产甘油假丝酵母CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

论文摘要

产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是一株具有多重抗逆特性的工业二倍体酵母,是优良的底盘细胞。但C.glycerinogenes的二倍体基因组、无有性生殖、缺乏选择标记等限制了该菌的基因编辑效率。新一代基因编辑技术CRISPR-Cas9系统因为其快速、高效和简便的优点,可轻松实现基因点突变、片段敲除或敲入等精确编辑,被广泛应用于动物、植物和微生物。本论文旨在将CRISPR-Cas9技术应用于C.glycerinogenes的基因编辑,并进行了技术优化和TRP1、URA3、ADE2等基因的编辑应用,有以下主要研究成果:（1）为构建CRISPR-Cas9系统,设计和组装了可以插入Cas9、sgRNA等CRISPR组件的酵母整合表达载体pMY;通过Western Blotting分析不同密码子优化的Cas9基因的表达情况,确定适用于C.glycerinogenes的CgCas9序列;通过靶向反筛基因TRP1敲除试验,比较了ScSNR52p、GDPp、GAPp三种不同的启动子在C.glycerinogenes中转录sgRNA的强度,结果表明只有GAP启动子配合HH和HDV核糖酶序列转录sgRNA可实现TRP1基因的敲除,选择性筛选效率可达100%。（2）为解决上述系统中存在的载体构建困难、整合效率低等问题,以CgCas9和sgRNA瞬时表达转录元件代替CgCas9-sgRNA整合表达载体,通过靶向TRP1基因敲除进行试验,同样可实现效率为100%的基因敲除,据此获得一种构建更简易的CRISPR-Cas9瞬时表达系统;对C.glycerinogenes 5S rRNA启动子进行了鉴定,通过对其介导下的TRP1基因突变频率(3.6×10-6)分析,结果表明采用5S rRNA启动子取代GAP启动子用于sgRNA的转录,可进一步获得一种免克隆操作的sgRNA瞬时转录元件快速构建方法;同时,考察了修复模板30 bp至1000 bp不同长度同源臂对TRP1基因突变频率的影响,并结合修复模板构建难易程度的分析,确认长度为50 bp的同源臂是修复模板构建的最佳选择,可简化修复模板的构建。（3）对优化后的瞬时CRISPR-Cas9系统在基因编辑应用上进行了评估,具体为:同时靶向TRP1和URA3基因,实现了双基因的一次性敲除(筛选效率为100%,突变频率为8.7×10-7);通过TRP1筛选标记的循环再利用,实现了ADE2和TRP1基因的先后连续敲除（筛选效率分别为80%和100%）;通过在TRP1基因敲除的修复模板中加入绿色荧光蛋白基因gfp序列,实现了外源基因gfp的敲入（筛选效率为100%）和表达;通过在TRP1基因位点编辑表达木糖脱氢酶基因xylB（筛选效率为100%）,获得了木糖酸生产菌株,采用溶氧策略两步法发酵,可从含70 g·L-1葡萄糖和24 g·L-1木糖的模拟木质纤维素水解液中得到28.4 g·L-1乙醇和9.1 g·L-1木糖酸。这些结果表明,本研究构建的CRISPR-Cas9系统在C.glycerinogenes基因编辑上具有良好的实际应用效果。

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本论文所用缩略词一览表

第一章绪论

1.1 基因编辑技术

1.2 CRISPR-Cas9 系统

1.2.1 CRISPR-Cas9 系统研究背景

1.2.2 CRISPR-Cas9 系统作用机理

1.2.3 CRISPR-Cas9 系统衍生技术

1.3 酵母CRISPR-Cas9 系统研究

1.3.1 CRISPR-Cas9 系统的应用现状

1.3.2 CRISPR-Cas9 系统的构建策略

1.3.3 CRISPR-Cas9 系统中启动子的使用

1.4 产甘油假丝酵母及其基因编辑系统研究现状

1.5 研究意义及主要研究内容

1.5.1 研究意义

1.5.2 主要研究内容

第二章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 菌株和质粒

2.1.2 引物和引导序列

2.1.3 酶和试剂

2.1.4 培养基

2.1.5 仪器和设备

2.2 实验方法

2.2.1 分子实验基础操作

2.2.2 酵母整合表达载体的构建

2.2.3 整合Cas9 基因的菌株构建

2.2.4 Western Blotting检测Cas9 蛋白

2.2.5 sgRNA引导序列的设计

2.2.6 RNA Pol Ⅲ启动子驱动的sgRNA转录载体构建

2.2.7 RNA Pol Ⅱ启动子驱动的sgRNA转录载体构建

2.2.8 CRISPR-Cas9 瞬时表达/转录元件的构建

2.2.9 修复模板Donor的构建

2.2.10 绿色荧光显微观察

2.2.11 以模拟木质纤维素水解液为底物的溶氧策略两步发酵法

2.2.12 生物量及主要物质浓度的测定

第三章结果与讨论

3.1 产甘油假丝酵母CRISPR-Cas9 系统的构建

3.1.1 整合表达载体pMY和 Cas9 整合表达载体的构建

3.1.2 不同Cas9 基因的整合菌株构建及表达

3.1.3 不同启动子驱动sgRNA转录的整合载体构建

3.1.4 基于TRP1 基因敲除的不同sgRNA启动子强度分析

3.2 产甘油假丝酵母CRISPR-Cas9 系统的优化

3.2.1 Cas9和sgRNA瞬时表达转录策略

3.2.2 基于5S rRNA启动子的sgRNA元件构建

3.2.3 修复模板同源臂长度的优化

3.3 产甘油假丝酵母CRISPR-Cas9 系统的应用

3.3.1 URA3和TRP1 基因的同时敲除

3.3.2 ADE2和TRP1 基因的连续敲除

3.3.3 绿色荧光蛋白gfp基因的敲入

3.3.4 木糖脱氢酶xylB基因的敲入及应用

主要结论与展望

主要结论

展望

致谢

参考文献

附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 朱敏阳

导师: 诸葛斌

关键词: 产甘油假丝酵母,基因编辑,优化,应用

来源: 江南大学

年度: 2019

分类: 基础科学,工程科技Ⅰ辑

专业: 生物学,生物学,一般化学工业

单位: 江南大学

分类号: Q78;TQ926

总页数: 63

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产甘油假丝酵母CRISPR-Cas9基因编辑系统的构建

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