论文摘要
核孔膜作为一种孔径均一和圆柱形孔形的微孔滤膜,已在各行业的精密过滤领域有广泛的应用,基于较小孔径核孔膜（100-300 nm）的挤出法也用于控制脂质体粒径。由此,本文将基于核孔膜的挤出法用于诱导脂质体或脂质囊泡膜融合。首先研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和空白脂质体膜融合,继而研究了挤出法能否诱导荧光标记脂质体和外泌体发生膜融合。此外,基于物理性细胞内递送技术的原理和研究进展,推测较大孔径附核孔膜（7-11 μm）可用于细胞内递送。分别利用挤出法将荧光标记的右旋糖酐大分子递送至小鼠结肠癌细胞株CT26和人髓性白血病细胞株K562，并对影响递送效率的主要因素进行了初步考察,此外还对不同分子量右旋糖酐是否进入细胞核、入核途径及时机进行了研究。具体研究内容及结果如下:1)挤出法诱导脂质体膜融合制备了空白脂质体和含FRET荧光分子对的标记脂质体,通过挤出法诱导脂质体发生膜融合,动态光散射法（DLS）检测脂质体粒径,激光共聚焦（CLSM）观察脂质体膜融合现象,荧光分光光度计定量检测荧光强度变化并计算膜融合率,以冻融法作为对照;并考察了挤出次数、压力和温度等对膜融合效率的影响。结果显示,挤出法能诱导两种脂质体发生高效膜融合,这可从处理后的脂质体共聚焦照片中荧光强度的变化证实,此外对荧光强度变化的定量分析显示挤出75次时膜融合效率达27%。与冻融法相比,挤出法的膜融合效率相当,但是所制得的膜融合脂质体粒径分布更均一。此外,低挤出压力、生理温度和高挤出次数有利于促进膜融合和脂质混合。2)挤出法构建杂化外泌体从K562上清利用超速离心法提取外泌体,然后与荧光标记脂质体混合后挤出处理诱导膜融合,构建杂化外泌体,并与冻融法进行对照。利用透射电镜对外泌体和杂化外泌体进行观察和鉴定,CLSM观察荧光标记脂质体和外泌体的膜融合现象,DLS检测各种脂质囊泡粒径,利用荧光分光光度法检测荧光强度变化并计算膜融合效率。结果显示,挤出法能诱导脂质体和外泌体膜融合,从而构建杂化外泌体。透射电镜下,杂化外泌体仍然保持了外泌体典型的茶托样结构。CLSM观察证实二者发生了膜融合。与冻融法相比,挤出法（100次）的膜融合效率也即脂质稀释率稍低,但是挤出法制备的杂化外泌体具有均一的粒径,且挤出过程耗时短。3)利用挤出法将右旋糖酐递送入CT26细胞利用挤出法诱导CT26细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞贴壁生长和增殖的影响,采用流式细胞术（FACS）分析递送效率和细胞死亡率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的亚细胞分布,也即质核比。结果表明,挤出法处理的细胞保持了 CT26的贴壁生长和增殖能力。核孔膜孔径和右旋糖酐分子量影响了细胞内递送效率,孔径和分子量与递送效率负相关。3种不同分子量右旋糖酐在挤出处理后都能进入细胞核,进入细胞核的量与分子量呈负相关。4)利用挤出法将右旋糖酐递送入悬浮细胞K562利用挤出法诱导K562细胞变形及短暂膜穿孔而将不同分子量右旋糖酐递送入细胞内,观察了挤出对细胞生长和增殖的影响,FACS分析递送效率,并考察了核孔膜孔径和右旋糖酐分子量对递送效率的影响。CLSM观察了细胞内右旋糖酐的分布,也即质核比,以确定2 MDa右旋糖酐细胞核的途径和时机。结果表明,挤出法不影响K562细胞的生长和增殖。核孔膜孔径和递送材料分子量是影响递送效率的重要因素,孔径越小,则递送效率越高,同时孔径越小,则细胞的死亡率也越高。2 MDa右旋糖酐通过挤出诱导的核膜破裂进入细胞核,并在核膜修复后保持了质核比的稳定。总之,基于核孔膜的挤出法可用于诱导脂质囊泡的膜融合并用于构建杂化外泌体,有望成为新的外泌体修饰方法;此外,基于核孔膜的挤出法可用于递送各种大分子至贴壁细胞CT26和悬浮细胞K562,有望成为新的物理性细胞内递送方法。
论文目录
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 秦文娟
导师: 刘玲蓉
关键词: 核孔膜,挤出法,膜融合,杂化外泌体,细胞内递送
来源: 北京协和医学院
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学
单位: 北京协和医学院
分类号: Q25
DOI: 10.27648/d.cnki.gzxhu.2019.000715
总页数: 70
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