徐文秀
（苏州市中医医院重症医学科江苏苏州215000）
【摘要】目的：应用PCR-DGGE技术对MODS患者舌苔菌群多样性进行研究，分析其与疾病关系。方法：收集了26例MODS患者和20例正常对照人群的舌苔样本，提取样本细菌总基因组DNA。根据中医辨证分型，分为实热证组、热夹湿证组、热盛伤阴证组、血瘀证组和厥脱证组。然后对细菌总基因组DNA的16SrRNA的V3区进行PCR扩增，进行DGGE图谱及多样性分析，分别分析MODS患者及对照人群舌苔菌群的相似性，并通过Shannon-Weaver(H‘)指数来分析样本的条带数、均匀度指数、多样性指数、丰富度指数和优势度指数。结果：实热证组和对照组条带数、多样性指数、优势度指数(和丰富度指数均存在显著差异，均匀度指数两组未存在差异；热夹湿证组和对照组条带数和丰富度指数存在显著差异；热盛伤阴证组和对照组条带数、多样性指数和丰富度指数存在显著差异；血淤证组合对照组条带数刚好0.05，而丰富度指数存在显著差异。厥脱证组和对照组各项指标均没有存在存在显著差异。结论：MODS患者舌苔菌群多样性与疾病有关，它们与MODS的关系尚需进一步的探索。
【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2015）31-0198-02
MODS是危重病患者的常见并发症。Mayr等[1]对ICU危重患者死亡原因及危险因素进行分析，MODS占ICU死亡率的47％，排在首位。很多ICU患者经历了由全身炎症反应综合征，感染，脓毒症，脓毒症休克的过程，最后发展为多器官功能障碍综合征（MODS）。目前国内外最常用的是加拿大Marshall[2]MODS评分和1995年全国危重病急救医学学术会议[3]上提出并通过了MODS诊断标准。中医讲舌苔是胃气上蒸而成，望舌可以判断正气的盛衰，分辨病位的深浅，区别病邪的性质，判断病邪的进退。本研究通过对不同辩证患者舌苔样本的PCR-DGGE分析，观察其在MODS中的作用。
1.资料与方法
1.1收集2010年10月-2012年3月苏州市中医医院重症医学科和苏州大学附属第二医院重症医学科26例符合标准MODS患者的舌苔标本，同时采集20例同期健康体检者舌苔标本。入选标准：符合以上多器官功能不全的诊断标准存在2个或2个以上系统或器官功能障碍。年龄大于18周岁的成年人。以感染为诱因导致的多器官功能不全[2-3]。排除标准：住院时间小于3天的患者。
1.2舌苔样本采集
取样前12小时患者不使用消毒液清洁口腔。由2名有经验的医师观察患者舌苔，并根据患者总体病情进行辩证分型[4]。用消毒棉签留取舌苔样本，进行PCR-DGGE检测。
1.3统计学方法
所有数据均采用均数±标准差表示(x-±s)，采用SPSS20.0统计软件中t检验与方差分析进行处理。
2.实验结果
2.1MODS患者分组
采集MODS患者舌苔标本26例。将其分为实热证4例；热夹湿证6例；热盛伤阴证7例；血瘀证5例；厥脱证4例。同时采集同期健康体检老人志愿者舌苔标本20例。MODS患者组年龄为73.13±14.80，对照组年龄为73.70±8.77，经SPSS20.0做t检验得t=-0.155,P=0.877，可见年龄差别无明显统计学意义。
2.2分别将实热证组、热夹湿证组、热盛伤阴证组、血瘀证组、厥脱证组与对照组进行DGGE图谱分析。
2.2.1实热证组和对照组，两者条带数（4.75±3.59，14.2±2.28）、多样性指数（0.93±0.26，2.06±0.38）、优势度指数（0.53±0.10，0.78±0.12）和丰富度指数（0.50±0.50，1.57±0.20）均存在显著差异。均匀度指数两组未存在差异，可见实热证患者舌苔细菌种类和数量较少。
2.2.2热夹湿证组和对照组比较，其中条带数（5.60±2.60，9.40±2.07）和丰富度指数（0.26±0.29，1.04±0.21）存在显著差异。
2.2.3热盛伤阴证组和对照组比较，其中条带数（4.50±1.76，10.50±4.32）、多样性指数（1.11±0.30，1.81±0.57）和丰富度指数（0.48±0.23，1.15±0.47）存在显著差异。
2.2.4血瘀证组和对照组比较，组两者条带数、均匀度指数、多样性指数、优势度指数和丰富度指数。其中条带数刚好0.05，而丰富度指数（0.49±0.32，0.99±0.27）存在显著差异。
2.2.5厥脱证组和对照组比较，组两者条带数、均匀度指数、多样性指数、优势度指数和丰富度指数。各项指标均没有存在存在显著差异。
3.讨论
多器官功能衰竭是ICU最常见的疾病，也是最常见的死亡原因。而脓毒症导致的MODS是其中最常见的原因，也是ICU研究的热点之一。中医药在危重症患者的抢救中发挥了重大的作用[4]。舌苔是中医四诊中望诊的主要内容，以往的研究发现，舌苔中转化生长因子-α(TGF-α)和表皮生长因子受体(EGF-R)的表达水平与胃癌患者舌苔形成有关系。胃腺癌组血清TGF-α的含量明显低于正常对照组[5]。也有关于干燥综合征患者舌苔细胞的研究发现，气阴两虚型和阴虚内热型患者舌苔细胞凋亡基因阳性率高于气滞血瘀患者和气虚失运型[6]。而有关多器官功能障碍患者舌苔研究较少，我们的研究试图通过对MODS患者与正常人舌苔菌群结构进行对比，为MODS的研究奠定一定的基础。
我们的研究发现，危重症MODS以老年患者为主，平均年龄73岁。随着老龄化的加剧和人民生活水平的提高，该病人群体将日益扩大。在我们的病人中，实热证患者的APACHⅡ相对较低，热盛伤阴证患者APACHⅡ相对较高，这体现了疾病由表及里的发病过程，这与脓毒症致脓毒症休克最后导致多器官功能障碍在中西医学上有共通之处。
口腔在生理上存在很多细菌，而舌苔表面也存在。因含有细菌的种类和数量较多，无法通过常规培养或涂片来分析。PCR-DGGE的方法是通过酚/氯仿法提取舌苔表面细菌的基因组DNA，并对其中的16SrDNAV3可变区进行聚合酶链式反应（PCR）后进行变性梯度凝胶电泳，通过软件来进行舌苔细菌结构相似性分析。既往有研究通过PCR-DGGE观察胃炎患者的细菌多态性[7]，我们通过其来观察MODS患者舌苔细菌谱的特点。
在实热证患者中，细菌的条带数，优势度指数，丰富度指数均存在差异，表明细菌的数量和种类减少。而在热夹湿证组和热盛伤阴组中，两者也存在减少。热证主要以发热，舌红，舌苔黄为主。实热证兼有喜冷饮，脉洪大。有研究表明使用通腑剂可改善实热证肺炎患者[8]。热夹湿，叶天士“湿与温合,蒸郁而蒙蔽于上，清窍为之壅塞，浊邪害清也”。热盛伤阴证，是疾病发展过程，由表及里的表现，累及津液的丢失。虽然三种热证病理病机不同，但在舌苔细菌中均大致表现为：舌苔细菌种类和数量的减少。血瘀证表现为舌质暗红，气血淤滞的表现，其与老年患者常见的糖尿病、高血压均有一定的关系[9]。厥脱证为邪毒内陷或内伤脏气或亡津失血所致的气机逆乱、正气耗脱的一类病证[10]。我们发现血瘀证组合绝脱证组合对照组比较在条带数、均匀度指数、多样性指数、优势度指数和丰富度指数均没有发现明显统计学差别。当热证时，机体正气尚存，仍可与病邪相抗争，在舌苔表现为细菌谱的种类和数量的减少。而血淤证和厥脱证，正气弱时，舌苔细菌谱种类和数量与对照组无异。
本文通过观察不同中医辩证MODS患者的舌苔细菌谱的变化。了解热证患者舌苔细菌谱多样性明显减少，而血瘀证和厥脱症患者舌苔细菌没有差别。由于实验条件的限制，本研究未对所有细菌的具体种属进行分析，这有待于以后进一步的研究。
【参考文献】
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