I-B-Svi型CRISPR-Cas3系统在哺乳动物细胞中的基因编辑

论文摘要

CRISPR/Cas系统是细菌和古生菌在长期进化过程中所产生的抵抗外源核酸入侵的免疫系统。该系统可以由人工设计的gRNA与Cas蛋白复合对目标DNA进行切割,设计模版tDNA通过宿主细胞中自身HDR系统修复获得所需基因编辑。本论文旨在利用自行分离、鉴定、命名、并已证明能在原核及真核微生物中可对基因组中基因进行自打靶以及非自打靶基因的I-B-Svi CRISPR-Cas3系统对HEK293T和NIH3T3细胞中的靶DNA序列进行编辑改造。作为靶细胞研究的人胚肾细胞HEK293T和鼠NIH3T3细胞是模式哺乳细胞,具有生长较快、易转染培养,且适合胞内表达之特点。实验首先用非碱基优化的Type I-B-Svi CRISPR/Cas3系统和商业化的CRISPR/Cas9系统的基因编辑工具探索并掌握了哺乳细胞中的编辑操作。在293T细胞中的drosha基因（靶标:Exon4）和3T3细胞中的vegfa基因的（靶标:Exonl）基因编辑中,分别设计了基于hcas3的g-drosha和与靶标位点两侧具有同源臂序列的t-drosha::egfp和基于scas3和hcas9的g-vegfa和与靶标位点两侧具有同源臂序列的t-vegfa::egfp,并将cas3/cas9,g-drosha/g-vegfa和t-drosha::egfp/t-vegfa::egfp连接到CRISPR/Cas质粒中,转化扩增验证后得基因编辑质粒。通过脂质体瞬时转染的方式将质粒导入细胞,经过嘌呤霉素等筛选、细胞形态以及同源交换整合后的绿色荧光、特异性PCR以及测序验证编辑效果。结果表明:1)基因编辑质粒CRISPR-hCas9-t/g-vegfa::egfp在3T3细胞的vegfa基因编辑中,重组细胞基因组的靶位点交叉引物PCR产物及测序分析证明靶向位点发生了正确的基因编辑;而基因编辑质粒CRISPR-sCas3-t/g-vegfa::egfp靶向的基因编辑中,特异性的交叉引物进行PCR并未得到正确条带;表明:as3基因的碱基优化可能是必须的。2)在cas3碱基优化后的hcas3所构建的基因编辑质AIO-hCas3-t/g-drosha::egfp（hcas3与mcherr 序列通过P2A连接;Cas3的核定位信号不变）所进行的基因编辑中,红、绿荧光观察、交叉引物PCR、靶标及脱靶测序分析等正确的结果表明:碱基优化后的hcas3所构建的基因编辑质粒AIO-hCas3-t/g-drosha::egfp能对293T细胞进行精确的基因编辑。简言之,本研究首次成功地实现了该编辑系统从微生物领域到哺乳细胞领域的跨越;为I-B-Svi型CRISPR-Cas3系统在基础生命科学与临床医学领域中的应用打下了坚实的基础。因其分子量小、非动物体微生物来源和未发现脱靶现象之优点,该编辑系统将具有巨大的应用价值。

论文目录

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 唐严严

导师: 童望宇

关键词: 基因编辑,基因

来源: 安徽大学

年度: 2019

分类: 基础科学

专业: 生物学,生物学

单位: 安徽大学

分类号: Q78

总页数: 102

文件大小: 7558K

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标签：基因编辑论文;  基因论文;