周晓馥, 王兴智[1]2003年在《病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草(Nicotiana bentha miana)rbcs基因功能的研究》文中研究指明RNA沉默是一种序列特异性的RNA降解过程 ,主要作用于同源性较高的转录产物 ,它广泛存在于各种生物中 ,在植物中称转录后基因沉默 (Post TranscriptionalGeneSilencing ,PTGS)、动物中称为RNA干扰(RNAinterference ,RNAi)、真菌中被称为RNA压制 (RNAquelling)。病毒诱导转录后基因沉默是由携带基因片段的病毒载体感染植物引起相应的寄主基因沉默的现象 ,是一种典型的RNA沉默现象。本论文建立了病毒载体诱导转录后基因沉默系统 ,并运用该体系研究烟草 (Nicotianabenthamiana)的 1,5二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶小亚基 (Ribulose - 1,5 -bisphosphate (RuBP)carboxylase/oxylasesmallsubunit,rbcS)基因的部分功能。具体包括以下内容 :1、分别用携带与 1,5二磷酸核酮糖羧化酶 /加氧酶小亚基 (rbcS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体 (pTV rbcS)和马铃薯X病毒载体 (pgR10 7 rbcS)侵染烟草 (Nico tianabenthamiana) ,诱导内源rbcS基因沉默 ;2、分别用携带与八氢番茄红素脱氢酶 (phytoenedesat urase ,PDS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体 (pTV PDS)和马铃薯X病毒载体 (pgR10 7 PDS)侵染烟草 (Nicotianabenthamiana) ,诱导内源PDS基因沉默 ;3、利用携带与绿色荧光蛋白 (GFP)同源的cDNA片段的烟草脆裂?
周晓馥[2]2003年在《病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草（Nicotiana benthamiana）rbcS基因功能的研究》文中提出RNA沉默是一种序列特异性的RNA降解过程，主要作用于同源性较高的转录产物，它广泛存在于各种生物中，在植物中称转录后基因沉默(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)、动物中称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)、真菌中被称为RNA压制(RNA quelling)。病毒诱导转录后基因沉默是由携带基因片段的病毒载体感染植物引起相应的寄主基因沉默的现象，是一种典型的RNA沉默现象。 本论文建立了病毒载体诱导转录后基因沉默系统，并运用该体系研究烟草(Nicotiana benthamiana)的1，5二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基(Ribulose—1，5—bisphosphate(RuBP)carboxylase／oxylase small subunit,rbcS)基因的部分功能。 具体包括以下内容：1、分别用携带与1，5二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶小亚基(rbcS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.rbcS)和马铃薯X病毒载体(pgR107.rbcS)侵染烟草(Nicotiana benthamiana)，诱导内源rbcS基因沉默；2、分别用携带与八氢番茄红素脱氢酶(phytoene desaturase, PDS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.PDS)和马铃薯X病毒载体(pgR107.PDS)侵染烟草(Nicotiana benthamiana)，诱导内源PDS基因沉默；3、利用携带与绿色荧光蛋白(GFP)同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.P)侵染转基因烟草(Nicotiana benthamiana 16c)，诱导转基因烟草的GFP基因沉默。4、运用该沉默系统在以下几个水平研究rbcS基因功能：(1)、rbcS基因沉默后的表型分析；(2)、rbcS基因沉默后的转录水平分析；(3)、rbcS基因沉默后的蛋白质表达水平分析；(4)、运用HPLC方法，定量分析rbcS基因沉默后的光合色素变化；(5)、用红外气体分析仪(LI-6400P，LI-COR Inc.)测定烟草rbcS基因沉默的一些重要生理指标；(6)、用两因素方差分析模型和F检验结合分子生物学证据分析病毒载体作为研究基因功能的媒介的可行性以及运用病毒诱导转录后基因沉默系统研究核酮糖1，5二磷酸羧化酶／加氧酶小亚基基因功能的可行性。 通过对上述问题的研究，我们得出以下结论：（）建立、完善、优化了病毒诱导转录后基因沉默系统，确定了病毒诱导基因沉默瞬时表达体系中烟草最佳侵染时期（六叶期刀－24天）和用于侵染的重组农杆菌的浓度（OD值为l～1．5）；（二）初步揭示了转基因植物与非转基因植物在基因沉默机制上的异同；（3）烟草脆裂病毒载体比马铃薯X病毒载体在农杆菌介导的病毒诱导转录后基因沉默体系中更具优势；（4）烟草RllbiSCO小亚基的表达量动态地调节了RllbiSCO大亚基的表达量； （5）烟草 RbcS基因与光合作用中的光能收集无关；（6）烟草 RbcS基因在调控RubiSCO活性方面起着重要作用；（）烟草RbCS基因在调控RubiSCO的竣化效率方面起着重要作用；（8）方差分析中的两因素方差分析和 F枪验证据表明：烟草脆裂病毒载体作为研究核酮糖 1，5二磷酸竣化酶／加氧酶小亚基基因功能的媒介具有可行性，而马铃薯X病毒载体具有一定的局限性。
周晓馥, 麻鹏达, 王仁厚, 朱筱娟, 刘宝[3]2005年在《转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能》文中进行了进一步梳理初步建立了利用病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草(Nicotianabenthamiana)1,5 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose 1,5 bisphosphatecarboxylase/oxylasesmallsubunit,rbcS)基因功能的模式。用携带与1,5 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.rbcS)侵染烟草(Nic otianabenthamiana),诱导内源rbcS基因沉默并在此基础上建立了研究rbcS基因功能的模式:初步进行了rbcS基因沉默后的表型分析、转录水平分析、蛋白质表达水平分析以及利用HPLC方法定量分析rbcS基因沉默后的光合色素变化。结果表明:病毒诱导基因沉默瞬时表达体系中烟草最佳侵染时期为苗龄21～24d,用于侵染的重组农杆菌的最佳浓度的OD值为1～1.5;烟草Rubisco小亚基的表达量可能调节Rubisco大亚基的表达量;烟草rbcS基因与光合作用中的光能收集无关。对rbcS基因沉默的烟草叶片及对照烟草叶片的部分重要光合作用指标分析表明, 运用烟草脆裂病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能具有可行性,为进一步深入研究rbcS基因功能奠定了基础。
周晓馥, 王兴智[4]2003年在《利用转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能的模式的建立》文中研究指明本文初步建立了利用病毒载体诱导转录后基因沉默系统研究烟草(Nicotiana benthami-ana)的1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(Ribulose—1,5—bisphosphate(RuBP)car-boxylase/oxylase small subunit,rbcS)基因功能的模式。分别用携带与1,5二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶小亚基(rbcS)基因同源的cDNA片段的烟草脆裂病毒载体(pTV.rbcS)和马铃薯X病毒载体(pgR107.rbcS)侵染烟草(Nicotiana benthamiana),诱导内源rbcS基因沉默并在此基础上建立研究rbcS基因功能的模式:进行了rbcS基因沉默后的表型分析、rbcS基因沉默后的转录水平分析、rbcS基因沉默后的蛋白质表达水平分析以及利用HPLC方法、定量分析rbcS基因
黄昌军[5]2009年在《双生病毒DNA1分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用》文中研究表明病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是指携带一段植物功能基因cDNA的病毒载体侵染植物后诱导植物功能基因发生沉默,通过产生的表型或生理指标变化来反映该基因功能的一种方法。本文利用烟草曲茎病毒(TbCSV)DNA1卫星构建了一种新型的基因沉默载体2mDNA1。该载体能与同源辅助病毒一起侵染烟草植物,可以抑制转基因GFP和内源基因Su的表达,产生明显的表型突变。利用2mDNA1还可以与异源双生病毒中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)在植物上建立有效的基因沉默体系。该体系不仅可以抑制转基因GFP的表达,也可以抑制内源基因Su的表达,并且不产生任何的病毒症状。它可以诱导分生组织特异性表达和胚胎致死的pCNA基因发生沉默;可以在矮牵牛花上沉默CHS基因;并且该体系也可以同时抑制两个基因的表达;在该载体上插入170 bp-1155 bp的片段都可以诱导有效的基因沉默;此外,它在所有已测定的6种寄主植物都能诱导高效的基因沉默。因为DNA1能够与不同的辅助病毒相伴随,扩大了DNA1的寄主范围,使得DNA1能够在更多的寄主上进行功能基因的研究。利用2mDNA1和TbCSV对其在普通烟中的沉默体系进行了优化,优化后的沉默体系不仅能够高效沉默转基因普通烟,也能在多个普通烟品种中高效沉默植物内源基因Su,并且沉默效果持久,沉默可以在18-32℃温度下诱导。利用DNA1沉默载体,开展了基因功能的研究。从本氏烟扩增到TOM类寄主因子NbTOM1和NbTOM3的基因片段,通过沉默研究证明NbTOM1和NbTOM3的沉默能够降低TMV的复制,但是只有同时沉默NbTOM1和NbTOM3两个基因才能够完全抑制TMV的复制,表明NbTOM1和NbTOM3是TMV复制所需的寄主因子。利用TbCSV和2mDNA1研究了普通烟NtEDS1基因在N基因介导的抗TMV中的作用。当MEDS1被沉默后,TMV在含N基因普通烟中不再产生过敏性反应(HR),而表现出TMV系统侵染的病毒症状。证明了NtEDSl在TMV诱导的HR反应中有着重要作用,这是利用VIGS在普通烟中研究抗病相关基因的首次报道。利用2mDNA1和TYLCCNV的沉默体系初步研究了本氏烟中叶片发育相关基因NbPHAN的功能。当NbPHAN被沉默后叶片发育产生明显的改变。叶片背腹极性改变,叶片皱缩、下卷并在叶片上表面产生耳突。全基因比对发现NbPHAN是典型的ASl/PHAN类的基因,包含保守的MYB核酸结合域以及C端的CTD结构域。酵母双杂交试验发现NbPAHN和AtAS1一样,能够和拟南芥中的AtAS2互作,决定这种互作的氨基酸位于NbPHAN的中间区域;NbPHAN也能够自我互作并且保守的C端CTD域决定了这种互作。NbPHAN定位在核仁内,并且基因MYB结构域决定了该基因的亚细胞定位。下一步将继续研究NbPHAN基因在致病性中的作用。
张茜[6]2014年在《观赏花烟草（Nicotiana sanderae）VIGS体系构建与优化》文中研究指明观赏花烟草(Nicotiana sanderae)是茄科烟草属福吉特氏烟草(Nicotiana forgetiana)和花烟草(.Nicotiana alata)的杂交种,花色艳丽且具有香味,十分适合进行花色花香基因功能的研究。为了搭建起大规模验证观赏花烟草新型花色花香基因功能的技术平台,我们利用由烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus, TRV)构建而来的重组病毒载体,以八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)基因和查尔酮合酶(chalcone synthase, CHS)基因为报告基因,进行了观赏花烟草病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)体系的初步构建与优化,结果如下：1、以PDS基因作为报告基因的试验中,用根吸收法侵染观赏花烟草浸种催芽至0.5-1cm长的幼根,种子点播后成活率均低于30%,且成活的样本在其整个生命周期内均未出现过叶片光漂白的预期现象,证明根吸收法并不适用于诱导观赏花烟草的基因沉默；而常规播种养护至观赏花烟草五叶期或六叶期再使用扩大培养浓度为OD600=1.1的农杆菌菌液制备侵染液,用叶背注射渗透法(注射器不带针头)向最内轮叶片叶背打入200-400μ1侵染液进行叶片侵染,此后将植株置于光照培养箱中,先设定16h为25℃、8h为18℃在全黑暗条件下培养1天,再设定光温周期为光照16h25℃/黑暗8h18℃进行常规养护,25天后处理组中表现出预期叶片光漂白现象的植株占到80%;2、利用"siRN A Scan"筛选出能有效产生21nt siRNA的CHS基因片段,用不依赖连接的克隆(Ligation-Independent cloning, LIC)法构建重组病毒载体pTRV2-CHS,检测阳性率达100%；3、以CHS基因作为报告基因的试验中,采用前述VIGS技术体系进行叶片侵染及培养,注射侵染30天后或45天后(此时已入秋,气温不高于28℃)将植株从光照培养箱移至夜间加光3h的温室大棚中,常规养护,植株开花后成功表现出预期花冠褪红斑白现象的植株占到60%,RT-PCR检验CHS基因确有下调；而进行生长点侵染的处理组植株均未获得预期表型。
王卫[7]2010年在《叁种激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的克隆及其功能分析》文中研究表明植物病原菌产生的激发子是一类重要的信号分子,能模仿植物与病原菌的信号交流,引起过敏性细胞死亡(hypersensitive cell death,HCD)和气孔关闭,诱发植物的抗病性。本研究采用病毒诱导基因沉默(virus inducing gene silencing,VIGS)技术克隆了本氏烟(Nicotiana benthamiana)中受不同来源激发子(Nep1、harpin和INF1)诱导的调控过敏性细胞死亡的基因,并对其中一个调控过敏性细胞死亡的基因NbALY916进行了系统的功能研究。以农杆菌Gv3101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有7000个单克隆的本氏烟cDNA文库,采用牙签刺伤法和注射接种法,从6000个克隆中筛选到35个受不同激发子诱导的调控过敏性细胞死亡的基因(片段)。对上述阳性克隆进行序列测定和分析,发现其中14个与已知的基因具有较高的同源性,其中克隆Nb14-4编码一个特异的ALY蛋白；克隆Nb14-56编码普通烟中的一种捕光叶绿素a/b结合蛋白；克隆Nb38(2)-59编码一个核糖核蛋白RNP-1；克隆Nb3-9和Nb4-26分别编码一个苹果酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶；Nb4-28编码普通烟中的14-3-3 d-2蛋白。还有21个克隆在公共数据库中没有同源基因,提示可能是因克隆到的片段过小或数据库中本氏烟EST序列不全造成的。上述结果表明,利用病毒表达载体建立cDNA文库,采用病毒诱导基因沉默技术可从烟草全基因组内克隆受不同激发子诱导的过敏性细胞死亡的调控基因,为揭示植物过敏性细胞死亡分子机制提供试验依据。从本氏烟cDNA文库中筛选到一个调控过敏性细胞死亡的基因NbALY916,该基因沉默能抑制Nep1诱导的HCD,减缓harpin诱导的HCD,但不影响INF1诱导的HCD；而本氏烟中其它的叁个ALY基因(NbALY615、NbALY617和NbALY1693)分别沉默后不影响3种激发子诱导的HCD,表明NbALY916在调控激发子诱导的HCD过程中具有特异性。NbALY916基因沉默削弱了激发子Nep1和harpin诱发的H2O2积累、抑制了它们诱导的气孔关闭和保卫细胞中NO的积累,但是对激发子INF1信号途径却没有影响,同时不影响3种激发子诱导的保卫细胞内活性氧的积累。表明NbALY916在不同激发子诱导气孔关闭及NO和H2O2积累中作用存在差异。与此同时,NbALY916沉默能抑制激酶MAPKKKα过表达所诱导的过敏性细胞死亡,抑制转录因子WRKY2的表达,但不影响MAPKKKα、MEK2和WIPK基因的转录水平；而它在MAPKKKα、MEK2和WLPK基因沉默植株中的表达却受抑制。此外,NbALY916基因沉默还可抑制Nep1诱导的PR基因转录,进而影响植物抗病性。由此推测,NbALY916可能作用于MAPK级联途径的下游来介导激发子Nep1诱导的过敏性细胞死亡和抗病反应,而另外的两种激发子harpin和INF1可能通过激活其它不同的信号途径来进行信号传递。
王宏芝[8]2005年在《病毒诱导的基因沉默体系优化及烟草DHS基因功能研究》文中提出随着植物基因组计划的深入开展,研究重点已转向重要基因挖掘及功能鉴定。但目前尚缺乏有效的方法对DNA序列在植物体中的生物学功能进行大规模鉴定。近几年新发展的病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silence,VIGS)技术,可以利用携带目标基因的病毒载体侵染植物,诱导相关基因沉默,根据基因被抑制的表型推断目标基因的功能。由于VIGS技术操作简单,周期短,有望成为大量分析cDNA序列功能快速、有效的方法。 为了VIGS技术大规模应用于植物基因功能研究作好准备,以及探讨VIGS技术用于植物发育相关基因功能研究的可行性,本研究以PDS作为报告基因对农杆菌介导的病毒诱导基因沉默体系进行优化,并利用该系统研究了烟草(Nicotiana benthamiana)DHS(Deoxyhypusine Synthase)基因的功能,取得如下进展: 1.探讨了农杆菌接种浓度、接种植物的苗龄、病毒载体中插入片段与内源相关基因同源性对病毒诱导基因沉默效率的影响,结果显示一定范围内农杆菌接种浓度(OD值为0.6～2.0)对VIGS效率影响不明显;6叶龄幼苗是最佳接种时期,当接种苗龄大于6周的幼曲,无法诱导相关基因沉默;插入片段与内源相应基因的相似程度及完全一致片段的长度影响VIGS的发生效率。供试的4个巴旦杏(Prunus dulcis)同源片段,与烟草内源相关基因同源性分别为82-88%,均未产生预期的沉默症状。 2.利用VIGS系统,研究了烟草DHS基因的功能,成功获得DHS基因沉默表型。DHS抑制后植物表现多重反应,生长前期主要表现为生长增强,叶脉失绿,叶片叶绿素含量下降:后期植株的沉默表型有所分化,部分植株叶片自然衰老明显延迟,开花推迟;另一部分植株上部系统叶片失绿;极少数植株表现十分矮小,生长滞后。推测沉默表型分化与不同株系DHS基因被抑制的程度和持续时间及DHS靶蛋白elF-5A功能分化有关。此研究结果表明DHS基因参与多个生理过程,在植物生长与发育中起重要作用。可用于农作物、林木增产及园林绿化植物绿期延长的遗传改良研究及开发。本研究还证明,VIGS技术可用于植物发育相关基因的研究。
宋震[9]2013年在《柑橘碎叶病毒侵染性克隆构建及其诱导的基因沉默（VIGS）体系建立》文中进行了进一步梳理柑橘是世界第一大水果。我国柑橘栽培面积超过290万公顷,产量达3000万吨,均居世界第一位。随着克里曼丁红橘(Citrus clementina Hort. ex Tan)和甜橙(C. sinensis cv. Valencia)全基因组序列的公布,以及柑橘抗病、抗逆等相关基因序列表达标签(Expressed sequence tags, EST)的大量累积,柑橘基因功能解析已成为目前的研究热点和挑战之一。病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)是近年来发展的一种基因功能研究工具,与转基因、基因敲除、反义抑制等常用生物技术相比,试验周期短,不需要遗传转化,具有操作简便、成本低、高通量等优势。利用VIGS技术有望克服柑橘这种多年生木本作物童期长、遗传转化困难等瓶颈,加速其基因功能研究的进展。为此,本研究在柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus, CTLV)检测方法及多态性研究的基础上,筛选CTLV分离株进行全基因组cDNA扩增、侵染性克隆构建,并进一步开展了在模式植物本生烟(Nicotiana benthamiana)上建立VIGS体系的研究,以期为在柑橘上实施VIGS进而研究其基因功能奠定基础。主要研究结果如下：1. CTLV一步法及巢式RT-PCR检测体系建立通过引物比对,建立了CTLV的一步法及巢式RT-PCR检测体系。其中,一步法RT-PCR产物889bp,包含整个CP及3'UTR序列,比目前的常规RT-PCR操作简便,污染几率小；巢式RT-PCR检测灵敏度高,比一步法RT-PCR至少提高100倍,检测模板总核酸的最低浓度约1.27pg/μL。2. CTLV多态性分析建立了CTLV分子变异的Hinf Ⅰ/RFLP检测体系,定义RFLP组群9个,发现CTLV以单一RFLP组群侵染为主,其中RFLP Ⅰ和RFLP Ⅱ组群可能是优势流行组群,但也存在混合侵染。该体系简便、快速、重复性好,可用于大规模样品的分子变异检测。对收集保存的18份CTLV分离株进行了指示植物鉴定、3’端序列分析及RFLP检测。结果表明,在指示植物腊斯克枳橙(C. sinensis×Poncirus trifoliata cv. Rusk)上表现弱到中等强度症状的6个分离株均属于或携带有RFLP Ⅱ或RFLPⅢ组群,而其它RFLP组群均表现出强毒株特征。在根据3'端序列(889bp)构建的系统进化树上,CTLV分离株聚为了2个同源性组群,同源性组群A包含的8个序列均为RFLP Ⅱ或RFLP Ⅲ组群；同源性组群B则包含了其它RFLP组群的所有序列。同时,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在A组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物则划分在B组群。可见,指示植物上的弱(中)毒分离株侵染症状-RFLPⅡ或RFLPⅢ组群-同源性A组群叁者之间可能存在某种内在联系。RFLP组群检测可用于研究CTLV的分子变异,对于快速鉴定CTLV致病性强弱可能具有参考价值。3. CTLV基因组全长cDNA扩增及序列分析在通过RACE技术获得末端精确序列的基础上,建立了CTLV全长的RT-PCR体系,进而扩增并克隆了CTLV新会橙分离株及满头红分离株基因组全长cDNA。序列分析表明,CTLV-XHC(登录号KC588947)和CTLV-MTH(登录号KC588948)基因组全长均为6497nt[不包括3'poly(A)尾巴],均包含2个开放读码框,在推定的CP及MP上游均具有保守的亚基因组启动子核心序列‘'UUAGGU",与目前已报道的CTLV及苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus, ASGV)的基因组结构一致。同登录GenBank的所有CTLV及ASGV全基因组序列比对显示,CTLV-XHC与我国砂糖橘分离株CTLV-S序列一致性最高,为98%,在依据全基因组核苷酸序列构建的系统进化树上,CTLV-XHC与柑橘来源的CTLV分离株聚为一簇；有趣的是,CTLV-MTH与日本ASGV分离物序列一致性最高,为91%,而与台湾甜橙分离株CTLV-LC一致性最低,为82.0%,在系统进化树上CTLV-MTH与多数ASGV分离株聚为一簇。这一结果对于CTLV与ASGV的起源进化关系具有启示意义。4. CTLV侵染性克隆构建对6个CTLV基因组全长cDNA克隆进行体外转录并摩擦接种昆诺藜(Chenopodium quinoa),症状观察及RT-PCR检测结果表明,CTLV-XHC和CTLV-MTH的体外转录物具有侵染性。为获得适于农杆菌介导接种的CTLV侵染性克隆,以pCAMBIA1301为骨架构建了双元植物表达载体pCSSN:LB-2x35S-MCS-NOS-RB,通过瞬时表达GFP验证其有效性后,采用分步克隆策略将CTLV-XHC和CTLV-MTH分别插入到pCSSN载体2x35S启动子与NOS终止子之间。经筛选、鉴定获得了CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC和pCSSN-MTH。农杆菌介导的本生烟(N. benthamiana)注射接种实验表明,二者的侵染症状与野生型病毒对照无明显差异,接种时共表达沉默抑制子p19提高了pCSSN-XHC和pCSSN-MTH的侵染率。5. CTLV诱导的VIGS体系建立以CTLV侵染性克隆pCSSN-XHC为基础,通过重组克隆在CP终止子之后引入NruⅠ识别序列,构建了VIGS载体pCTLV-00:LB-2x35S-XHC(Nru Ⅰ)-NOS-RB。反向插入402bp源于本生烟的八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase, PDS)基因片段后,重组载体pCTLV-PDS402R通过农杆菌浸润接种本生烟,在22℃光照16h和20℃黑暗8h周期条件下,诱导产生了PDS基因沉默的白化表型。Real-time RT-PCR检测结果表明,pCTLV-PDS402R侵染植株PDS基因的相对表达量比空载体pCTLV-00对照下降约25%。说明基于CTLV上的VIGS体系初步建立。为提高VIGS沉默效率,引入具有自我剪切功能的核酶序列到pCTLV-00,构建了VIGS载体pCTLV1:LB-2x35S-XHC(Nru Ⅰ)-RZ-NOS-RB;进一步分别引入135bp、105bp、90bp和61bp的CP亚基因组启动子片段构建了VIGS载体pCTLV2、pCTLV3、 pCTLV4、pCTLV5。上述系列VIGS载体均反向插入了PDS基因片段,基因沉默效应正在评估当中。
孙道阳[10]2016年在《矮牵牛转录因子PhOBF1和PhERF2影响病毒诱导基因沉默效率的机理研究》文中研究表明病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是植物分子生物学领域中分析基因功能常用的技术手段。携带某一基因片段的病毒载体侵染后,导致植物体内同源mRNA转录水平的降解,因此属于转录后的基因沉默(post-transcriptional gene silencing,PTGS)。PDS和CHS分别是利用VIGS方法研究叶片和花器官中相关基因功能的常用报告基因,其沉默导致的可见表现型可用于指示VIGS沉默位置或沉默效率。病毒诱导的RNA沉默参与植株抗病毒防御反应,需要依赖于RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RDRs)、类似于Dicer的内切酶RNase III(Dicer-like RNase III enzymes,DCLs)及Argonaute蛋白(Argonaute proteins,AGOs)。然而,这些关键成分的转录调控尚不清楚。本研究在前期矮牵牛花器官不同发育阶段的转录组测序工作中,分离得到一个bZIP型转录因子和一个ERF型转录因子,分别命名为PhOBF1和PhERF2。选用矮牵牛(Petunia×hybrida)紫花品种‘Primetime Blue’和白花品种‘Mitchell Diploid’为材料,研究了TRV侵染、非生物因素及压力相关激素处理下的PhOBF1或PhERF2的表达模式;分析了PhOBF1或PhERF2对RNA沉默相关基因的调控和对烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默效率的影响;检测了PhOBF1或PhERF2转基因植株对不同病毒侵染的抗性差异,主要取得以下结果:1.在通过转录组测序构建的矮牵牛花器官不同发育时期的cDNA文库中,分离得到PhOBF1和PhERF2的EST片段,NCBI的BLAST搜索发现两个转录因子的完整开放阅读框(open reading frame,ORF)序列。其中,PhOBF1 mRNA长度为915bp,ORF区489bp,编码162个氨基酸,5’端非编码区含有一个蔗糖控制的uORF区,长度为147bp,编码48个氨基酸,Genbank登录号:FN001301;PhERF2 mRNA长度为1308bp,ORF区1137bp,编码378个氨基酸,Genbank登录号:HQ259596。在PhOBF1和PhERF2氨基酸序列中分别含有一个bZIP保守结构域和一个AP2/ERF保守结构域。系统进化树显示,PhOBF1属于bZIP型转录因子S亚族,与拟南芥AtbZIP11高度同源;PhERF2属于ERF型转录因子VII亚族,与拟南芥AtRAP2.12和AtRAP2.2高度同源。2.TRV接种矮牵牛后,在接种叶片和顶端系统叶片中PhOBF1或PhERF2的转录水平升高,且升高的趋势与叶片中TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)的积累水平一致。除了生物因素外,采用非生物因素及激素处理矮牵牛叶片,检测了两个转录因子的表达情况。结果显示,低温、干旱、脱落酸、乙烯、赤霉素和水杨酸处理诱导PhOBF1的表达,而低温、高盐碱、干旱、脱落酸、乙烯、水杨酸和茉莉酸甲酯处理诱导pherf2的表达。在非生物胁迫下,低温处理对phobf1或pherf2的诱导量最大,其次是干旱;而在所有激素中,水杨酸处理结果显示对phobf1或pherf2的最大诱导。表明两个转录转录因子可能在矮牵牛植株抗非生物胁迫方面扮演着重要角色。此外,乙烯处理显着诱导了phobf1或pherf2的表达,由于矮牵牛属于乙烯敏感型,乙烯是矮牵牛花朵从开放到萎蔫的主要信号,因此推断phobf1或pherf2可能参与矮牵牛花器官衰老的调节。3.以trv为载体,pds或chs为报告基因,将phobf1或pherf2片段构建到trv-phpds/chs、trv-phpds或trv-phchs中,采用注射法将转化各种trv构建物的农杆菌接种野生型矮牵牛幼苗叶片,接种未转化农杆菌用作mock对照。接种后不同时期,顶端系统侵染叶片或花瓣上始终未出现pds沉默导致的光漂白表现型或chs沉默引起的白花表现型。病毒积累水平的半定量结果显示,trvrna1(或trv1)和携带phobf1或pherf2插入片段的rna2(或trv2)成功侵染至顶端系统叶片,表明phobf1或pherf2插入片段的存在并未抑制trv载体的复制和移动,从而排除由于病毒增殖受到抑制而引起报告基因沉默失败的可能性。实时荧光定量pcr分析结果显示,trv-phpds/obf1或trv-phpds/erf2侵染的系统叶片中pds转录水平只相比于mock对照下降了30-40%,trv-phpds侵染的光漂白叶片中下降了约90%的pds转录水平。phobf1或pherf2的下调表达导致某些rna沉默相关基因rdrs、dcls和agos下降的转录水平和几乎难以检测到的sirnas积累水平。表明phobf1或pherf2可能通过调控rna沉默途径关键基因的表达,进而影响trv诱导的基因沉默效率。4.采用农杆菌介导法,生成了phobf1的rnai沉默(#2,#6和#8)和过表达(#b,#d和#h)转基因植株,或pherf2的rnai沉默(#1和#4)和过表达(#c,#d和#i)转基因植株。植株表现型观察发现phobf1影响植株高度、茎枝粗度、叶片厚度和种子大小。pherf2-rnai沉默导致植株减弱的生长势,而过表达导致增强的生长势。phobf1沉默和过表达分别显着抑制和促进了rna沉默相关基因rdr1、rdr2、dcl1、dcl2、dcl4和ago2的表达,而pherf2沉默和过表达分别显着降低和提高了rdr2、rdr6、dcl2和ago2的转录水平。trv-phpds接种phobf1或pherf2的rnai沉默和过表达转基因植株幼苗,野生型植株用作对照。接种后叶片表现型观察发现,两个转录因子的rnai沉默极大的降低了pds的沉默效率,表现为顶端系统叶片未发现明显的pds沉默导致的光漂白表现型。但是,phobf1或pherf2的过表达恢复甚至促进了pds沉默引起的光漂白表现型。实时荧光定量pcr分析显示,接种trv-phpds的phobf1或pherf2沉默转基因植株系统叶片中的pds转录水平下降了约30-40%,而接种trv-phpds的对照野生型植株系统叶片中的pds转录水平下降了约90%。phobf1或pherf2过表达导致trv-phpds侵染的系统叶片中pds转录水平也下降了90%左右。接种trv-phpds后的野生型植株和phobf1或pherf2转基因植株中的trvrna1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)的积累水平存在明显差异。表明PhOBF1或PhERF2不仅参与TRV诱导的基因沉默效率的调节,还可能参与植株对TRV侵染的防御反应。此外,PhOBF1沉默和过表达分别下调和上调了莽草酸和苯丙素途径关键基因DAHPS、SK1、EPSPS、CS、CM1、ADT1、PAL1和PAL2的转录,以及下降和升高的内源水杨酸含量。外源水杨酸处理极大地诱导RDR1、RDR2、DCL1、DCL2、DCL4和AGO2的表达。表明水杨酸可能是连接PhOBF1和下游RNA沉默途径的重要中间信号。5.采用注射法接种TRV空载体或TRV-GFP载体,检测了PhOBF1-或PhERF2-RNAi沉默和过表达转基因植株对TRV的抗性。采用摩擦法接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV),分别检测了PhOBF1转基因植株对TMV或PhERF2转基因植株对CMV的抗性。接种TRV-GFP后,PhOBF1沉默转基因植株接种叶片显示出比野生型植株接种叶片更大的绿色荧光相对区域,而PhOBF1过表达转基因植株接种叶片显示出较小的绿色荧光相对面积。接种TRV空载体的PhOBF1或PhERF2沉默转基因植株系统叶片出现较严重的花叶、斑驳或退绿症状,实时荧光定量PCR分析显示两者的沉默植株中具有比野生型植株更多的TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)积累水平。PhOBF1过表达转基因植株系统叶片TRV侵染症状较轻,未发现明显的花叶、斑驳或退绿症状,实时荧光定量PCR分析显示,与野生型植株相比,PhOBF1过表达导致下降的TRV RNA1(或TRV1)和RNA2(或TRV2)积累水平。此外,PhOBF1沉默和过表达显着提高和降低了TMV外壳蛋白基因TMV-CP的表达水平,而PhERF2沉默和过表达显着增强和抑制了CMV外壳蛋白基因CMV-CP的表达水平。表明PhOBF1或PhERF2可能参与对多种病毒侵染的广谱的抗性反应。
参考文献：
[1]. 病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草(Nicotiana bentha miana)rbcs基因功能的研究[J]. 周晓馥, 王兴智. 分子植物育种. 2003
[2]. 病毒载体诱导转录后基因沉默系统的建立及烟草（Nicotiana benthamiana）rbcS基因功能的研究[D]. 周晓馥. 东北师范大学. 2003
[3]. 转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能[J]. 周晓馥, 麻鹏达, 王仁厚, 朱筱娟, 刘宝. 遗传学报. 2005
[4]. 利用转录后基因沉默系统研究烟草rbcS基因功能的模式的建立[C]. 周晓馥, 王兴智. 中国的遗传学研究——中国遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编. 2003
[5]. 双生病毒DNA1分子诱导的基因沉默体系的建立及其应用[D]. 黄昌军. 浙江大学. 2009
[6]. 观赏花烟草（Nicotiana sanderae）VIGS体系构建与优化[D]. 张茜. 华中农业大学. 2014
[7]. 叁种激发子诱导的过敏性细胞死亡调控基因的克隆及其功能分析[D]. 王卫. 南京农业大学. 2010
[8]. 病毒诱导的基因沉默体系优化及烟草DHS基因功能研究[D]. 王宏芝. 中国农业大学. 2005
[9]. 柑橘碎叶病毒侵染性克隆构建及其诱导的基因沉默（VIGS）体系建立[D]. 宋震. 西南大学. 2013
[10]. 矮牵牛转录因子PhOBF1和PhERF2影响病毒诱导基因沉默效率的机理研究[D]. 孙道阳. 西北农林科技大学. 2016