAT1mRNA表达的发育性变化相似,1-14日龄呈上升趋势,21日龄显着下降,28日龄回升,1-21日龄PepT1 mRNA表达丰度呈递增趋势,28日龄略有下降。回肠中PepT1与EAAC1mRNA表达丰度具有相似的发育性变化,7日龄PepT1和EAAC1mRNA表达量均达到最大,14日龄显着降低,21日龄显着上升,28日龄略有下降。1-14日龄回肠CAT1 mRNA的表达丰度呈递增趋势,接着在21日龄显着下降,到28日龄反转显着增加并达到最高点。总体而言,哺乳仔藏猪不同肠道PepT1、EAAC1、CAT1mRNA的表达具有组织特异性,同一转运载体mRNA在不同肠段表达的发育性变化有所不同,同一肠段不同转运载体mRNA表达的发育性变化也有所不同。
厉晓婷[10]2017年在《长链非编码RNA在小鼠脂肪组织胰岛素抵抗中的表达谱特征及其对脂肪细胞胰岛素敏感性的影响》文中研究表明肥胖是目前发达国家和发展中国家共同面临的全球性公共卫生难题。内脏脂肪的堆积会导致代谢性疾病,包括心血管疾病和Ⅱ型糖尿病等。胰岛素抵抗是2型糖尿病和多种心血管疾病的共同发病机制。胰岛素抵抗是指细胞或组织对正常剂量的胰岛素反应性下降。引起胰岛素抵抗的原因有很多,包括肥胖相关的慢性炎症状态、脂代谢异常、肠道菌群失调等。对胰岛素信号通路的研究已经有很多,而最近又有新的研究发现转录调控和表观遗传学修饰在胰岛素抵抗的发生发展中也起着重要的作用。长链非编码RNA(LncRNA)是转录本长度超过200个核苷酸的RNA,且大部分lncRNA几乎无编码蛋白质功能。所以最初这些RNA分子被认为没有生物学活性。但现在越来越多的研究发现lncRNA在许多生物学过程中起着作用,包括遗传学印记、转录激活、RNA剪切、核内运输等。LncRNA也能参与脂肪的形成与分化,有研究发现,某些lncRNA能与过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)结合参与调控脂肪的分化、生成。PPARγ的表达能影响抵抗素和一些促炎细胞因子的产生,从而与胰岛素抵抗相关。所以我们猜测lncRNA可能也参与调控了脂肪组织发生胰岛素抵抗的这一病理过程。在本研究中,我们通过高脂喂养C57BL6小鼠12周来诱导产生胰岛素抵抗模型,在鉴定模型建立成功后,将小鼠附睾脂肪组织送第二代高通量测序,了解lncRNA在正常小鼠附睾脂肪组织以及发生胰岛素抵抗的脂肪组织中表达差异情况,从而筛选出对胰岛素抵抗可能有影响的lncRNA。随后,将小鼠3T3-L1前脂肪细胞诱导为成熟脂肪细胞,通过基因干扰技术体外沉默胰岛素抵抗脂肪组织中过表达的lncRNA,观察其对脂肪细胞胰岛素敏感性的影响。第一部分长链非编码RNA在小鼠脂肪组织胰岛素抵抗中的表达谱特征目的研究lncRNAs在小鼠正常和发生胰岛素抵抗的附睾脂肪组织中表达谱的差异特征。筛选与胰岛素抵抗相关的lncRNAs,为后续的研究提供基础。方法将20只5周龄健康雄性C57BL6小鼠适应性喂养1周后,随机分为正常饮食组(NCD 10只/组)和高脂饮食组(HFD 10只/组)。NCD组用普通标准饲料(10%脂肪)喂养,HFD组用高脂饲料(60%脂肪)喂食12周来建立胰岛素抵抗模型。随后通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)和胰岛素耐量试验(ITT)来评估胰岛素抵抗模型是否成功。测量比较两组小鼠的体重、附睾脂肪重量。苏木精-伊红(HE)染色观察附睾脂肪细胞面积。Real-time PCR检测小鼠脂肪组织炎症指标白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达。Western blotting检测脂肪细胞p-Akt(S473)和Akt蛋白表达。第二代高通量测序检测两组小鼠附睾脂肪组织中lncRNA的表达情况,并选择表达差异在3倍以上的lncRNA行Real-time PCR验证。对差异表达的lncRNA进行GO分析和KEGG通路分析。结果与NCD组比较,HFD组小鼠体重及附睾脂肪重量明显增加(P<0.01),附睾脂肪细胞面积显着增加,糖耐量异常和胰岛素抵抗明显。Real-time PCR检测发现,HFD组附睾脂肪组织中IL-6和TNF-α表达显著高于NCD组(P<0.01)。二代高通量测序发现,与NCD组比较,HFD组附睾脂肪组织中有71条lncRNA和2985条mRNA表达显着增高(P<0.05);有145条lncRNA和2472条mRNA表达显着下降(P<0.05)。Real-time PCR表达差异在3倍以上的lncRNA共15条,其表达趋势与高通量测序结果基本一致。GO分析结果提示差异表达的lncRNA主要涉及膜结合的细胞组分、蛋白绑定、催化酶的活性、细胞内各种化合物以及核酸的代谢过程等,KEGG通路分析结果提示差异表达的lncRNA参与的信号通路主要涉及酒精中毒、免疫炎症、癌症的转录失调、以及代谢途径等,与胰岛素抵抗相关。结论高脂饮食可使得C57BL6小鼠发生胰岛素抵抗。长链非编码RNA表达谱在小鼠正常白色脂肪组织和发生胰岛素抵抗的白色脂肪组织中表达差异显着,提示lncRNA可能在脂肪组织胰岛素抵抗的发生发展中起重要作用。第二部分LncRNA对小鼠脂肪细胞胰岛素敏感性的影响目的探讨根据第一部分筛选出的上调的lncRNAs在小鼠3T3-L1诱导分化的成熟脂肪细胞以及发生胰岛素抵抗的脂肪细胞中的表达差异情况,并观察其对葡萄糖摄取率、PPARγ、GLUT4、IL-6的mRNA表达和Akt蛋白及其磷酸化水平的影响方法通过1mg/ml胰岛素、10mmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)将小鼠3T3-L1细胞诱导分化为成熟的脂肪细胞。油红O染色以及Real-time PCR检测脂肪细胞形成标志基因Fabp4和PPARy的表达情况,鉴定是否为成熟脂肪细胞。采用4000μmol/L棕榈酸(PA)刺激48小时建立细胞胰岛素抵抗模型。葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法比较正常对照组(CON)和棕榈酸刺激组(PA)葡萄糖的浓度并计算各组的葡萄糖摄取率,Real-timePCR检测两组脂肪细胞PPARγ、GLUT4、IL-6 mRNA的表达,Western blotting检测各组脂肪细胞Akt蛋白及其磷酸化水平。Real-time PCR检测根据第一部分实验结果筛选出的lncRNA在普通培养的脂肪细胞(CON组)和发生胰岛素抵抗的脂肪细胞(PA组)中的表达情况。根据Real-time PCR结果,选择在两组间表达差异明显的lncRNA,使用RNA干扰技术沉默相关lncRNA(siRNA组),选择与目的基因序列无同源性的siRNA作为阴性对照(NC组)。根据是否加棕榈酸将细胞分为以下四组,NC组,siRNA组,NC+PA组,siRNA+PA组,计算各组的葡萄糖摄取率,各组脂肪细胞PPARγ、GLUT4、IL-6 mRNA的表达和Akt蛋白及其磷酸化水平。结果小鼠3T3-L1前脂肪细胞经诱导分化为成熟脂肪细胞,油红O染色后于光镜下可见分化成熟的脂肪细胞内的脂滴被染成橘红色,Real-time PCR显示Fabp4和PPARy的mRNA水平显着增加。PA刺激后,脂肪细胞的葡萄糖摄取率下降,PPARγ、GLUT4 mRNA表达减少,IL-6 mRNA表达升高,Akt的磷酸化水平下降。在第一部分中筛选出来的15条上调的lncRNA中,有9条在体外培养的脂肪细胞中也存在PA组表达显着高于CON组的情况。通过对其中3条候选的lncRNA(Gm26870、Gpr137b-ps、TCONS_01864186)进行功能缺失性研究发现,用siRNA沉默Gm26870的表达能缓解PA引起的葡萄糖摄取率下降,并改善胰岛素抵抗引起的PPARγ、GLUT4mRNA表达抑制和pAkt/Akt比值下降,减轻IL-6 mRNA的升高。结论PA能引起小鼠脂肪细胞的胰岛素抵抗,lncRNA Gm26870可能具有调节胰岛素敏感性的作用。
参考文献：
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[8]. BCAS2在小鼠精子发生中的功能和机制研究[D]. 刘文博. 中国科学技术大学. 2017
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[10]. 长链非编码RNA在小鼠脂肪组织胰岛素抵抗中的表达谱特征及其对脂肪细胞胰岛素敏感性的影响[D]. 厉晓婷. 浙江大学. 2017
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