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机械拉伸加载对BMSCs侵袭行为的影响及相关分子机理研究

2020-12-02阅读(443)

机械拉伸加载对BMSCs侵袭行为的影响及相关分子机理研究

论文摘要

骨髓间充质干细胞（Bone‐marrow‐derived mesenchymal stem cells,BMSCs）在损伤组织的愈合和再生医学中发挥着重要作用。然而,BMSCs发挥其修复功能的前提是必须从其原来的微环境转移到损伤组织位点,这个过程非常复杂,受到机械因素和化学因素的影响。目前,相关研究显示BMSCs的增殖、分化、迁移均受到机械力刺激的影响。我们之前的研究表明循环机械拉伸加载能够促进BMSCs的迁移,抑制细胞的侵袭,但其中的分子机制,尤其是抑制细胞侵袭能力的分子机制并不清楚。本文基于此,继续深入探究机械拉伸加载影响BMSCs侵袭能力的分子机制。MT1-MMP是MMPs家族成员,其主要功能是降解胞外基质（Extracellular matrix,ECM）,为细胞侵袭到其他组织开辟道路。PI3K/Akt信号通路参与介导MMPs的表达和活性,在细胞侵袭过程中发挥重要作用。因此,本实验首先取用SD大鼠后肢的股骨和胫骨分离提取原代BMSCs,培养原代细胞,待细胞长满后,传代培养细胞;其次利用机械拉伸加载装置拉伸加载BMSCs,并采用Transwell装置（小室内铺一层基质胶）以检测细胞侵袭能力的变化;实验进一步检测了机械拉伸加载对MT1-MMP的影响以及过表达MT1-MMP对BMSCs侵袭能力的影响;最后考察了机械拉伸加载对PI3K/Akt信号通路活性的影响以及PI3K/Akt信号通路对机械拉伸加载条件下MT1-MMP的表达以及BMSCs侵袭能力的影响。结果显示机械拉伸加载显著降低BMSCs的侵袭能力,同时下调MT1-MMP的表达水平。通过过表达MT1-MMP,发现BMSCs侵袭能力显著增加,同时,过表达MT1‐MMP可恢复机械拉伸加载降低的BMSCs的侵袭能力,提示BMSCs的侵袭能力受到MT1-MMP的调控。此外,机械拉伸加载抑制PI3K/Akt信号通路的活性。因此,实验进一步研究了PI3K/Akt信号通路与MT1-MMP的表达水平以及BMSCs侵袭能力之间的关系,发现在PI3K磷酸化抑制剂LY294002作用下,Akt的磷酸化水平、MT1-MMP表达水平和BMSCs的侵袭能力均显著下降。采用Akt磷酸化抑制剂A-443654作用BMSCs,也得到相似的实验结果。采用Akt磷酸化激活剂SC79上调Akt磷酸化可增加MT1‐MMP表达,抑制机械拉伸加载降低BMSCs侵袭能力。本研究工作证明了机械拉伸加载通过PI3K/Akt信号通路下调MT1‐MMP表达进而抑制BMSCs的侵袭能力。该研究结果为深入认识力学调控BMSCs的运动能力及其力信号转导机制提供了实验依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 英文缩写及中文对照表
  • 1 绪论
  •   1.1 研究背景
  •     1.1.1 骨髓间充质干细胞
  •     1.1.2 MT1-MMP
  •     1.1.3 PI3K/Akt信号通路
  •   1.2 研究目的、意义及主要内容
  •     1.2.1 研究目的和意义
  •     1.2.2 主要研究内容
  •     1.2.3 实验技术路线
  • 2 机械拉伸加载对BMSCs侵袭行为的影响
  •   2.1 引言
  •   2.2 实验动物、仪器和材料
  •     2.2.1 实验动物
  •     2.2.2 主要仪器、耗材
  •     2.2.3 主要实验药品与试剂
  •     2.2.4 主要实验试剂的配制
  •   2.3 实验方法
  •     2.3.1 BMSCs的提取分离、培养
  •     2.3.2 BMSCs拉伸加载装置
  •     2.3.3 机械拉伸加载BMSCs后对其侵袭能力的检测
  •     2.3.4 细胞增殖能力的检测
  •     2.3.5 统计学分析
  •   2.4 实验结果
  •     2.4.1 BMSCs的形态学观察
  •     2.4.2 机械拉伸加载抑制BMSCs侵袭能力
  •     2.4.3 机械拉伸加载对BMSCs增殖能力的影响
  •   2.5 分析讨论
  •   2.6 本章小结
  • 3 MT1-MMP介导机械拉伸加载影响BMSCs侵袭能力
  •   3.1 引言
  •   3.2 实验材料
  •     3.2.1 主要仪器和耗材
  •     3.2.2 主要实验药品和试剂
  •     3.2.3 主要实验试剂配制
  •   3.3 实验方法
  •     3.3.1 细胞拉伸加载方法
  •     3.3.2 Real-time PCR检测MT1-MMP基因的表达
  •     3.3.3 Wstern blot
  •     3.3.4 免疫荧光染色MT1-MMP
  •     3.3.5 MTS法检测细胞的增殖能力
  •     3.3.6 MT1-MMP过表达载体的构建
  •     3.3.7 质粒扩增和提取
  •     3.3.8 慢病毒包装和感染细胞
  •     3.3.9 细胞侵袭能力的检测
  •     3.3.10 统计学分析
  •   3.4 实验结果
  •     3.4.1 机械拉伸加载对MT1-MMP表达的影响
  •     3.4.2 MT1-MMP过表达载体的构建与鉴定
  •     3.4.3 MT1-MMP过表达对BMSCs侵袭能力的影响
  •     3.4.4 MT1-MMP过表达对BMSCs增殖能力的影响
  •     3.4.5 过表达MT1‐MMP对机械拉伸抑制的BMSCs侵袭能力的影响
  •   3.5 分析讨论
  •   3.6 本章小结
  • 4 拉伸加载通过PI3K/Akt信号通路影响BMSCs侵袭能力
  •   4.1 引言
  •   4.2 实验材料
  •     4.2.1 主要仪器和耗材
  •     4.2.2 主要实验药品和试剂
  •     4.2.3 主要实验试剂配制
  •   4.3 实验方法
  •     4.3.1 细胞拉伸加载方法
  •     4.3.2 Western blot
  •     4.3.3 细胞侵袭能力的检测
  •     4.3.4 MTS法检测细胞的增殖能力
  •   4.4 实验结果
  •     4.4.1 阻断PI3K/Akt信号通路降低MT1‐MMP表达和BMSCs的侵袭
  •     4.4.2 机械拉伸加载抑制PI3K/Akt信号通路
  •     4.4.3 上调Akt磷酸化可恢复机械拉伸加载抑制的BMSCs侵袭能力
  •   4.5 分析讨论
  •   4.6 本章小结
  • 5 结论与展望
  •   5.1 主要结论
  •   5.2 论文的不足之处及后续工作的展望
  • 参考文献
  • 附录
  •   A.作者在攻读硕士学位期间发表的学术论文
  •   B.作者在攻读硕士学位期间参加的学术会议
  •   C.学位论文数据集
  • 致谢

    • 文章来源

    类型: 硕士论文

    作者: 付小蓉

    导师: 宋关斌,罗庆

    关键词: 骨髓间充质干细胞,机械拉伸,侵袭

    来源: 重庆大学

    年度: 2019

    分类: 基础科学,医药卫生科技

    专业: 生物学,基础医学

    单位: 重庆大学

    分类号: R329.2

    DOI: 10.27670/d.cnki.gcqdu.2019.001025

    总页数: 67

    文件大小: 5395k

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