周汝江[1]2004年在《小鼠二倍体-四倍体聚合胚的制作及其发育特性的研究》文中研究表明由二倍体(2N)的早期胚胎细胞或ES细胞与四倍体(4N)的早期胚胎细胞所组成的2N-4N聚合胚(嵌合胚)，其中的4N胚胎细胞具有明显的胚外组织限制性分布(发育)特性，即在由该嵌合胚发育得到的孕体中，4N胚胎细胞最终只分布至胎盘滋养层及卵黄囊内胚层等在内的胚外组织，而基本不参与原始外胚层所衍生的胎儿及胚外中胚层组织的发育。该特性很可能和参与聚合的4N胚胎细胞的本身特性有关，如加倍的核型以及较大的细胞体积等。 尽管目前对2N-4N嵌合胚发育的具体机制尚未完全搞清，但我们可以利用2N-4N嵌合技术来研究哺乳动物发育相关基因的功能。此外，随着体细胞核移植研究的进展，人们逐步发现：核移植产生的重构胚(克隆胚)，其胚外组织的发育往往表现异常，从而导至着床后早期阶段大量胚胎的丧失；在种间核移植领域，因胎儿与移植母体子宫在种系上的差别，使得重构胚的着床几乎不可能。于是，利用2N-4N嵌合胚的发育特性，将重构胚或自其衍生的ES细胞与4N胚胎组构成种内(种间)2N-4N嵌合胚，有可能提供重构胚着床或正常发育所需的，包括胎盘在内的胚外组织，进而改善或实现重构胚的着床及着床后的发育，提高克隆动物的出生率。这项工作除其自身的生物学意义外，还可作为微注射、转基因细胞核移植后的另一个技术平台，因此建立起2N-4N嵌合胚的制作系统具有重大的理论与现实意义。 本研究旨在确立二倍体-二倍体(2N-2NO聚合嵌合体小鼠制作的基本条件，运用胚胎聚合法获得存活的2N-4N小鼠，并通过GFP荧光标记，实现对2N-4N聚合胚中4N细胞发育特性的动态观察，从而最终为该技术在核移植上的应用创造了基础条件。研究的具体内容如下： 1、2N-2N聚合嵌合体小鼠制作体系的建立 所建聚合嵌合体小鼠的制作体系包括：胚胎透明带的去除方法、用于聚合的胚龄、聚合培养载体、聚合介质、移植受体等基本条件。 主要实验结论有：(1)0.5％的Protease在去除胚胎透明带的效果上与Tyrode’s相当；(2)96孔板与微滴作聚合培养载体时的聚合效率相近，但微滴第二军医大学硕士学位论文小鼠二倍体·四倍体聚合胚的制作及其发育特性的研究更适合作培养载体;(3)180 pg/耐浓度的PHA一P聚合介质处理后，所获得的聚合效率较佳;(4)聚合胚在M16培养液中培养，可发育至囊胚;(5)聚合囊胚移入受体子宫后，可足月发育并获得存活的毛色嵌合体小鼠。2、胚胎聚合法产生2N一4N嵌合胚及小鼠 ZN一4N聚合胚的制作方法基本上类似于ZN一2N聚合胚，不同之处在于:(l)利用2一cell期的ZN胚胎经电融合产生4N胚胎;(2)利用4或8一cell期的2N胚胎与4一cell期的4N胚胎作聚合组合:(3)采用常规的1:1聚合(1枚2N胚胎对1枚4N胚胎)与1:2的“夹心法”(2枚4N胚治中间夹1枚2N胚胎)的聚合方式。 实验的主要结论有:(l)聚合胚在M16培养液中培养可发育至囊胚:(2)采用致密化与未致密化的8一Cen期2N胚胎与4N胚胎作聚合，在聚合率上无明显差异，但前者发育至聚合囊胚的比率较高;(3)常规的1:1聚合与“夹心法”聚合相比，在聚合完成的时间及聚合率上较接鸡， (4)移植聚合囊胚至受体子宫后，可回收到妊娠中、后期的胎儿(简称为胎儿)及获得发育足月的存活仔鼠;(5)部分回收胎儿的发育表现延滞、而胎盘的发育却不受影响;(6)回收胎儿眼部虹膜中沉积的色素及出生后仔鼠的毛色均同于2N胚胎所生仔鼠，表明胎儿与仔鼠源自参与聚合的2N胚胎;(7)小鼠的遗传背景将对ZN一4N聚合胚的发育能力产生影响:移植至与4N胚胎相同品系受体中的ZN一4N聚合胚的着床率较高;着床后的孕体中，由遗传杂合性的2N胚胎细胞所组成的聚合胚，发育至胎儿及仔鼠的比率较高。3、利用荧光标记研究ZN一4N聚合胚中4N胚胎细胞的发育特性 利用转GFP基因的2一cel工期胚胎，经电融合后获得4N胚胎，与无G即标记的ZN胚胎聚合，跟踪4N胚胎细胞在聚合胚发育过程中的动态变化。结果表明:(l)带有GFP基因的4N胚胎和2N胚胎聚合后，并不影响ZN一4N聚合及聚合胚着床前的发育;(2)在聚合胚形成及聚合囊胚腔出现期间，不同倍性的胚胎细胞间并不发生混杂;多数早期聚合囊胚中，4N细胞共存于TE与工CM中;晚期囊胚中，4N细胞的数目明显下降，且很少存在于工CM细胞中;(3)在着床后的孕体中，4N胚胎来源的细胞存在于胎盘、卵黄囊组织，而在胎儿及羊膜组织中不存在，提示4N胚胎细胞限制性地分布至胚外组织。
杨悦[2]2012年在《小鼠四倍体胚胎凋亡及GSH和β-巯基乙醇对其影响的研究》文中认为胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)是一种高度未分化细胞,它具有发育的全能性,能分化出成体动物的各种组织和器官,又称为全能干细胞。小鼠二倍体胚胎可以经过电融合等方法产生四倍体胚胎。四倍体胚胎的着床率虽高,但是发育至妊娠中期的胎儿往往会出现面颅部畸型,而且几乎不能发育至足月。利用ES细胞与四倍体胚胎可以形成嵌合体,在这种嵌合体中,ES细胞能参与胚体所有组织的生成,而四倍体胚胎主要分布在胚外组织,如胎盘、滋养层、尿囊膜、卵黄囊膜等,几乎不参与胎儿本身的形成。因此,将ES细胞与四倍体胚胎嵌合,使二者的发育潜能互相补偿,就可能得到完全由ES细胞发育来的个体,其胚外组织则由四倍体胚胎形成。这种技术称为四倍体胚胎补偿技术,得到的小鼠称为ES小鼠。四倍体补偿技术在获得基因突变小鼠,分析突变基因的表型,以及证明iPS细胞的全能性等方面有重要的作用。早期胚胎发育过程中存在大量发育异常的细胞。细胞凋亡是清除异常细胞的重要途径之一。着床前胚胎的凋亡现象普遍存在,但大比率的凋亡对胚胎生长是不利的。因此,人们通过向培养基中添加某些药物来减少胚胎细胞的凋亡,进而提高胚胎的存活能力。本实验采用电融合法制作小鼠四倍体胚胎,用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测了二倍体和四倍体胚胎的凋亡,并采用RT-PCR和免疫荧光染色方法检测了凋亡相关基因的表达情况,之后,在培养液中添加GSH或β-巯基乙醇培养四倍体胚胎,检测它们对四倍体胚胎凋亡的影响。这对于研究小鼠四倍体胚胎早期发育情况,及获得更多的优质四倍体胚胎有重要的意义。实验结果表明：1.本研究通过电融合法制备四倍体胚胎,二倍体胚胎、四倍体胚胎、添加GSH或β-巯基乙醇培养的4N胚胎的囊胚率分别为92.3%、80.6%、88.7%、85.3%,添加GSH或β-巯基乙醇后四倍体胚胎的囊胚率有显着升高。2. TUNEL染色结果表明,四倍体胚胎的凋亡主要发生在囊胚期,凋亡率为13.2%,显着高于二倍体胚胎(4.1%)。分别添加谷胱甘肽和β-巯基乙醇培养四倍体胚胎后,四倍体囊胚的凋亡率分别为8.5%,9.4%,均有显着降低。3. PCNA免疫荧光染色结果表明,四倍体胚胎的增殖能力在囊胚期最低,其PCNA阳性率为73.8%,显着低于二倍体胚胎(94.2%),添加谷胱甘肽或β-巯基乙醇培养后,四倍体囊胚的PCNA阳性率分别为85.5%,83.7%,均有显着提高。4.RT-PCR的结果表明,促凋亡基因Bax在四倍体胚胎发育过程中,在囊胚期的mRNA表达水平明显高于二倍体胚胎,添加谷胱甘肽或β-巯基乙醇后,Bax在囊胚期的表达显着降低；抑凋亡基因Bcl-2在四倍体胚胎发育各时期表达无明显变化,加入谷胱甘肽或β-巯基乙醇后,在桑葚胚期和囊胚期有显着增加；PCNA基因在二倍体胚胎各时期的表达量无明显变化,在四倍体胚胎中,PCNA基因在二细胞期至桑葚胚期的表达量无明显变化,在囊胚期,PCNA的表达量降低。在培养液中添加谷胱甘肽或β-巯基乙醇对四倍体胚胎进行培养后,PCNA在囊胚期的表达量明显上升。通过上述实验结果可见,四倍体胚胎的凋亡与bax、bcl-2基因有关,PCNA的表达减少也是影响其凋亡的一个原因,通过改善培养条件,在培养液中添加GSH或β-巯基乙醇,可以显着地改善四倍体胚胎的发育,减少其凋亡的发生。
温晓辉[3]2008年在《遗传背景对小鼠四倍体胚胎发育的影响》文中提出多倍体现象与机体的正常发育是不相容的,哺乳动物胚胎在正常发育过程中存在微弱几率(小鼠大约为0.1%)的自发多倍体现象,通常会导致流产或胎儿脊柱、骨骼、面部畸形等发育缺陷。在生命科学研究中,四倍体胚胎可以作为研究机体发育的有力工具,例如,用它来研究早期胎儿发育过程中调节细胞体积、数目以及分裂速率的机制,也可以用它来改变双亲基因组在子代中的分配比例;更为重要的用途是通过四倍体补偿作用获得完全由ES细胞发育而来的个体,ES小鼠的获得对基因功能的分析、疾病动物模型的建立有十分重要的意义。为充分估计四倍体补偿作用,就必须对因遗传背景引起的小鼠四倍体胚胎发育能力的不同进行研究。本实验通过电融合法由多种遗传背景的小鼠分别获得了四倍体胚胎,并对其电融合效率、附植前和附植后发育能力、与ES细胞构建嵌合胚的发育能力进行了比较。不同遗传背景的小鼠四倍体胚胎的电融合效率存在显着差异:在融合电压为100V/mm,脉冲时程2×50μsec条件下远交系小鼠胚胎B6D_2F_2和B6C3D2F_2的融合率显着高于近交系C57,ICR和BALB/c(P＜0.05)。四倍体胚胎在体外的发育情况也受其遗传背景的影响:附植前发育阶段,在桑椹胚发育率和囊胚发育率上(B6D2F_1×B6D2F_1)F_2和(B6C3F_1×B6D2F_1)F_2品系的四倍体胚胎都显着高于C57和BALB/c品系的四倍体胚胎(P＜0.05),远交系和近交系遗传背景的小鼠四倍体胚胎囊胚细胞数目相比具有显着差异(P＜0.05或P＜0.01);附植后发育阶段,不同遗传背景的小鼠四倍体胚胎着床率间不存在显着差异(P＞0.05),远交系的小鼠四倍体胚胎得到5只发育至13.5dpc(days post coitum,dpc)的胎儿,近交系的4n小鼠胚胎无一发育至11.0dpc。因为ES细胞的多能性会受到多次传代以及冻融的影响,因此需要在本实验室条件下建立起ES细胞稳定的分离培养和鉴定体系。本实验以3-5代ICR小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层,利用高糖DMEM作为基础培养基,同时添加15%的新生犊牛血清、0.1mM的2-巯基乙醇、1%的非必需氨基酸、2mM的谷氨酰胺和青、链霉素各50IU/ml、LIF(白血病抑制因子)2000IU/ml。5%CO_2、饱和湿度、37℃培养,培养于囊胚贴壁后第5-6天离散Outgrowth(内细胞团增殖体),分别由43枚C57BL/6J×129/Sv囊胚、38枚(C57BL/6J×DBA/2)F_1×129/Sv囊胚、49枚(C57BL/6J×C3H/HeJ)F_1×129/Sv囊胚和91枚B6C3F_1×B6D2F_1囊胚得到4株、3株、4株和3株ES细胞系。选择一株具有高度杂合背景的B6C3F_1×B6D2F_1 ES细胞系进行核型分析、畸胎瘤实验后与ICR品系2n胚胎构建嵌合体并得到具有生殖系传递能力的嵌合体小鼠(通过毛色判断),证明此细胞系具有生殖系嵌合能力。利用同一株具有生殖系嵌合能力的杂合背景ES细胞与不同遗传背景(ICR×ICR、C57×C57、BALB/c×BALB/c、(B6D2F_1×B6D2F_1)F_2和(B6C3F_1×B6D2F_1)F_2)的四倍体胚胎构建ES:4n嵌合体,结果由B6C3F_1×B6D2F_1背景的ES细胞与B6C3D2F_2和B6D2F_2四倍体胚胎构建的3只嵌合体,移植其它嵌合胚的假孕鼠无一妊娠。以上结果说明,远交系小鼠四倍体胚胎比近交系小鼠四倍体胚胎具有更好的发育能力。
白春玲[4]2011年在《牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究》文中研究说明在哺乳动物中,体细胞克隆胚胎能够发育成个体的成功率一直很低。即使能够发育到妊娠后期,也往往出现胎儿巨大、胎盘异常等现象,从而影响克隆动物生产效率。多倍体细胞主要参与胎盘等胚外组织的形成,将多倍体胚胎与克隆胚胎聚合为一体进行移植,可以改善胎盘异常等引起的效率底下现象。因此,多倍体胚胎的研究对于进一步了解克隆动物发育机理具有重要意义。本研究采用免疫荧光染色、药物处理、孤雌激活、反向核移植等技术,研究了获得孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的技术途径、分析了卵母细胞核的存在对体细胞核重编程的影响,以便为进一步完善体细胞克隆技术提供实验依据。1、牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中细胞核和细胞骨架的动态学变化在牛、山羊、绵羊卵母细胞体外成熟过程中,收集成熟不同时间的细胞,通过对纺锤体微管、微丝和染色体的免疫荧光染色,分析了在整个体外成熟过程中细胞核的成熟进程以及细胞骨架和染色体的动态变化。结果显示：牛和山羊卵母细胞在成熟培养后的4h开始发生GVBD,12h即有50%-60%的卵母细胞到达MI期,16h到达AI/TI期峰值(42%),20h后牛和山羊分别有66%和84%的卵母细胞进入MII期；绵羊卵母细胞核成熟进程略慢于牛和山羊,GVBD发生的时间也是成熟培养后的4h,但达AI/TI期峰值的时间和发育为MII期的时间分别为20h(50%)和24h(76.5%),均晚于牛和山羊；卵母细胞在体外成熟过程中,其细胞骨架和染色体动态变化在叁种动物基本相似,在部分绵羊卵母细胞出现叁级纺锤体等异常结构。2、细胞松弛素B(CB)对牛卵母细胞减数分裂和二倍染色体卵母细胞形成的影响将牛卵母细胞置入含有CB的培养液中培养后,分别观察了CB的浓度和处理方法对卵母细胞发育的影响,其结果是：(1)培养时间24h(全程处理),CB浓度≥2.0μg/ml时,卵母细胞的成熟率≤44.8%,成熟卵母细胞的染色体单倍性组成比例≤73.9%,两者均显着低于对照组的83.1%和93.8%；处理组有50%以上的卵母细胞未排出第一极体(PB1),其中的50%-65%染色体为60条,呈二倍性；处理的卵母细胞中出现纺锤体形态异常、两个纺锤体、60条染色体组成超大纺锤体等现象。(2)在培养时间6-8h分别添加7.5μg/ml和15μg/ml的CB预处理,然后移到无CB的培养液中继续培养至24h,其结果卵母细胞的成熟率约为80%,与对照组的83%没有显着性差异,将预处理时间延长到10h使成熟率显着降低(60%)。(3)在未处理培养液中培养10h,然后转移至含有3.0-7.5μg/mL CB的培养液中继续培养到24h(后处理),结果只有41.5-7.2%的卵母细胞排出PB1,其余58.5-92.8%没有排除PB1。(4)在无CB的培养液中培养10h,然后移至含有7.5μg/ml CB的培养液中分别培养至24h、30h、36h、48h,进行免疫荧光染色,观察卵母细胞所处核相,结果是30h以上处理组AI/TI期卵的比例为1.9-6.4%,显着低于24h处理组的15.3%,而多数为由60条染色体组成的巨大纺锤体细胞。以上结果表明,CB可能破坏纺锤体结构,从而抑制PB1排出,降低卵母细胞成熟率,导致二倍染色体(2n或4c)卵母细胞的形成。3、细胞松弛素B(CB)对牛四倍体孤雌胚胎发育的影响将卵母细胞分为叁个处理组：一是CB浓度为0.1-10.0μg/ml,培养时间24h的处理组(全程处理组)；二是在含有7.5和15μg/ml CB的培养液中预培养6-10h后移至不加CB的培养液培养至24h(预处理组)；叁是用不加CB的培养液培养10h后转到含有CB的培养液中继续培养至24h(后处理组)。然后对叁个处理组分别进行孤雌激活和发育培养,观察CB对四倍体孤雌胚胎发育的影响。结果是：(1)后处理组的四倍体孤雌胚囊胚发育率(25-28%)明显高于全处理组(5%-15%)、前处理组(7％-16%)和对照组(12%-16%)。(2)对后期处理组得到的孤雌胚胎进行染色体分析发现,来源于未排PB1的卵母细胞的胚胎中,有74%的1-细胞胚胎、82%的2-细胞胚胎和75%的囊胚是四倍体(4n=120)。(3)对激活后40h未卵裂的卵母细胞进行染色体分析发现,有15%以上含有超多倍数染色体,这说明在40h内发生了多次DNA复制。以上结果表明,通过CB处理形成的二倍染色体(2n或4c)牛卵母细胞,能够发育为四倍体胚胎,且发育率很高。4、卵母细胞核的存在对克隆胚胎供体核重编程和多倍体胚胎发育的影响以未去核的MII期卵母细胞为胞质受体构建重构胚胎,检测了卵母细胞核的存在对供体细胞核重编程的影响,包括对早熟染色体凝集(premature chromosome condensation, PCC)、染色体结构和重构胚发育的影响,在此基础上探索了以未去核卵母细胞构建的重构细胞能够发育为多倍体的可能性。研究结果显示：(1)受体细胞MII纺锤体的存在更容易诱发重构细胞中的供体细胞发生PCC。(2)供体细胞核与受体细胞MII纺锤体之间的位置关系对第二极体(PB2)的排出有影响,当两者的纺锤体距离比较远时,94.4%的重构细胞能够排出PB2；当两者的纺锤体位置接近时,几乎所有重构细胞都没有排出PB2,大部分(67.9%)形成超大纺锤体,受体卵母细胞和供体细胞的染色体混为一体。(3)用去核卵母细胞构建的重构胚胎被激活后,其卵母细胞和供体核显示出多种原核形态,并且发育不同步。(4)上述重构胚经过发育培养后,以卵丘细胞为核供体时卵裂率和囊胚发育率分别为81.9%和22.3％,与对照组的84.9%和29.1％没有显着差异(p>0.05)；以成纤维细胞为核供体时卵裂率和囊胚发育率分别为90.3%和22.7%,与对照组的81.9%和31.1%也没有显着差异(p>0.05)；而囊胚孵化率则以卵丘细胞为供体时0,以成纤维细胞为供体时27.5%,分别低于对照组的23.1％(p<0.05)和72.3％(p<0.05)。(5)以未去核卵母细胞为受体的重构囊胚其细胞山各种多倍体细胞混合而成,包括2n/4n、2n/6n、2n/8n和2n/4n/8n；并且这种来源的囊胚细胞数(约60个细胞)明显少于去核对照组的囊胚细胞数(约90个细胞)。(6)通过反向核移植(reverse nuclear transfer, RNT)的方法研究结果显示：重构胚融合后1h去核组的囊胚发育率为47.2%,显着高于3h去核组的20%,(p<0.01)；重构胚融合3h后去核,使染色体构象出现异常。以上结果表明,卵母细胞的MII纺锤体能够诱发供体细胞发生PCC；以去核卵母细胞为受体构建的重构胚能够发育为囊胚期克隆胚,但其发育能力明显低于以去核卵母细胞为受体的重构胚,并且所有囊胚都是混合多倍体。
邸科前[5]2007年在《小鼠胚胎干细胞的分离及鉴定》文中认为胚胎干细胞由于其独特的生物学特性，在体外研究胚胎的发生发育、新基因的发现、药物筛选和致畸实验，以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源、克隆动物、转基因动物生产、发育生物学、动物和人类疾病模型、组织器官的修复和移植等方面有着诱人的前景。四倍体胚胎补偿技术已经成为一个基本的实验技术，虽然四倍体胚胎只能发育到怀孕中后期，但是四倍体与二倍体嵌合体广泛用于研究胚外发育缺陷的相关基因功能。为了充分利用小鼠胚胎干(ES)细胞，就必须从众多小鼠品系中分离ES细胞系。本实验的研究目的是分离不同的ES细胞系并通过制备畸胎瘤和四倍体胚胎补偿技术来检测ES细胞的多能性。本实验以小鼠胎儿成纤维细胞作为饲养层，利用高糖DMEM作为基础培养基，同时添加15％的新生犊牛血清、0.1mM的2-巯基乙醇、1％的非必需氨基酸、2mM的谷氨酰胺和青、链霉素各50IU／ml、LIF(白血病抑制因子)1000IU／ml。5％CO_2、饱和湿度、37℃培养。本研究从58枚((C57BL／6J×129／Sv)F1)小鼠囊胚内细胞团分离获得5个ES细胞系，从63枚(C57BL／6J×DBA／2)F1×129／Sv小鼠囊胚内细胞团分离获得6个ES细胞系。把ES细胞注入不同品系的小鼠皮下、睾丸质膜下及。肾囊下，均得到了畸胎瘤，且畸胎瘤包含3个胚层的衍生物。我们发现，睾丸质膜下移植ES细胞，似乎更容易长出畸胎瘤，因此我们认为，睾丸质膜下移植ES细胞可能是检测ES细胞多能性的一个简便易行的方法。采用100V／mm融合电压，2×50μsec脉冲时程，对1979枚2细胞胚胎进行电融合，84.8％的胚胎发生融合。通过移植四倍体胚胎和二倍体胚胎来比较两种胚胎发育潜力。将四倍体胚胎和二倍体胚胎分别随机移植到左右两侧子宫角，得出结论：四倍体胚胎与二倍体胚胎附植率没有显着差异，四倍体胚胎前期的发育能力要优于二倍体。两侧子宫角的胚胎附植率没有区别。四倍体胚胎发育到12-13 d后开始死亡，个别发育到14-15 d。实验没有得到出生的四倍体个体。融合的胚胎培养24 h后，86％的融合胚胎形成4细胞或4细胞以上胚胎。将四倍体4细胞胚胎分别与5个(C57BL／6J×129／Sv)F1 ES细胞系聚合后得到1122枚嵌合囊胚，移植假孕51只ICR母鼠，5只妊娠。从5个ES细胞系中共得到了1只ES小鼠，只存活1天，出生后未能哺乳，腹部有病变，肉眼可见鼓胀。胎儿出生重2.8g。ES细胞的遗传背景和生长状态、嵌合方法、体外培养环境、移植方法等都是影响获得ES小鼠的因素。通过四倍体胚胎聚合技术可以简便而快速地从遗传修饰的杂种ES细胞中获得完全由ES细胞发育而来的个体，为基因功能和人类疾病动物模型的研究提供了一条有效途径。
员新旭[6]2009年在《四倍体补偿法克隆EG小鼠技术及相关机制的研究》文中进行了进一步梳理人类基因组工作框架图的完成,标志着人类迈进了功能基因组研究的新时代。基因敲除技术是揭示基因功能和建立动物模型的最有效的方法。传统基因敲除获得某一突变基因的纯合体动物首先要利用打靶胚胎干细胞(ES)获得嵌合体动物;随后用嵌合体动物与野生型个体交配得到突变基因的杂合体动物;最后才能通过杂合体动物之间的交配来生产纯合体动物。而四倍体补偿技术生产基因敲除动物可以绕过嵌合体而直接获得完全来自ES细胞的杂合体动物,将大大缩短生产基因敲除动物时间。所以,建立利用四倍体补偿法克隆ES小鼠的平台,为以后用此方法制备基因敲除猪等家畜,进而研究突变基因功能及生产各种疾病模型动物具有非常重要的意义。本研究以囊胚内细胞团占总细胞比例和细胞凋亡指数作为鉴定囊胚质量的指标,讨论了小鼠EG细胞团与四倍体胚胎按照1:1、1:2、1:3叁种聚合法、微滴与微孔两种培养载体以及EG细胞数对制备聚合胚胎的影响,获得了采用1:2聚合法、微孔培养载体和15个EG细胞来制备的聚合胚胎质量相对较好,建立了四倍体补偿法克隆小鼠的平台。同时,本研究探讨了胎龄和饲养层对分离培养小鼠EG细胞的影响以及不同胎龄原代EG细胞、不同个体EG细胞、不同代数EG细胞中两个印迹基因Igf2和H19差异甲基化区域甲基化水平的异同,得出了通过采集11.5dpc和12.5dpc小鼠生殖嵴分离原始生殖细胞在小鼠成纤维细胞饲养层上分离培养EG细胞比采集13.5dpc小鼠生殖嵴原始生殖细胞在STO饲养层上培养效果好的结论;发现不同胎龄、不同个体及不同代数EG细胞对两个印迹基因Igf2和H19差异甲基化区域(DMR)的甲基化水平没有变化,虽然雄性EG细胞比雌性EG细胞中两个印迹基因Igf2和H19 DMR的甲基化水平高。另外,利用差异染色和TUNEL法检测了四倍体囊胚质量表明,四倍体囊胚无论总细胞数、内细胞团细胞数、滋养层细胞数还是内细胞团细胞数占总细胞数比率都比二倍体囊胚的少,而且四倍体囊胚细胞凋亡指数也比二倍体囊胚的高,说明四倍体在囊胚期质量就很差;利用小鼠抗5-甲基胞嘧啶(5MeC)单克隆抗体检测了利用电融合的方法制备的四倍体胚胎在融合过程中出现了逐步去甲基化的过程,而且四倍体早期胚胎的基因组甲基化模式也与二倍体早期胚胎基因组甲基化模式不同;而且,四倍体囊胚期印迹基因H19发生了沉默,并且两个印迹基因Igf2和H19 DMR的甲基化水平也同体内二倍体囊胚中的不同。这些可能都是影响四倍体胚胎后期不能发育的原因。
肖红[7]2011年在《小鼠四倍体补偿技术的初步探讨》文中研究说明胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)是具有自我更新和多向分化潜能的胚胎细胞,具有向机体各种组织细胞分化的能力,又称为全能干细胞。小鼠二倍体胚胎经电融合可产生四倍体胚胎,这些胚胎与孤雌、孤雄生殖一样不能发育成正常个体。ES细胞与四倍体胚胎形成嵌合体的过程中,ES细胞广泛参与胚体、尿囊、羊膜、绒毛膜中胚层和卵黄囊中胚层的形成,而四倍体来源的细胞主要分布在胚外组织,如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜、胎盘等,几乎不参与胎儿本身的形成。因此,如果将ES细胞与四倍体胚胎嵌合,使二者的发育能力互相补偿,就有可能得到完全由ES细胞发育而来的个体,这种技术被称为四倍体补偿技术(tetraploid embryo complementation),所得到的小鼠称为ES小鼠。Nagy等在1993年首次用聚合法得到了完全由ES细胞发育而来的ES小鼠。随后,更多人利用四倍体囊胚注射法来获得ES小鼠。1.电融合获得四倍体胚胎及其发育能力比较利用昆明小白鼠2细胞期胚胎进行电融合、经体外培养得到四倍体囊胚,对电融合条件进行了摸索,结果在交流电1-2V排序、直流电50V电击、脉冲时程35μs、脉冲次数2次的条件下2细胞融合率达到99.5%,囊胚率达到74.7%,与正常2N囊胚率(84.2%)相比无显着差异,说明四倍体胚胎与正常囊胚的的发育能力相当。2.绿荧光干细胞的体外培养及鉴定采用国产丝裂霉素处理小鼠成纤维细胞作为饲养层来接种胚胎干细胞,丝裂霉素的浓度为30μg/ml,处理4h；按常规的方法培养ES细胞,ES细胞完全培养基为DMEM,内含0.1mmol/Lβ-巯基乙醇,50U/ml青霉素,50 mg/L链霉素,15%胎牛血清,1000 U/ml LIF。ES细胞在饲养层上呈克隆状生长,具有良好的形态,用碱性磷酸酶染色、SSEA-1染色、OCT-4染色对ES细胞进行鉴定均为阳性,表明ES细胞可用于后续实验。3.ES细胞的囊胚注射及胚胎移植采用Eppendorf显微操作系统将干细胞注射入囊胚。每枚四倍体囊胚注射15个左右的ES细胞,将注射后胚胎移植到2.5天假孕母鼠子宫中,每侧移植10枚左右,等待自然分娩或剖腹产。结果注射ES细胞到四倍体囊胚后,可见绿荧光ES细胞掺入内细胞团；移植到假孕2.5天的母鼠子宫内,子宫膨大且子宫内膜可见绿荧光,但未出生小鼠,表明可能是胚胎着床发育到一定阶段被吸收。
郭庆[8]2015年在《利用CDK抑制剂—SU9516体外生产猪孤雌激活四倍体囊胚》文中认为现如今,四倍体广泛的应用在动物繁殖技术领域中,特别是在干细胞中利用四倍体和二倍体制备嵌合体来研究动物胚外组织缺陷。通过不同的技术有多种四倍体囊胚的制作方法,但是不同制备方法都存在不同程度的优缺点,需要不断开发新的四倍体制备方法。因此,本研究使用一种新型细胞周期性依赖激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)抑制剂SU9516体外高效诱导猪孤雌激活(parthenogenetic activation, PA)四倍体囊胚。SU9516可以通过抑制猪PA胚胎第二极体的排出以及抑制中心体复制两方面来体外制备猪PA四倍体囊胚。同时,SU9516可以通过抑制CDKI活性间接降低MPF活性来提高猪PA胚胎体外发育能力。本研究主要包括以下几个实验：一、SU9516体外制备猪PA四倍体囊胚。试验1：电激活猪胚胎之后,在猪PA胚胎体外培养液中添加不同浓度SU9516促进猪其体外发育能力。结果表明：添加10 μMSU9516与其他浓度(1 μM,5 μM,100μM)及素对照组5 μg/ml细胞松弛(cytochalasin B, CB)相比可以显着地提高猪PA胚胎体外发育能力(47.5% vs.26.2%,28.9%,40.6%, and 25.8%, P< 0.05)。用最佳浓度(10μM)SU9516处理不同的时间后观察胚胎体外发育能力,结果表明：SU9516处理4h猪PA胚胎具有最好的体外发育能力(47.5%vs.39.0%,33.7%, and 39.1%).试验2：电激活猪PA胚胎之后,分别利用添加10 μM SU9516或5μg/ml CB的体外培养液中处理2h后观察猪PA胚胎第二极体的排出情况。结果表明：10μMSU9516组,5 μg/ml CB组与未处理组相比显着地降低了第二极体的排出率(14.0%,13.8% vs.78.8% P< 0.05).为了确定囊胚的染色体组数,对SU9516组合、CB组处理后获得的猪PA囊胚进行核型分析。结果显示：SU9516处理组的囊胚中四倍体率显着地高于CB处理组(55.8%vs.14.0 P<0.05)试验3：为了进一步确认不同处理组中猪PA囊胚的染色体组数。利用Hoechest33342染色不同处理组中的细胞数目。结果表明：SU9516处理组中囊胚细胞数显着地低于CB组以及6-DMAP组(34.4±17.5bvs.46.4±10.5a,45.1±10.6a)。二、SU9516抑制MPF活性提高猪PA胚胎体外发育能力。实验1：分别检测10μM SU9516和5μg/ml CB处理猪PA胚胎4 h后MPF表达活性。结果显示：SU9516处理下的猪PA胚胎MPF活性水平显着地低于CB组(103.2pg/ml vs.131 pg/ml)。总结：1、1)SU9516处理提高猪PA胚胎体外发育能力最佳条件为10μM,4 h。2)SU9516可以抑制猪PA胚胎第二极体排出和诱导猪PA四倍体囊胚。3)SU9516处理可以显着地降低猪PA囊胚细胞数。2、SU9516通过对MPF活性的改变来提高猪PA胚胎体外发育能力。
吕珊[9]2018年在《小鼠四倍体补偿技术体系建立与优化研究》文中指出四倍体补偿法又被称为两步克隆法。是将四倍体(4n)胚胎与二倍体(2n)胚胎或胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells,ES细胞)聚合,形成嵌合体。在发育过程中4n细胞主要参与胚外组织(如滋养层、卵黄囊膜、尿囊膜和胎盘等)形成而几乎不参与胚体的形成。从而可得到几乎完全2n胚胎或ES细胞来源的小鼠,此即为四倍体补偿技术。目前通过体细胞核移植获得克隆鼠的效率较低,只有1%-4%,大多数的克隆胚死于着床后早期发育过程中,少部分可发育如期的胚胎也会产生较大的胎盘和胎儿,造成难产。即使侥幸存活下的胎儿,大多数也因呼吸系统和血液循环系统存在问题而难以存活。四倍体补偿技术可以有效提高克隆效率,成为生产转基因动物的有效的方法。目前四倍体补偿技术在测试细胞全能性,研究基因功能,研究胚胎发育机理以及动物克隆上有非常广泛的应用。本试验采用电融合法制作4n胚胎,对最适电融合参数进行初步探索。研究发现在本试验室条件下当电压为100 v/mm,脉冲宽度为50μs,脉冲次数为2次时,融合率可达到95.27%。对小鼠胚胎采集及培养方法进行改进,大大提高胚胎囊胚率。4n胚胎的囊胚率为93.42%,与2n胚胎(94.41%)相比差异不显着(P>0.05)。免疫荧光染色发现,4n胚胎相比于2n胚胎而言,细胞核较大,细胞数目少,多能性转录因子Oct-4表达水平低。通过qRT-PCR检测2n胚胎与4n胚胎中多能性转录因子Oct-4、Nanog,促凋亡基因Bax以及抑凋亡基因Bcl-2的mRNA水平。结果发现4n胚胎中Oct-4、Nanog m RNA水平虽高于2n胚胎,但差异不显着(P>0.05)。Bax mRNA水平高于2n胚胎(P<0.05),Bcl-2 mRNA水平与2n胚胎相比差异不显着。当胚胎发育至4-8细胞期时,进行ES细胞注射,每枚胚胎注射6-8个细胞。或发育至囊胚时,每枚胚胎注射15个左右ES细胞。结果发现4-8细胞期注射优于被广泛应用的囊胚注射。成功获得嵌合胚后移植入假孕母鼠体内。共移植18只假孕母鼠,其中有两只母鼠子宫膨大,有球状突起。另有一只小鼠剖腹产得一足月嵌合体小鼠,体长约3.5 cm,体重约2.06 g。对嵌合鼠各组织进行检测,在其心脏、肝脏、大脑和睾丸中检测到ES细胞所带标签,证实ES细胞确实参与胎儿发育。成功建立利用昆明白小鼠进行四倍体补偿技术并对其进行优化。
周汝江, 陈建泉, 胡以平, 成国祥[10]2005年在《小鼠遗传背景对4n胚胎及2n-4n聚合胚制作效率的影响》文中指出不同品系小鼠的 2 细胞期胚胎 (二倍体 ,2n) ,经电融合后 ,获得发育的 4 细胞期四倍体胚胎 (4n)的能力上存在着差异。将不同品系小鼠的 2n、 4n胚胎分别配对作聚合 ,所获 2n 4n聚合胚的发育结果表明 :在着床前 ,2n 4n聚合胚的获得率因胚胎品系组合的不同而异 ;胚胎移植后 ,聚合胚在与 4n胚胎相同或相近品系的移植受体中 ,其着床率较高 ;在着床后胎儿及出生仔鼠的获得率上 ,采用遗传杂合性的 2n胚胎所组成的 2n 4n聚合组合较高。上述结果提示 :小鼠的遗传背景可影响到 4n胚胎及相应 2n 4n聚合胚的制作效率。以GFP标记跟踪2n 4n聚合胚 4n细胞着床后的发育命运 ,发现 :妊娠中后期的孕体中 ,4n细胞限制性地分布至胚外组织
参考文献：
[1]. 小鼠二倍体-四倍体聚合胚的制作及其发育特性的研究[D]. 周汝江. 第二军医大学. 2004
[2]. 小鼠四倍体胚胎凋亡及GSH和β-巯基乙醇对其影响的研究[D]. 杨悦. 东北农业大学. 2012
[3]. 遗传背景对小鼠四倍体胚胎发育的影响[D]. 温晓辉. 河北农业大学. 2008
[4]. 牛孤雌多倍体胚胎与克隆多倍体胚胎的研究[D]. 白春玲. 内蒙古大学. 2011
[5]. 小鼠胚胎干细胞的分离及鉴定[D]. 邸科前. 河北农业大学. 2007
[6]. 四倍体补偿法克隆EG小鼠技术及相关机制的研究[D]. 员新旭. 中国农业科学院. 2009
[7]. 小鼠四倍体补偿技术的初步探讨[D]. 肖红. 内蒙古大学. 2011
[8]. 利用CDK抑制剂—SU9516体外生产猪孤雌激活四倍体囊胚[D]. 郭庆. 延边大学. 2015
[9]. 小鼠四倍体补偿技术体系建立与优化研究[D]. 吕珊. 西北农林科技大学. 2018
[10]. 小鼠遗传背景对4n胚胎及2n-4n聚合胚制作效率的影响[J]. 周汝江, 陈建泉, 胡以平, 成国祥. 动物学报. 2005