猪肠外致病性大肠杆菌双组份系统对(p)ppGpp的调控研究

论文摘要

大肠杆菌是一种重要的人畜共患病原菌,严重危害了公共安全和畜牧养殖业。在细菌中,四（五）磷酸鸟苷酸（p）ppGpp和多聚磷酸polyP是细菌应对压力应激（SR）的重要信号分子。有文献报道,在压力应激过程中,双组份信号系统与（p）ppGpp和Poly（P）存在着直接的联系。为了研究TCS在多聚磷化物调控中的作用,我们利用凝胶迁移实验（EMSA）,基因缺失菌株的构建,荧光定量PCR等试验研究ArcA、OmpR和PhoB对（p）ppGpp的调控机制。取得如下主要结果:1.TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB可以调控relA基因的表达对TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB和relA启动子区进行体外结合实验。发现这三个蛋白都可以阻滞PrelA在非变性蛋白胶上的迁移,这说明ArcA、OmpR、PhoB可以与PrelA结合。同时,对ΔarcA、ΔompR、ΔphoB和野生株PCN033进行相对荧光定量实验,发现缺失株内relA基因表达明显下调。综合说明TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB可以通过与PrelA结合来调控relA基因的表达。2.TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB有助于细菌抵抗压力环境对ΔarcA、ΔompR、ΔphoB和野生株PCN033以低浓度梯度过氧化氢处理,测定生长曲线,发现缺失株对过氧化氢的耐受性都低于野生株;同时,对上述四株菌以高浓度过氧化氢处理,测定细菌存活率,发现缺失株在高浓度过氧化氢中的存活率明显低于野生株。在生物膜形成与分析实验中,发现缺失株中形成的生物膜数量少于野生株PCN033,表明ArcA、OmpR、PhoB可以影响生物膜的形成。上述结果表明TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB有助于细菌抵抗过氧化氢氧胁迫,并可以影响生物膜的形成。3.Poly（P）可以通过TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB来调控（p）ppGpp的合成在（p）ppGpp合成测定实验中,发现缺失株ΔarcA、ΔompR、ΔphoB中（p）ppGpp的合成数量明显低于野生株。另外,当过表达PPK/PPX而使胞内积累/消除poly（P）时,ArcA、OmpR、PhoB的表达也会相应的上调或者下调,表明poly（P）可以调控三者的表达。结合前述,ArcA、OmpR、PhoB可以调控relA基因的表达。综合而言,Poly（P）可能是通过调控TCS蛋白ArcA、OmpR、PhoB的表达来调控relA的表达,从而实现对（p）ppGpp合成的调控。

论文目录

摘要

Abstract

缩略词表（Abbreviations）

1 文献综述

1.1 大肠杆菌概述

1.1.1 大肠杆菌的分类及鉴定

1.1.2 大肠杆菌毒力因子

1.1.3 肠外致病性大肠杆菌

1.2 （p）ppGpp的研究进展

1.2.1 （p）ppGpp和（p）ppGpp合成酶RelA

1.2.2 （p）ppGpp在压力应激中的研究进展

1.3 双组份调控系统研究进展

1.3.1 双组分调控系统简述

1.3.2 双组分调控系统与氧化应激

1.3.3 双组分调控系统与（p）ppGpp

2 研究目的与意义

3 材料和方法

3.1 材料

3.1.1 菌株

3.1.2 质粒

3.1.3 主要试剂

3.1.4 主要仪器设备

3.1.5 培养基的配制

3.1.6 抗生素及常用试剂的配制

3.1.7 EMSA实验相关试剂配制

3.1.8 蛋白纯化试剂配制

3.1.9 （p）ppGpp测定溶液配制

3.1.10 蛋白电泳缓冲液

3.1.11 主要分子生物学软件和数据库

3.2 方法

3.2.1 细菌复苏

3.2.2 猪源肠外致病性大肠杆菌基因组的提取

3.2.3 质粒小提

3.2.4 PCR产物和酶切产物的回收纯化

3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）

3.2.6 连接产物的转化（CaCl2转化法）

3.2.7 重组质粒的鉴定

3.2.8 relA基因启动子的克隆

3.2.9 蛋白的表达

3.2.10 蛋白的纯化

3.2.11 EMSA实验

3.2.12 自杀性质粒pRE112-ΔarcA、pRE112-ΔompR、pRE112-ΔphoB的构建..

3.2.13 接合转移与基因缺失株的构建

3.2.14 生长特征

3.2.15 生物膜形成

3.2.16 （p）ppGpp的测定

3.2.17 标准曲线绘制

3.2.18 SDS-PAGE蛋白凝胶电泳

3.2.19 RNA提取

3.2.20 real-time qRT-PCR

3.2.21 小鼠组织载菌量

4 结果

4.1 双组份蛋白的选择与确定

4.1.1 根据relA启动子区预测与其结合的双组份蛋白

4.1.2 双组份蛋白的表达与纯化

4.1.3 relA启动子的合成

4.1.4 TCS蛋白对relA的调控

4.2 双组份蛋白相应基因缺失株的构建

4.2.1 自杀性质粒pRE112-ΔarcA、pRE112-ΔompR、pRE112-ΔphoB的构建

4.2.2 基因缺失株的构建

4.3 双组份蛋白在多聚磷化物调控中机制研究

4.3.1 过氧化氢抑菌试验

4.3.2 过氧化氢杀菌实验

4.3.3 生物膜形成与计数

4.3.4 （p）ppGpp的测定实验

4.3.5 荧光定量实验

4.3.6 小鼠组织载菌量实验

5 讨论

5.1 关于实验方法的讨论

5.1.1 EMSA反应体系的优化

5.1.2 基因缺失株的构建

5.1.3 生物膜形成分析方法

5.2 关于实验结果的讨论

5.2.1 双组份蛋白参与过氧化氢耐受

5.2.2 双组份蛋白在生物膜形成中的作用

5.2.3 Poly（P）对（p）ppGpp的调控作用

6 小结

参考文献

附录

致谢

文章来源

类型: 硕士论文

作者: 张同超

导师: 陈焕春,谭臣,王湘如

关键词: 肠外致病性大肠杆菌,压力应激,双组份调控系统,基因表达

来源: 华中农业大学

年度: 2019

分类: 基础科学,农业科技

专业: 生物学,畜牧与动物医学

单位: 华中农业大学

基金: 国家重点研发计划课题病原菌代谢调控机制研(2017YFD0500202)2017.07-2020.12

分类号: S852.61

DOI: 10.27158/d.cnki.ghznu.2019.000659

总页数: 73

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猪肠外致病性大肠杆菌双组份系统对(p)ppGpp的调控研究

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