白玲[1]2002年在《组织因子促进糖尿病鼠伤口愈合及对血管内皮细胞生长因子的诱导作用》文中指出组织因子(TF，Tissue Factor)是一个分子量为47kDa的单链跨膜糖蛋白，由295个氨基酸残基组成，包括219个氨基酸残基组成的胞外区，23个氨基酸残基组成的跨膜区和由21个氨基酸残基组成的短的胞浆尾。TF是凝血因子FVIIa的受体，FVIIa与TF胞外区结合后，启动体内外源性的凝血途径，在生理性止血中有重要意义。正常生理状况下，血管内皮细胞和血细胞不表达TF，但在病理情况下，一些因子刺激这两种细胞开始表达TF，引起一些病理性的凝血反应，例如，弥散性血管内凝血、血栓和败血性休克发生等。近年陆续报道，组织因子除了凝血功能外，还与肿瘤和胚胎血管发生，炎症发生，信号传导等有关。特别是TF在肿瘤和胚胎血管发生以及与炎症的关系提示TF可能有促进伤口愈合的作用。 已有报道，非肥胖型糖尿病鼠(NOD mice)的新血管发生受影响，伤口处血管密度和血流明显减少。我们发现正常鼠完整皮肤几乎检测不到TF的表达，但创伤时TF的表达明显增高。和正常健康鼠比较，糖尿病鼠伤口处TF、VEGF(血管内皮细胞生长因子)、α-SMA(α-smooth musele actin)的表达不足，伴随着伤口愈合的迟缓。伤口完全愈合，正常小鼠需要3.6天，而糖尿病鼠需要6天。说明，遗传性糖尿病鼠伤口愈合迟缓的部分原因是由于TF的表达不足。因此，为了证实在糖尿病皮肤伤口修复，血管发生过程中TF起重要作用，我们用克隆有TF的真核表达载体进行伤口局部基因转染。发现TF转染改善了糖尿病情况下伤口血管生成的不足，促进了伤口处血管发生，提高了血流供应，角质细胞，成纤维细胞的增殖迁移，胶元合成，颗粒组织形成等，明显加快了伤口愈合速度。TF促进伤口愈合的可能机制包括叁个方面。一是促进了VEGF，α-SMA的表达，二是促进角质细胞表达与伤口愈合有关的基因，叁是TF本身就具有促新血管发生的作用。VEGF是血管内
何梅香[2]2014年在《Sonic hedgehog改善内皮祖细胞功能促进1型糖尿病伤口愈合的研究》文中指出第一部分Sonic hedgehog改善1型糖尿病小鼠内皮祖细胞功能目的探讨Shh对1型糖尿病小鼠内皮祖细胞迁移和血管生成功能的影响。方法1.链脲佐菌素（STZ）诱导C57BL／6雄鼠1型糖尿病模型后饲养10周，取骨髓培养内皮祖细胞（EPCs），于第7天给予Shh信号通路激动剂（SAG）处理24h后用western blot法检测下游因子GLI-1表达情况，观察细胞给于SAG后Shh信号通路的变化，同时体外血管生成和细胞迁移实验，观察内皮祖细胞shh通路激活后小管形成和迁移能力的变化。2.链脲佐菌素（STZ）诱导C57BL／6雄鼠1型糖尿病模型后饲养10周，取骨髓培养内皮祖细胞，于第7天感染过表达Shh慢病毒24h后继续培48h,用western blot法检测下游因子GLI-1表达情况，观察细胞感染过表达Shh慢病毒后Shh信号通路的变化，同时，用荧光显微镜直接观察细胞转染情况。体外血管生成实验和细胞迁移检测，观察内皮祖细胞Shh通路激活后的小管形成和迁移能力的变化。结果1.给于Shh信号通路激动剂（SAG）处理的1型糖尿病内皮祖细胞westernblot法检测中下游因子GLI-1蛋白表达增高（P<0.05），细胞小管形成能力（P<0.05）和迁移功能（P<0.05）得到改善。2.过表达Shh慢病毒转染处理的1型糖尿病内皮祖细胞western blot法检测中下游因子GLI-1蛋白表达增加（P<0.05），细胞小管形成能力（P<0.05）和迁移功能（P<0.05）得到改善。小结1.1型糖尿病小鼠EPCs的Shh通路下调，给予激动剂SAG可增加下游因子GLI-1蛋白的表达。2．1型糖尿病小鼠EPCs功能下降，体外给予Shh受体激动剂SAG，细胞小管形成能力（P<0.05）和迁移功能（P<0.05）得到改善。3．糖尿病EPCs成功感染过表达Shh病毒，MOI值为10.4. Shh过表达糖尿病内皮祖细胞western blot法检测下游因子GLI-1蛋白表达增加（P<0.05）5．Shh过表达糖尿病内皮祖细胞，细胞小管形成能力（P<0.05）和迁移功能（P<0.05）得到改善。第二部分Sonic hedgehog过表达糖尿病内皮祖细胞功能促进1型糖尿病伤口愈合目的探讨Shh过表达糖尿病内皮祖细胞对1型糖尿病伤口愈合的影响。方法1.1型糖尿病模型10周后建立皮肤全层缺损模型，随机分为Control组，DM组，DM+EPCS组，在伤口周围分别多点注射生理盐水，内皮祖细胞（来源于GFP小鼠）。定期观察实验组和对照组伤口愈合情况，并于第18天取伤口周围直径1cm面积全层皮肤组织，冰冻切片后直接在荧光显微镜下观察内皮祖细胞参与伤口愈合的情况，用免疫组织化学法，HE染色法，观察皮肤组织血管新生及肉芽组织修复情况。2.1型糖尿病模型10周后建立皮肤全层缺损模型，随机分为CONTROL组，DM组，DM+EPCS组，DM+EPCS(SHH)组，在伤口周围分别多点注射生理盐水，内皮组细胞（来源于糖尿病小鼠），转染过表达Shh慢病毒内皮祖细胞。定期观察实验组和对照组伤口愈合情况，并于第18天取伤口周围直径1cm面积全层皮肤组织，冰冻切片后用免疫组织化学法，HE染色法，Mason染色法观察皮肤组织血管新生及胶原组织，肉芽组织修复情况。结果1.皮肤全层损伤模型（1）显示：与对照组相比，糖尿病伤口愈合缓慢（P<0.05）,内皮祖细胞促进糖尿病伤口愈合（P<0.05）。荧光显微镜下，内皮祖细胞实验组皮下组织可见位于散落点状荧光。免疫组化显示，内皮祖细胞实验组小血管数目多于糖尿病对照组。HE染色显示，实验组与正常皮肤结构形态相似，对照组可见上皮化，但上皮组织薄。2.皮肤全层损伤模型（2）显示：糖尿病伤口愈合缓慢（P<0.05）,转染过表达SHH慢病毒内皮祖细胞促进糖尿病伤口愈合（P<0.05）。免疫组化显示，实验组皮肤组织血管新生能力得到改善。HE染色和Mason染色显示，实验组与正常皮肤结构形态相似，对照组皮肤部分可见上皮化，但上皮细胞薄。小结1.正常内皮祖细胞治疗改善1型糖尿病伤口血管新生能力，促进糖尿病伤口愈合。2.与糖尿病内皮祖细胞相比，过表达Shh糖尿病内皮祖细胞能够改善糖尿病伤口血管新生能力，促进糖尿病伤口愈合。全文结论1.糖尿病小鼠的EPCs功能障碍，Shh信号通路下调，激活Shh通路可改善糖尿病EPCs的功能。2.过表达Shh基因的糖尿病治疗，可改善糖尿病伤口血管新生能力，促进糖尿病伤口愈合。
柏书博[3]2011年在《小鼠放创复合伤伤口愈合延迟机理研究》文中认为放创复合伤主要见于肿瘤放疗以及核辐射损伤等合并创伤的病人,其突出的问题是创面愈合延迟或经久不愈。现有研究表明:全身辐射损伤延缓创面愈合是以造血细胞和修复细胞数量与功能损害为关键环节的诸多愈合因素相互协同作用的结果[1],其变化特点可能与创伤的损伤程度、辐射剂量及个体差异等因素密切相关[2-5],目前发病机制尚不十分明确。细胞因子是一类对细胞生长、分化有明显调控作用的小分子生物活性多肽,是细胞与细胞外基质间重要的信号传导物。研究表明,血管内皮生长因子( Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF )、血小板源性生长因子( Platelet-derived Growth Factor,PDGF )、肿瘤坏死因子( Tumor Necrosis Factor-alpha,TNF-α)是创伤愈合中重要的信使分子及组织者,其在放创复合伤伤口愈合不同时期有明显表达减弱的现象[6-8]。目前国内外放创复合伤的研究多侧重于通过动物模型来阐明某种细胞因子在创伤愈合过程中的功能,但由于文献报道的放创复合伤动物模型在放射剂量、动物死亡率统计、创面延迟愈合程度认识方面差异较大[2-5],缺乏统一的标准模型。放创复合伤口愈合是炎症细胞、修复细胞、细胞因子以及细胞外基质共同参与并高度协调相互调控的复杂过程[9],不同剂量全身辐射对伤口中多基因表达的影响及多基因与炎症细胞、修复细胞在创面愈合不同阶段相互影响的协同关系尚未见相关报道。因此,构建稳定性、重复性好、标准化的放创复合伤动物模型,分析PDGF-BB、VEGF和TNF-α等三种在组织修复中起主要作用的细胞因子在放创复合伤口难愈中的意义,并探讨细胞因子与炎症细胞,修复细胞之间的关系,对于研究全身辐射影响创伤愈合的机制是十分必要的。目的构建小鼠不同全身辐射剂量合并背部皮肤缺损模型、背部皮肤切割伤模型,检测小鼠皮肤撕裂强度、皮肤缺损残余面积、动物体质量变化和存活率及伤口组织中炎细胞、修复细胞、新生毛细血管等体现创伤整体伤情的相关指标,分析PDGF-BB、VEGF、TNF-α在放创复合伤口中表达水平的变化,研究不同剂量全身辐射对皮肤创面愈合的影响,探讨PDGF-BB、VEGF和TNF-α与炎细胞、修复细胞在放创复合伤愈合中的作用及关系,为深入认识放创复合伤的难愈机制提供新的思路。方法采用250只健康昆明种小鼠( SPF级),雌性,体质量( 20±2 )g;根据致伤方法不同分为背部皮肤切割伤组和背部皮部缺损组,两组小鼠均以60Coγ射线一次性均匀辐射4、6或8 Gy为实验组,以未辐射的为对照组。致伤方法:切割伤组全层切开小鼠背部正中3.5cm长皮肤;皮肤缺损组在小鼠背部制作1.5×1.5 cm方形全层皮肤缺损伤口。切割伤组共计小鼠70只,其中对照组10只,4、6、8 Gy实验组各20只,于伤后10 d每组处死10只动物,取伤口处全层皮肤组织条,利用生物力学方法测试伤口撕裂强度。皮肤缺损组共计小鼠180只,其中对照组30只,4、6、8 Gy实验组各50只,统计14 d内各组动物体质量变化和存活率;用透明薄膜描记伤后14d内的皮肤缺损区残余面积,扫描仪扫描透明薄膜后用Image Pro plus v1.5图像分析软件处理计算皮肤缺损区残余面积值;分别于伤后3 d、5 d、7 d、10 d、14 d每组处死6只动物,取材,HE染色观察伤口组织病理学及炎细胞、成纤维细胞、新生毛细血管数量的变化;免疫组织化学染色检测小鼠皮肤伤口中PDGF-BB、VEGF和TNF-α蛋白的表达水平。结果1、小鼠背部皮肤切割伤组伤口撕裂强度检测显示:实验组伤口随照射剂量增加,撕裂强度降低明显。10 d时,4 Gy实验组伤口撕裂强度( 114.26±0.29 ) g,与对照组( 117.12±1.86 ) g相比差异无统计学意义,而6 Gy实验组( 91.87±1.96 ) g和8 Gy实验组伤口撕裂强度( 55.26±2.64 ) g均低于对照组( p< 0.05 )。2、小鼠背部皮肤缺损组存活率、体质量变化及皮肤缺损区残余面积检测显示: 6 Gy实验组8 d和14 d的存活率分别为73%和55%,8 Gy实验组8 d时存活率仅23%,至10 d全部死亡。伤后14 d内,随辐射剂量的增加,实验组小鼠体质量较伤前降低程度愈加明显。全身辐射对皮肤创面愈合延迟随照射剂量增加而加重。6、8Gy实验组伤后2 d与对照组相比残余面积即明显增大,统计学差异显着( P<0.01 ),4 Gy实验组伤后8 d与对照组相比残余面积增大差异有统计学意义( P<0.05 )。3、小鼠背部皮肤缺损组伤口主要细胞、血管定量计数分析发现:实验组伤口炎细胞、成纤维细胞、新生毛细血管数量较单伤组都不同程度地降低,6、8 Gy实验组伤后3-5 d创面的炎细胞、成纤维细胞和新生毛细血管数量均明显低于对照组( P<0.01 )。伤后3-7 d,4、6、8 Gy实验组炎细胞数量的降低随剂量增加而更加明显,组间有显着差异( P<0.01 )。4、组织病理学结果显示:(1)小鼠背部皮肤切割伤组:与对照组相比,实验组小鼠伤口胶原纤维排列无序,组织疏松,成纤维细胞增殖较少;(2)小鼠背部皮肤缺损组:与对照组相比,实验组小鼠伤口早期炎症反应受抑,成纤维细胞和新生毛细血管数量增多明显滞后,肉芽组织形成延迟,上皮覆盖滞后。5、小鼠背部皮肤缺损组免疫组织化学结果显示:全身辐射使伤口愈合各阶段滞后、延长。(1)伤后3-7 d,对照组和6、8 Gy实验组PDGF-BB、VEGF表达逐渐增强,伤后7 d表达至峰值,6、8 Gy实验组较对照组表达强度均降低,未能形成表达峰值;伤后10 d,对照组PDGF-BB、VEGF的表达明显减弱,6 Gy实验组表达略有减弱,但表达强度强于对照组。(2)伤后3-5 d,对照组和6、8 Gy实验组TNF-α表达逐渐增强,6、8 Gy实验组较对照组表达强度均降低,对照组伤后5 d表达至峰值;伤后7 d,对照组TNF-α的表达强度开始减弱,6、8 Gy实验组表达仍持续增强,表达水平的增加较对照组延迟。(3)定量结果表明:6、8 Gy实验组与对照组相比:伤后3- 7 d PDGF-BB、VEGF的积分光密度(IOD)值明显减少( P<0.05);伤后3- 5 d TNF-α的IOD值均明显减少( P<0.05 )。6 Gy实验组与对照组相比:伤后10 d PDGF-BB、VEGF的IOD值明显增加( P<0.05 );伤后7- 10 d TNF-α的IOD值均明显增加( P<0.05)。6、8 Gy实验组(伤后3-7 d )伤口内PDGF-BB、VEGF、TNF-α的IOD值组间相比有显着差异( P<0.05 )。结论1、放创复合伤伤口愈合延迟与辐射剂量存在明显的剂量效应关系。全身辐射合并切割伤时,伤口撕裂强度随辐射剂量增高而降低;全身辐射合并皮肤缺损伤时动物模型整体伤情和伤口愈合延缓效应随辐射剂量增大而加重。2、小鼠6 Gy 60Coγ射线全身放射合并背部皮肤切割伤模型、背部皮肤缺损模型,可为放创复合伤难愈机制的研究和早期的实验治疗提供研究平台。3、全身放射合并皮肤缺损伤愈合早期阶段(伤后7d内)伤口内PDGF-BB、VEGF和(伤后5 d内)伤口内TNF-α表达水平的降低,表达时间滞后,可能是放创复合伤伤口愈合延迟的重要原因之一。4、不同剂量全身辐射对炎性细胞、成纤维细胞的影响打乱了创面修复中细胞与细胞因子之间生理性调节过程。放创复合伤创面愈合不同阶段PDGF-BB、VEGF和TNF-α在炎性细胞和修复细胞的表达水平与创伤修复的时相以及辐射损伤程度有关。
胡太平[4]2006年在《Sonic Hedgehog促糖尿病小鼠伤口愈合及机制研究》文中指出研究背景糖尿病人伤口愈合功能受损在临床上是一个比较棘手的问题，目前尚未有良好的治疗办法。伤口修复对人体来说是一个有条不紊、循序渐进的过程，它包括一系列相互交联的阶段，分别有：炎症、细胞增生、基质沉积和组织重建等。糖尿病人延迟的伤口愈合涉及到诸多因素，其中血管病变和神经病变是主要因素。Sonic hedgehog是一组密切相连的蛋白质中的一员。它在胚胎发育中起到成形素的作用，也可诱导出生后的血管生成。然而sonic hedgehog是否参与了损伤的愈合过程，能否促进糖尿病伤口的愈合以及sonic hedgehog参与损伤愈合的机制仍有待考证。最近的研究指出sonic hedgehog通过快速激活C-Fes／PI3激酶通路和基因调节途径来诱导毛细血管形态的形成。Sonic hedgehog在体外也可诱导内皮生长因子Ⅰ和Ⅱ的表达。很多证据表明一氧化氮在损伤愈合过程中起着重要的作用。人和动物喂以富含精氨酸的食谱时，正常者和伤口愈合功能受损的年老者，其愈合功能都得到改善。相反，NO缺乏直接导致损伤愈合功能受损。竞争性抑制剂对NOS的抑制可减少胶原沉积，加重切割伤的严重程度，并且使伤口的愈合功能受损。大鼠喂以无精氨酸的饲料时，损伤愈合功能就受到损害。因此，研究sonic hedgehog和NO在伤口愈合，特别是糖尿病延迟的伤口愈合中所起的作用，将为临床治疗糖尿病性皮肤溃疡提供一条有效的途径。第一章 Sonic hedgehog促进1型糖尿病小鼠的伤口愈合目的 本试验将用正常小鼠和糖尿病小鼠两种动物模型探讨：(1) 在正常情况下，sonic hedgehog信号通路对伤口愈合的影响；(2) 糖尿病时，抑制sonic hedgehog信号通路对伤口愈合的影响。方法 本实验分叁部分：(1) 1型糖尿病小鼠模型的建立：C57／B6雄性小鼠腹腔注射(i．p．)链佐霉。用Microvette采血管从小鼠后肢背部静脉收集血样，血糖浓度高于280mg／dl的小鼠定为糖尿病鼠。(2) 损伤模型的建立：C57／B6成年雄性小鼠腹腔注射开他敏和Xylazine，背部剃光毛发，剪一个深达肌膜的伤口，通过描绘出沙布
王心华[5]2014年在《不同细胞生长因子在皮瓣坏死创面愈合中作用和机制研究》文中进行了进一步梳理背景皮瓣手术是整形重建和口腔颌面部手术中最重要的技术之一。然而,无论是在实验还是临床中,外科皮瓣坏死都是很难完全预防和避免的。皮瓣坏死往往导致皮瓣摘除。很多的研究都尝试通过药物,提高皮瓣成活率。然而,在这些研究中也有明显的一些不足。许多研究中没有动物模型解剖学证据；当坏死即将发生时,没有很好的解决方法；虽然一直对坏死的预防性研究很多,但关于促进坏死修复的研究很少,对皮瓣坏死创口治疗的研究更为鲜见。KGF、EGF和VEGF是生长因子领域研究最多的几个生长因子,大量的文献都确定其分别特异性对上皮细胞、主要对上皮细胞、特异性对血管内皮细胞有很强的生长促进作用。KGF对上皮细胞的特异性作用,使其能促进上皮细胞增殖的同时,不促进纤维生长,不导致疤痕形成,成为促进上皮创口愈合最好的候选。EGF是临床上应用最多的生长因子之一,其对上皮的促进作用得到很多患者及医生的认同。VEGF是迄今为止发现的促进血管新生最有效的生长因子,能够极大地提高外科皮瓣的成活,预防皮瓣坏死。皮瓣坏死的基因预防及治疗是一种极有潜力的方法,是未来研究的发展方向。当今皮瓣的基因研究主要是以生长因子作为治疗性基因完成的。如何以最佳的方法将外源性DNA导入皮瓣,使细胞接收并表达外源DNA,一直是值得大家研究和探讨的问题。我们以腺病毒为载体(Ad),携带角化细胞生长因子(KGF)基因的方法,利用复制缺陷型腺病毒载体重组KGF基因,通过其强感染能力与转基因能力,在体外体内特异性表达有活性的KGF蛋白,发挥定向修复组织损伤的作用。另外我们直接在大鼠背部的坏死皮瓣区域中和皮肤中注入EGF和VEGF,观察联合应用生长因子是否会对皮瓣区坏死愈合起作用。方法1.Pac Ⅰ核酸内切酶酶切鉴定腺病毒质粒,测序检测是否质粒存在变异。Pac Ⅰ核酸内切酶酶切pAd-KGF,线性化后的pAd-KGF转染进HEK293(293)细胞后,制备Ad-KGF。应用293细胞扩增、纯化得到Ad-KGF病毒。应用于后续细胞及动物实验,并观察病毒转染293细胞后,细胞形态及病毒的感染能力。2.Ad-KGF感染正常细胞系PA317,HUVEC,HaCaT,和293细胞后,观察病毒的感染的能力；提取受感染细胞的RNA,逆转录得到cDNA后,进行半定量PCR和荧光定量PCR,检测细胞内KGF的表达水平；通过ELISA,检测受感染细胞上清中KGF的表达水平；通过划痕实验模仿伤口,培养HaCaT细胞48小时,确定KGF对上皮细胞生长迁移的作用；将PA317细胞,HUVEC细胞和HaCaT细胞接种于Transwell小室,293细胞+Ad-KGF转染24小时(293+Ad-KGF),293细胞+Ad转染24小时(293+Ad),HaCaT,293细胞和293细胞+KGF(293+KGF)接种于下室内,观察KGF和Ad-KGF对成纤维细胞系,血管内皮细胞系和上皮细胞系的生长迁移作用。3.我们首先解剖大鼠背部,研究确定大鼠背部血管走行。在传统大鼠背部皮瓣模型上,改良手术及实验过程,使皮瓣发生坏死。记录大鼠的体重,皮瓣坏死面积和愈合情况。在术后第15天,25天,和45天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学染色分析。4.在建立大鼠背部皮瓣模型之后,所有动物分为四组。将1ml PBS+dexamethasone(DXM),1ml PBS+Ad-KGF+DXM,or1ml PBS+Ad+DXM分别注入大鼠背部皮瓣坏死区皮下和创口边缘,分别于术后5天,10天,20天,和30天注射相同的药物。隔日记录体重,直至创面坏死愈合。术后第15天,25天,和35天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学Masson染色、免疫组化染色分析和荧光定量PCR分析,上皮及上皮下组织的生长情况,上皮的生长厚度,取血清进行ELISA检测KGF表达水平。5.首先通过细胞迁移实验确定EGF和VEGF对PA317,HUVEC,和HaCaT细胞迁移的活性。建立大鼠背部皮瓣模型,坏死发生后,沿创口边缘及坏死皮下注入1ml PBS+EGF (150mg/kg),1ml PBS+VEGF (10μg), or1ml PBS+EGF (150μg/kg)+VEGF(10μg)。隔日记录体重并注射相同的药物,直至创面坏死愈合。术后第15天和25天过量水合氯醛处死大鼠,取背部坏死皮瓣标本,进行组织化学Masson染色和免疫组化染色分析创缘上皮及上皮下组织的生长情况,上皮的生长厚度,并取血清进行ELISA检测。结果1.酶切鉴定结果与设计和文献相符,证明载体pAd-KGF构建正确。pAd-KGF质粒测序结果显示起始位点：第185bp,ATG。终结位点：第679bp,TAA。全序列对比小鼠KGF基因序列,二者完全匹配,不存在突变。病毒转染正常293细胞24小时,开始出现细胞变圆；荧光显微镜镜下观察,部分293细胞开始表达大量荧光蛋白。转染第96小时后,所有293产生细胞病理效应,显微镜下观察所有细胞呈圆球形葡萄样改变,漂浮于培养液中,荧光显微镜镜下观察293细胞呈圆球形,表达大量荧光蛋白。重组腺病毒Ad-KGF和Ad在293细胞内大量扩增,并收集后。测得Ad-KGF病毒的效价滴度为2×1011PFU/ml,Ad病毒的效价滴度为3×1012PFU/ml。2.pAd-KGF为构建腺病毒质粒。半定量PCR证明pAd-KG内存在KGF表达基因。经过基因重组后的腺病毒Ad-KGF具有感染正常细胞,于正常细胞内表达KGF的能力。正常的293细胞不能表达KGF的mRNA,PA317细胞能分泌KGF,表达KGF mRNA。Ad-KGF感染293细胞后,细胞成功表达KGF mRNA,而在293细胞和293+空病毒Ad内不能表达KGF mRNA。通过ELISA检测培养液上清中外分泌的KGF含量。检测证明Ad空病毒转染细胞后48小时,上清液中不分泌KGF蛋白,而Ad-KGF转染细胞的后的48小时,细胞培养上清中能够检测到大量的KGF表达,且浓度随着Ad-KGF的滴度增加而增加。通过划痕实验,证明在KGF作用下,HaCaT上皮细胞的迁移能力显着增加。而对照组细胞开始出现凋亡现象。Transwell细胞迁移实验证明KGF能有效促进HaCaT上皮细胞生长迁移,而对HUVEC血管内皮细胞作用不明显,对PA317成纤维细胞没有明显作用。3.大鼠背部七条静脉和一侧有超过二十条动脉分布。手术后叁天,大鼠的体重会稍有下降,然后稳定上升。PBS组和空白组中坏死面积在9天内达到最高峰。从9至47天中,坏死面积逐渐减少,在47天坏死几乎完全愈合。组织病理检查中,可见术后15天,坏死创口边缘上皮细胞增生明显,有少量纤维成分生成,创口愈合区有大量小脉管形成和大量不成熟的纤维成分形成。至第35天,上皮增生修复较前明显弱,但较正常上皮,厚度仍明显增大。4.成功建立大鼠背部皮瓣坏死模型后,四组动物术后体重均有轻度下降,从第叁天开始,体重逐步上升,其中以DXM组的体重上升最明显。术后第五天,坏死成活区域分界清晰。术后第十天,坏死面积达到最大。随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且Ad-KGF组坏死面积缩小最为明显。Masson染色显示术后15天,四组坏死创口边缘上皮都明显增生,其中Ad-KGF组上皮细胞增生最多。术后35天,Ad-KGF组坏死伤口已经愈合,而其它叁组还有较大的坏死面积。术后15天和25天,上皮细胞厚度在Ad-KGF组增生最为明显,术后35天上皮厚度与其它组间没有大的差异。免疫组织化学分析显示,只有在Ad-KGF组的上皮和间充质细胞中有强阳性的KGF表达,而其它叁组均为阴性。Anti-CD34免疫组织化学染色显示四组的小血管生成数目相当5.PA317在EGF, VEGF, VEGF+EGF,或PA317作用下,没有显着性的生长差异。HUVEC对VEGF表现出明显生长加速,在EGF和VEGF联合作用下,生长更加明显,而与PA317共培养时,也有少量生长改变。HaCaT细胞在EGF和VEGF+EGF联合作用下都是表现出生长迁移能力提高。建立动物模型后,分组如下:PBS, EGF, VEGF, EGF+VEGF。四组动物术后体重均有轻度下降,从第叁天开始,体重逐步上升,其中以EGF组的体重上升最少。随着不同药物的治疗,坏死面积在各组间都明显下降,且VEGF+EGF组坏死面积缩小最为明显。术后15天和25天,Anti-CD34免疫组织化学染色显示EGF,VEGF和VEGF+EGF组的小微血管生成数目相当,都显着高于PBS组。结论1. pAd-KGF经过酶切鉴定和测序鉴定具有KGF完全匹配的基因组。成功构建Ad.KGF和Ad,且具有感染细胞的能力。Ad.KGF和Ad经过扩增纯化的滴度为2×1011PFU/ml和3×1012PFU/ml,可以满足细胞及大鼠皮瓣实验的要求。2. Ad-KGF和Ad可以高效转染PA317、HUVEC和HaCaT细胞,并在转染后高效表达活性KGF、KGF可有效促进HaCaT细胞生长,而对PA317、HUVEC细胞作用不明显。3.本实验在确定大鼠背部血供系统基础上,设计形成一套简便且易于推广的手术和皮瓣坏死模型流程,成功建立了稳定的大鼠背部皮瓣坏死伤口模型,可以进行皮瓣坏死为目的基因或药物实验研究。4.使用高表达KGF的腺病毒重组局部转染大鼠背部皮瓣坏死伤口,能有效促进坏死伤口的愈合。5. EGF-VEGF联合应用能促进改良大鼠背部坏死创面愈合。
窦永青[6]2017年在《SIRT1延缓小鼠下肢缺血后血流恢复的机制研究》文中研究说明正常组织功能的维持依赖于血管供氧和营养物质。组织缺血后血流恢复速度取决于血管新生和动脉生成过程。沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)是一类依赖于NAD的去乙酰化酶,广泛参与调节细胞生理活动和病理过程。有报道发现SIRT1通过抑制肿瘤血管新生而降低肿瘤生长,然而其对动脉生成的作用还不十分清楚,本研究旨在探寻SIRT1对动脉生成的调节及机制。目的:本研究以Sirt1转基因(Sirt1-transgenic,Sirt1-Tg)小鼠和血管平滑肌细胞作为研究对象,通过建立下肢缺血模型和低氧诱导模型,试图从体内外证实SIRT1在动脉生成中的作用,并探讨其作用机制,以期为揭示缺血及缺血相关心血管疾病的发生机制提供研究证据。方法:利用Sirt1-Tg小鼠建立股动脉结扎下肢缺血模型,评价SIRT1与组织缺血后血流恢复的关系;应用SIRT1激动剂和抑制剂进一步验证血流恢复与SIRT1活性的关系;利用免疫荧光染色分析缺血下肢腓肠肌毛细血管和小动脉密度;利用内皮细胞增殖、迁移、成管等体外实验和基质胶塞、伤口愈合、视网膜铺片等体内实验,确定SIRT1活性和血管新生的关系;利用蛋白质免疫印迹、免疫共沉淀和免疫沉淀等技术,从蛋白质相互作用、蛋白质修饰的角度探讨SIRT1对动脉生成的关键因子血小板衍生生长因子B(platelet-derived growth factor B,PDGFB)表达的调节及其分子机制。结果:1 SIRT1激活抑制小鼠下肢缺血后血流恢复1.1 Sirt1-Tg小鼠下肢缺血后血流恢复延迟为了探究SIRT1对组织缺血后血液灌注恢复的影响,小鼠进行股动脉结扎建立下肢缺血模型,采用激光散斑对比分析技术监测下肢血流恢复情况。与WT(wild-type,WT)小鼠比较,Sirt1-Tg小鼠血流恢复明显延迟,SIRT1抑制剂EX527腹腔注射使转基因小鼠血流恢复明显改善。1.2 SIRT1激活抑制小鼠下肢缺血后血流恢复复制小鼠下肢缺血模型,于不同时间点腹腔注射SIRT1激动剂白藜芦醇(resveratrol,RSV)。结果显示,延长用药时间可加重血流恢复的延迟;反之,SIRT1抑制剂EX527可加快小鼠缺血下肢的血流恢复速度。结果表明,SIRT1激活抑制小鼠下肢缺血后血流恢复。1.3 Sirt1-Tg小鼠下肢缺血后腓肠肌动脉生成能力降低为了识别毛细血管和小动脉,在小鼠股动脉结扎后14天,使用CD31(内皮细胞标志物)和平滑肌(smooth muscle,SM)α-actin(平滑肌细胞标志物)抗体对腓肠肌组织切片进行免疫荧光染色。结果显示,Sirt1-Tg小鼠下肢缺血侧腓肠肌组织毛细血管密度(CD31阳性区)和SMα-actin阳性的小动脉密度明显低于WT小鼠,壁细胞(NG2阳性)的比例也显着下降。结果表明,SIRT1激活抑制小鼠下肢缺血后动脉生成。2 SIRT1抑制血管新生2.1 SIRT1激活抑制内皮细胞增殖和成管功能为了探究SIRT1激活对内皮细胞功能的影响,低氧处理RSV或EX527预孵育的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)以及小鼠内皮细胞,结果显示,SIRT1激活抑制两种内皮细胞的增殖活性;SIRT1过表达抑制小鼠内皮细胞的迁移。为了进一步验证SIRT1在血管新生中的作用,采用基质胶进行内皮细胞体外成管实验,RSV预孵育的HUVEC成管能力降低。结果表明,SIRT1激活可抑制内皮细胞增殖、迁移和成管能力。2.2体内SIRT1过表达抑制血管新生为了探究体内SIRT1活性对血管新生的影响,将含有血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的基质胶植入WT和Sirt1-Tg小鼠皮下,发现Sirt1-Tg小鼠的基质胶塞中的血管扩张和壁细胞(NG2阳性)覆盖降低。并且Sirt1-Tg小鼠的伤口愈合延迟。为进一步验证SIRT1对血管新生的抑制作用,分析出生5天小鼠视网膜毛细血管,发现Sirt1-Tg小鼠视网膜毛细血管分支点的数目及血管长度明显低于WT小鼠;用SIRT1激活剂RSV腹腔注射的新生WT小鼠,其视网膜血管新生受到明显抑制,而应用SIRT1抑制剂EX527处理的小鼠其视网膜血管新生与未处理的对照组比较增强。结果显示,激活SIRT1可抑制血管新生过程。2.3 SIRT1抑制内皮细胞Wnt/β-catenin信号通路和VEGFA表达VEGFA是Wnt/β-catenin信号通路的靶基因之一,在血管新生中发挥重要作用。小鼠股动脉结扎,Western blot检测双下肢腓肠肌,结果显示,Sirt1-Tg小鼠VEGFA表达缺血侧与对照侧的比值明显低于WT小鼠,β-catenin及其上游的DVL3表达水平降低,与VEGFA一致。RSV预孵育的HUVEC,低氧诱导后,VEGFA、β-catenin和DVL3的表达(低氧与常氧的比值)显着低于对照组;反之,EX527预孵育以抑制SIRT1活性,叁种蛋白的表达增加。结果表明,SIRT1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路继而下调VEGFA的表达。3 SIRT1通过抑制低氧诱导的血管平滑肌细胞PDGFB表达阻碍动脉生成3.1 SIRT1抑制缺血诱导的PDGFB表达为了探究Sirt1-Tg小鼠下肢缺血后动脉生成障碍的分子机制,检测PDGFB表达和ERK活化。Western blot分析显示,Sirt1-Tg小鼠腓肠肌PDGFB表达缺血侧/对照侧比值明显低于WT小鼠,同时p-ERK的比值也显着降低;定量RT-PCR显示,Sirt1-Tg小鼠腓肠肌PDGFB m RNA表达的比值(缺血侧/对照侧)较WT小鼠显着下降。然而,Sirt1-Tg小鼠腹腔注射EX527则可逆转这一现象。说明抑制SIRT1活性可促进缺血诱导的PDGFB表达和信号转导活性。3.2 SIRT1抑制低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)介导的PDGFB基因转录HIF-1α参与动脉生成。为探究SIRT1抑制PDGFB表达的机制,低氧处理WT小鼠VSMC。结果显示,HIF-1α表达与PDGFB蛋白和m RNA水平成正相关。为了进一步确定HIF-1α参与缺血诱导的PDGFB表达调节,基于PDGFB基因中含有HIF-1α结合位点进行Ch IP分析。结果显示,HIF-1α与PDGFB增强子序列(HBS1)结合活性在低氧诱导后明显增加;构建包含HIF-1α结合位点的的荧光素酶报告基因质粒,转染293T细胞,结果显示,低氧诱导的荧光素酶表达活性升高。过表达SIRT1,则抑制HIF-1α与PDGFB基因HBS1增强子的结合;激活SIRT1(RSV预孵育),同样抑制低氧诱导的荧光素酶报告基因活性;反之,抑制SIRT1活性(EX527预孵育)则促进低氧诱导的荧光素酶表达。结果表明,SIRT1抑制低氧诱导的HIF1α激活及其介导的PDGFB基因转录。3.3 SIRT1介导HIF1α的去乙酰化失活为了探究SIRT1抑制HIF-1α介导的PDGFB表达的分子机制,免疫沉淀分析HIF-1α乙酰化水平。结果显示,低氧可诱导VSMC中HIF-1α乙酰化;过表达或激活SIRT1可降低低氧诱导的HIF-1α乙酰化,同时PDGFB蛋白表达降低;反之用EX527抑制SIRT1活性则可逆转HIF-1α的去乙酰化和PDGFB表达的降低。为了进一步验证SIRT1介导HIF-1α的去乙酰化失活,进行免疫共沉淀检测SIRT1与HIF-1α的相互作用。结果显示,低氧时SIRT1与HIF-1α的相互作用减弱;过表达或激活SIRT1,二者的相互作用增强,而抑制SIRT1活性二者的相互作用减弱。结果表明,SIRT1介导的HIF-1α去乙酰化失活可抑制缺氧诱导的PDGFB基因表达。结论:1 SIRT1激活抑制小鼠下肢缺血后动脉生成,导致下肢血流恢复延迟。2 SIRT1通过抑制Wnt/β-catenin信号通路而下调VEGFA表达,进而抑制内皮细胞增殖和血管新生。3 SIRT1介导的HIF-1α去乙酰化失活可抑制缺氧诱导的PDGFB表达和动脉生成。
陆永健[7]2017年在《角质细胞中FOXO1基因对正常和糖尿病小鼠牙龈伤口愈合的影响》文中提出伤口愈合是有许多生物因子参与其中的一个复杂的生物学过程。同时,伤口愈合也与许多因素相关。其中伤口中血管生成是伤口愈合的关键因素之一。多种信号作用于内皮细胞(EC)后能够引起的血管生成,这个过程中受到许多因子的调控。在这些因子中,VEGF是最有效的血管生成因子之一。角质细胞和巨噬细胞是VEGF主要来源。FOXO1属于叉头转录因子的大家族,它参与体内的许多生物过程,包括细胞周期停滞,DNA修复,凋亡,抗氧化应激和葡萄糖代谢。我们实验室的近期研究表明,在角质细胞中特异性敲除FOXO1,能干扰正常皮肤和粘膜伤口中上皮形成。由于角质细胞是生长因子VEGF的主要来源,角质细胞中的FOXO1活性可能影响结缔组织愈合。此外,上皮-间质转化(EMT)是另一个可能影响结缔组织愈合的因素,此过程有助于胚胎发生,组织重塑,纤维化和转移性恶性肿瘤。它是一个受调控编排的系列事件,在此期间上皮细胞失去许多其上皮特异性特征并获得间充质细胞典型的特征。糖尿病是一个普遍的健康问题,它能产生很多相关的并发症,伤口愈合减缓是其中之一。其表现为炎症反应增强,肉芽组织形成受损,生长因子减少和血管生成受阻等,这些因素都是影响伤口愈合的重要因素,有些研究发现,在糖尿病伤口中敲除FOXO1能够挽救糖尿病对伤口愈合的负面影响,表现出促进了伤口中上皮再形成。所以,基于以上的这些观点。本实验的中心假设是,在角质细胞中特异性敲除FOXO1,能够显着影响正常和糖尿病患者牙龈结缔组织愈合,其过程与刺激血管生成和EMT介质的调节有关。本研究目的:1),研究正常和糖尿病小鼠牙龈上皮及结缔组织愈合情况,评估在角化细胞中特异性敲除FOXO1对伤口愈合的影响;2)在正常和糖尿病小鼠牙龈及结缔组织伤口愈合过程中,确定FOXO1是否参与调节角化细胞的活性,调节血管发生;3)评价特异性敲除FOXO1的角质细胞对正常和糖尿病牙龈及结缔组织伤口愈合过程中的上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:体内实验:动物模型使用Cre-loxp技术,使KRT14.Cre小鼠和floxed FOXO1~(L/L)小鼠杂交后得到上皮角质细胞中特异敲除FOXO1基因实验小鼠:实验组(K14.Cre~+.Foxo1~(L/L))以及对照组(K14.Cre~-.Foxo1~(L/L))小鼠。对于EMT研究,使用他莫昔芬诱导的K14CreERT-ROSA26杂交小鼠。糖尿病小鼠模型使用STZ(50mg/kg)连续5天腹腔注射,诱导I型糖尿病。小鼠维持高血糖10天后进行牙龈创口手术。创口位于右侧第一磨牙近中邻面中上腭区牙龈,创口为直径为1毫米的全厚伤口。在创伤后的第4天,第7天处死小鼠,收取伤口样本。组织学样本,经固定,脱钙,切片后,用苏木精和曙红(H&E)和Masson叁色(MT)进行染色,对伤口样本的组织学形态进行测量。对于EMT研究,采用冰冻切片染色后行组织学形态进行测量;体内试验:分别用特异性抗体抗FOXO1,CD31,α-SMA,VEGFA和Ki67对组织的相应蛋白进行免疫荧光染色,使用荧光显微镜进行定量分析;使用TUNEL法和Ki67双染色方法对细胞组织内的细胞凋亡进行测量和分析研究。体外实验:用人类永生牙龈角质细胞(HIGK)和小鼠表皮角化细胞(MPEK),实验组与ON-TARGET plus SMART pool siRNA抗人FOXO1进行转染,对照组与siRNA(ON-TARGET plus Non-targeting Control Pool)进行转染,对细胞内的FOXO1和VEGF-A蛋白水平进行检测;在荧光素酶报告实验中,HIGK细胞和MPEK细胞在实验组中用FOXO1,FOXO1-AAA质粒进行转染,pCDNA3.1对照质粒作为对照质粒。转染后利用双荧光素酶报告基因检测VEGF-A报告子的活性。基因阵列分析,用正常人表皮角质细胞(NHEK)细胞在低糖(5mM d-glucose)和高糖(25 mM d-glucose)培养基中培养5天,用FOXO1或scrambled siRNA转染相应的细胞,然后,使用提取总RNA。采用基因芯片人类基因1.0 ST阵列进行RNA分析。结果:体内实验结果:实验组小鼠(K14.Cre~+.Foxo1~(L/L))与对照组小鼠(K14.Cre~-.Foxo1~(L/L))比较,上皮中的FOXO1表达降低,在结缔组织中则没有明显的差异;在正常血糖情况下,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠结缔组织愈合延迟,在第四天和第七天时结缔组边缘之间的间隙增加(P<0.05);伤口中的肉芽组织和胶原产生均减少。但是在糖尿病组中,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)与K14.Cre~-.Foxo1~(L/L)小鼠没有明显的差异;K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)在结缔组织中成纤维细胞密度在血糖正常的伤口中降低56%(P<0.05),但是在糖尿病伤口中,基因敲除或不敲除的结果相似,无明显差异。肌成纤维细胞对于伤口收缩和成熟的关键。在正常糖尿病的伤口中,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠肌成纤维细胞的数目减少57%(P<0.05)),但在糖尿病伤口中肌成纤维细胞增加了50%(第4天)和28%(7天);在特性敲除角质细胞FOXO1对体内成纤维细胞增殖和凋亡实验中,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)血糖正常组小鼠成纤维细胞的增殖的百分比降低了68%(第4天)(P<0.05),在糖尿病组中,增殖的成纤维细胞的百分比在第4天时相似,但在第7天时在K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠中增加2.7倍(P<0.05);凋亡的成纤维细胞在第4天时,在FOXO1敲除血糖正常小鼠中增加3倍(P<0.05);但在第7天,K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠糖尿病伤口中下降60%(P<0.05)。此外,在K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠伤口上皮中,角质细胞增殖的53%的下降(P<0.05,第4天);对于血管生成的研究,血糖正常小鼠K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠与K14.Cre~-.Foxo1 ~(L/L)相比,结缔组织内血管密度减少52%(第4天)和44%(第7天)(P<0.05)。与此相反,在糖尿病组中K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠与K14.Cre~-.Foxo1 ~(L/L)血管密度没有显着的差异(P>0.05)。在血糖正常组中,K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠Ki67和CD31双阳性增生细胞减少40%(第4天)和49%(第7天)(P<0.05)。与此相反,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠在糖尿病组中没有表现出显着差异。内皮细胞(EC)凋亡的百分比在我们的研究中非常低。在研究角质细胞敲除FOXO1对血管生成的影响是通过VEGFA介导的,体外实验结果显示,在HIGK细胞中沉默FOXO1,VEGFA蛋白质水平在标准葡萄糖培养基中减少57%(P<0.05);在体内实验中,K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠正常血糖组中新生上皮中的VEGFA蛋白质水平也显着减少53%(第4天,P<0.05)和42%(第7天,p值p<0.1),但在糖尿病小鼠中对VEGFA水平的影响减小,无明显差异(P>0.05);正常血糖小鼠结缔组织内VEGFA表达降低约58%(第4天,P<0.05)52%(第7天,p<0.05),在糖尿病小鼠的伤口中,无论在上皮还是结缔组织中,VEGFA表达水平在第4天时相似,但在第七天时。结缔组织中有小但显着的差异,增加了1.7倍(P<0.05)。荧光酶素报告实验结果显示FOXO1(FOXO1AAA)过表达时,VEGFA启动子活性在HIGK细胞中增加2.4倍,在小鼠角化细胞(MPEK)中增加了3.3倍,而当FOXO1沉默时HIGK细胞中VEGFA启动子活性下降了20-43%(P<0.05);上皮-间质转化(EMT)实验结果显示,在他莫昔芬激活的Cre重组酶介导的重组小鼠中,TdTomato有着强烈的表达。但是,在样本中没有观察到角化细胞的转分化成典型的成纤维细胞或肌成纤维细胞。结论:1.角质细胞特异性敲除FOXO1损害正常血糖小鼠结缔组织愈合,而在糖尿病小鼠中无显着差异;2.角质细胞中特异性敲除FOXO1影响正常血糖小鼠的新血管形成,而在糖尿病小鼠中没有显着差异;角化细胞中的FOXO1通过调节VEGFA对血管生成产生影响;3.在上皮-间质转化(EMT)中,未发现角化细胞转分化成典型的成纤维细胞或肌成纤维细胞的证据。
彭程[8]2011年在《小鼠角质细胞生长因子缺失对创面愈合的影响》文中认为目的：生长因子作为刺激创面细胞由静止状态发生增殖和迁移的触发者,在创面愈合中发挥着至关重要的作用。皮肤是一个复杂的器官,为了维持和协调皮肤的正常状态,其内部存在着一系列复杂的细胞与细胞,细胞与因子,因子与因子间的相互作用机制。在创伤的愈合过程中,多种生长因子被证实在创面的修复中发挥了重要作用。角质细胞生长因子(KGF)是成纤维细胞生长因子家族的第七个成员,因此也被称为成纤维细胞生长因子-7(FGF-7)。KGF作为一种旁分泌的生长因子,由各种间质细胞所分泌,包括成纤维细胞,内皮细胞,平滑肌细胞,以及树突状表皮T细胞等。KGF通过表皮细胞上的特异受体FGFR2-IIIb而发挥作用。KGF由间质细胞分泌,却作用于表皮细胞。在小鼠和人的创伤形成后,KGF的表达上升160倍。细胞学试验表明,KGF能特定地促进角质细胞的增殖与迁移。KGF刺激角质细胞DNA合成的能力比TGF-α和EGF强2-10倍。同时,有研究表明将KGF外用于创面能有效的促进创面的再上皮化。这些研究角质都表明了KGF在创面愈合中发挥的作用。因此,本实验室通过基因敲除获得KGF基因缺失的小鼠,并对这种小鼠的生长发育和表型进行观察。同时,我们通过在KGF基因敲除的小鼠背部建立全层创面模型,来研究KGF在创面愈合的作用及其与皮肤其它细胞和因子的相互作用。另一方面,随着全球糖尿病发病率及患病率迅速增长,糖尿病的并发症,如视网膜病变、糖尿病性肾病、神经病变和创面难愈等对患者极大的威胁。糖尿病患者皮肤很容易受损,创面愈合的能力严重降低,往往反复发作,迁延不愈,形成顽固难愈性创面,导致感染,最终致残。糖尿病难愈创面的修复成为临床上面临的巨大难题。糖尿病小鼠在创面愈合过程中表现出炎症反应时间延长,创面血管化受损,以及胶原合成减少。各种生长因子的表达也出现异常。然而,有些生长因子却能逆转糖尿病小鼠创面的愈合延迟,比如血小板源性生长因子(PDGF)以及成纤维细胞生长因子家族。因此在本试验中,我们采用KGF基因敲除的小鼠和野生型小鼠来研究KGF在全层创面愈合的作用及其与皮肤其它细胞和因子的相互作用。同时,通过杂交获得KGF敲除的糖尿病小鼠,并建立创面模型,探讨KGF在糖尿病创面中的作用。方法：1.KGF的基因,包括叁个外显子(extron)和两个内含子(intron).在KGF的叁个外显子中,一号外显子的作用被认为是其中最不可替代的一个。因此,本实验室的Guo等利用胚胎干细胞技术,通过破坏一号外显子达到敲除KGF的目的,获得了KGF基因敲除的小鼠。KGF基因敲除小鼠为研究其功能提供了重要工具。同时,为了探讨KGF基因在糖尿病小鼠中的作用,我们通过杂交的方式,获得了种KGF基因敲除的糖尿病小鼠。通过KGF基因敲除小鼠和杂交的KGF基因敲除的糖尿病小鼠来作为探讨KGF对小鼠创面愈合作用的基础。为了得到KGF敲除的糖尿病小鼠我们采用雄性KGF敲除的小鼠(KGF-/-Lepr+/+)和杂合子的雌性基因型糖尿病小鼠(KGF+/+Leprdb/+)来进行杂交获得种畜,将其中含Leprdb/+基因的小鼠选出来,将含有该基因的公鼠与母鼠杂交。利用southern杂交和PCR对他们的后代进行基因型鉴定,根据其不同的基因型而分成四组：KGF敲除的糖尿病小鼠组(Exp.,KGF-/-Leprdb/db),糖尿病小鼠组(Db/db,KGF+/+Leprdb/db), KGF敲除小鼠组(KGF null, KGF-/-Lepr+/+)和野生型小鼠组(WT, KGF+/+Lepr+/+),并对这四组小鼠进行观察。2.在KGF基因敲除小鼠(KGF null,n=12)和野生型小鼠(WT,n=12)背面建立全层创面模型。采用测量面积的方法计算创面创面开放率,创面收缩率,创面再上皮化率。在伤后第七天,两组小鼠各随机安乐死处死6只,一半组织用于免疫组化染色HE染色观察创面上皮化情况,Ki-67染色观察创面基底角质细胞的有丝分裂,CD-31染色观察创面血管化情况；另一半用于实时PCR检测Ⅰ型胶原(Col-I),α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA),转换生长因子-β1(TGF-β1),碱性成纤维生长因子(bFGF),表皮生长因子(EGF),胰岛素样生长因子-1(IGF-1)以及血管内皮生长因子(VEGF)的表达。3.在KGF基因敲除糖尿病小鼠(Exp.,n=8)和基因型糖尿病小鼠(Db/db,n=8)背面建立全层创面模型。采用测量面积的方法计算创面创面开放率,创面收缩率创面再上皮化率。在伤后第七天,两组小鼠各随机安乐死处死4只,一半组织用于免疫组化染色HE染色观察创面上皮化情况, Ki-67染色观察创面基底角质细胞的有丝分裂,CD-31染色观察创面血管化情况；另一半用于实时PCR检测Col-I,α-SMA,TGF-p1, bFGF,EGF,IGF-1和VEGF的表达。基因敲除小鼠毛囊排列更为紊乱。KGF基因敲除的糖尿病小鼠与糖尿病小鼠的体重明显重于KGF基因敲除小鼠和野生型小鼠。并且,KGF基因敲除的糖尿病小鼠体重稍微轻于糖尿病小鼠。KGF基因敲除的糖尿病小鼠既有糖尿病小鼠肥胖的表现型,同时也表现出KGF基因敲除小鼠的凌乱和油腻的皮毛外观。2.KGF基因敲除小鼠与野生型小鼠创面愈合没有显着差别,KGF的缺失对创面开放率,创面收缩率,创面再上皮化率均未造成影响。KGF敲除组创面角质细胞增值率明显下降,上皮组织迁移和面积的测量结果显示KGF基因敲除组创面的上皮化略低于野生组,但两组之间不存在统计学差异。KGF敲除组的血管密度明显低于野生组。在伤后第7天,创面组织中Col-Ⅰ,α-SMA, TGF-β1, bFGF, EGF, IGF-1在两组中的表达没有差别。VEGF在KGF敲除组中的表达却明显降低。3.KGF基因敲除糖尿病小鼠创面愈合明显慢于对照组,KGF的缺失对创面开放率,创面再上皮化率均未造成影响,但使创面收缩率下降。两组创面基底角质细胞增值率,上皮化以及血管密度无明显差别。在伤后第7天,创面组织中Col-Ⅰ,α-SMA,TGF-β1, bFGF, EGF, IGF-1和VEGF在两组中的表达没有差别。结论：1.KGF基因敲除影响了小鼠毛囊的发育从而造成其皮毛外观的改变。杂交获得的KGF基因敲除的糖尿病小鼠既有糖尿病小鼠肥胖的表现型,同时也表现出KGF基因敲除小鼠的凌乱和油腻的皮毛外观。2.正常小鼠KGF基因敲除并未影响创面愈合,KGF的缺失使角质细胞增值率明显下降,但创面仍能正常上皮化。KGF的缺失使创面血管化程度和VEGF的表达明显降低,说明KGF对创面血管化和VEGF的表达起调节作用。3.糖尿病小鼠KGF基因敲除通过降低创面收缩影响了创面愈合。
刘永瑞[9]2014年在《小分子化合物YF-452抑制血管新生的功能及机理研究》文中研究指明血管新生是一个复杂的过程,包括内皮细胞的增殖、迁移、突破基底膜并形成叁维管状网络,它是机体生长发育过程中必不可少的过程。同时,血管新生在疾病的发生发展中也发挥着重要的作用,尤其是肿瘤。新的血管生长进入肿瘤内部,为其提供必需的氧气和营养物质,从而为肿瘤的生长和转移提供了便利条件。因此,抑制血管新生被认为是抗肿瘤的重要疗法之一。由于肿瘤细胞基因组不稳定容易突变而产生耐药性,所以和传统的靶向于肿瘤细胞的化疗相比,抗血管新生治疗呈现出一定的优势。血管新生受多种刺激因子和抑制因子的严格调控。其中VEGF在众多促血管新生的生长因子和细胞因子中,对肿瘤血管新生的调控起着重要作用且在肿瘤组织中高表达。VEGF通过与内皮细胞表面的受体结合发挥其生物学功能,即VEGFR1(Flt-1),负责细胞的有丝分裂和化学应答；VEGFR2(KDR/Flk-1)负责内皮细胞的形态发生。VEGFR2的激活导致下游多种胞内信号分子的激活,包括Src家族激酶,FAK、ERK以及PI3K/AKT激酶等,它们分别调控血管渗透性,促进内皮细胞的增殖、迁移和分化,并维持细胞的存活。因此,VEGFR2和这些胞内信号分子被认为是抑制肿瘤血管新生的重要靶点。目前,临床上已有多种VEGFR2的抑制剂用于治疗肿瘤。但是,近年来临床结果显示,大多数这些抗癌药物呈现出明显的副反应且价格比较昂贵,所以寻找新的具有自主知识产权的小分子血管新生抑制剂作为抗癌备选药物具有重要意义。本研究中,我们通过对实验室小分子化合物库中的药物进行筛选,得到一个小分子化合物YF-452并分析其在体外对内皮细胞的抑制效果。同时在体内模型中也检测了YF-452的活性并对它抑制血管新生的分子机制进行了探索。YF-452在体外能够明显抑制内皮细胞的迁移、侵袭和管状网络的形成。半体内大鼠胸主动脉环模型和两个体内模型(鸡胚尿囊膜模型和小鼠角膜微囊袋模型)也显示出YF-452能够显着抑制新生微血管的形成。通过进一步的研究发现,YF-452能够抑制小鼠异种移植模型中肿瘤的生长及瘤内血管新生,和对照组相比,小鼠注射4Omg/kg/d YF-452对肿瘤生长的抑制率达到70%。通过对肿瘤组织CD31免疫荧光染色也表明YF-452具有抗血管新生功能。同时对各组小鼠的组织器官切片进行H&E染色,并未发现有明显的病理学改变,各组小鼠的体重也未发生明显的变化,说明YF-452在抑制肿瘤生长和血管新生的过程中并未产生明显的毒性。Western Blot结果显示YF-452能够抑制VEGF诱导的VEGFR2的活性及下游蛋白激酶Src、FAK、ERK的激活。综上所述,我们找到了一个潜在的小分子化合物YF-452,能通过靶向VEGFR2的激活抑制血管新生,并将有可能成为肿瘤治疗的备选药物。此外,我们还建立了高脂饮食+STZ诱导的II型糖尿病小鼠模型,并在此基础上建立了糖尿病小鼠后肢缺血模型和伤口愈合模型,用于我课题组另外一名同学关于治疗糖尿病并发症新药研究,为药物疗效的评价奠定基础。
罗东升[10]2005年在《Endostatin和VEGF、bFGF在瘢痕中的表达及其意义》文中认为目的:研究不同病程、不同增殖状态下瘢痕中 CD34 与 endosatin(内皮抑素)、VEGF、bFGF 的表达情况,探讨瘢痕中血管生成促进因子/抑制因子的相互关系,以及两者在瘢痕发生、发展中的作用和意义,为针对瘢痕的微血管治疗提供理论依据。 方法:选择临床上不同病理分类和不同时限的瘢痕,并以正常皮肤为对照,应用免疫组化法,观察瘢痕内 CD34与 endosatin 、VEGF、bFGF 的表达情况和分布特征。 结果: 一.瘢痕内血管生成实验研究 CD34阳性颗粒主要位于真皮层及乳头层的微血管内皮细胞的胞浆,增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组中 CD34 阳性颗粒表达水平显着增高,两者之间差异无显着意义,而非增生性瘢痕组和正常皮肤组中的 CD34 表达弱阳性;时限<6 月瘢痕组中代表微血管密度的 CD34阳性颗粒表达水平高于 6～12 月瘢痕组,同时 6～12 月瘢痕组 CD34阳性颗粒表达水平高于>12 月瘢痕组,而>12 月瘢痕组的 CD34表达与正常皮肤组比较差异无显着意义。 二.瘢痕内血管生成抑制因子 endostatin 的实验研究 Endostatin 阳性颗粒主要位于表皮角朊细胞胞浆,尤以基底层阳重庆医科大学硕士研究生学位论文3性颗粒染色最深,少数真皮微血管染色阳性。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组中 endostatin 的表达水平显着增强,两者之间差异无显着意义,而非增生性瘢痕组和正常皮肤组中 endostatin 表达弱阳性或阴性;时限<6 月瘢痕组中 endostatin 阳性颗粒表达水平高于 6～12 月瘢痕组,同时 6～12 月的瘢痕组中 endostatin 阳性颗粒表达水平高于>12 月瘢痕组,而>12 月瘢痕组中 endostating 阳性颗粒与正常皮肤组比较差异无显着意义。经相关性检测瘢痕中 endostatin 的表达与 VEGF 的表达、bFGF 的表达及微血管密度变化密切相关。叁.瘢痕内 VEGF、bFGF 表达的实验研究VEGF 阳性颗粒主要位于表皮中的角朊细胞胞浆,尤以基底层阳性颗粒染色最深,部分真皮微血管染色阳性。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组 VEGF 的表达水平显着增高,两者间无明显差异,而非增生性瘢痕组和正常皮肤组中的 VEGF 表达弱阳性和阴性;时限<6 月瘢痕组中 VEGF阳性颗粒表达水平高于 6～12 月瘢痕组,同时 6～12 月瘢痕组中 VEGF阳性颗粒表达水平高于>12 月瘢痕组,而>12 月瘢痕中 VEGF 与正常皮肤组比较差异无显着意义。bFGF 阳性颗粒主要位于表皮棘层、血管内皮细胞、部分成纤维细胞、毛囊上皮细胞。增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组中 bFGF 的表达水平显着增高,两者间无明显差异,且明显高于非增生性瘢痕组和正常皮肤组 bFGF 表达水平;时限<6 月瘢痕组中 bFGF 阳性颗粒表达水平高于 6～12 月瘢痕组,同时 6～12 月瘢痕组 bFGF 阳性颗粒表达水平高于>12 月瘢痕组,而>12 月瘢痕中 bFGF 与正常皮肤组比较差异无显着意义。经相关检测,VEGF 表达、bFGF 表达与 endostatin 的表达及微血管密度变化显着相关 ,且早期瘢痕中 VEGF/endostatin>1,一年以后,VEGF/endostatin<1。结论:
参考文献：
[1]. 组织因子促进糖尿病鼠伤口愈合及对血管内皮细胞生长因子的诱导作用[D]. 白玲. 中国协和医科大学. 2002
[2]. Sonic hedgehog改善内皮祖细胞功能促进1型糖尿病伤口愈合的研究[D]. 何梅香. 广州医科大学. 2014
[3]. 小鼠放创复合伤伤口愈合延迟机理研究[D]. 柏书博. 第二军医大学. 2011
[4]. Sonic Hedgehog促糖尿病小鼠伤口愈合及机制研究[D]. 胡太平. 中南大学. 2006
[5]. 不同细胞生长因子在皮瓣坏死创面愈合中作用和机制研究[D]. 王心华. 浙江大学. 2014
[6]. SIRT1延缓小鼠下肢缺血后血流恢复的机制研究[D]. 窦永青. 河北医科大学. 2017
[7]. 角质细胞中FOXO1基因对正常和糖尿病小鼠牙龈伤口愈合的影响[D]. 陆永健. 第二军医大学. 2017
[8]. 小鼠角质细胞生长因子缺失对创面愈合的影响[D]. 彭程. 中南大学. 2011
[9]. 小分子化合物YF-452抑制血管新生的功能及机理研究[D]. 刘永瑞. 华东师范大学. 2014
[10]. Endostatin和VEGF、bFGF在瘢痕中的表达及其意义[D]. 罗东升. 重庆医科大学. 2005
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