论文摘要
盐碱是一种自然界中广泛存在的非生物逆境胁迫,国内外学者围绕植物耐盐碱机制进行了大量的研究工作。关于抑制素PHB基因的研究主要集中于抗细胞增殖、抗肿瘤作用,与盐碱逆境相关的研究较少。深入研究该基因的分子作用机制,对植物耐盐碱分子育种、充分利用我国盐碱地资源具有重要的意义。利用qRT-PCR技术研究了拟南芥AtPHB6基因与盐碱逆境的应答关系,通过测量根长和鲜重观察了野生型、过表达AtPHB6和突变体拟南芥株系对逆境的的抗逆性,利用酵母双杂交系统筛选出AtPHB6蛋白的互作蛋白,利用体外Pull-down和双分子荧光互补实验（BiFC）进一步验证两个蛋白的互作关系。并对互作蛋白的盐碱抗性做初步的研究,具体研究成果如下:克隆出拟南芥AtPHB6基因,生物信息学分析发现AtPHB6与同属Ⅱ型的AtPHB1和AtPHB2亲缘关系较近。在不同胁迫处理的拟南芥中AtPHB6基因的表达量均有所上升。在种子萌发期和萌发后期,过表达AtPHB6株系抗性高于野生型而突变体的抗性比野生型低。筛选出AtPHB6的互作蛋白AtSOT12,在酵母细胞中共转化验证了 AtPHB6和AtSOT12具有相互作用。利用体外Pull-down实验和BiFC实验进一步证实了两个蛋白的互作关系。亚细胞定位显示AtPHB6和AtSOT12蛋白表达都定位在细胞核和细胞质。胁迫处理后的拟南芥中AtSOT12基因的表达量有所上升。在种子萌发期和萌发后期,过表达AtSOT12株系抗性高于野生型。如上结果表明,可能两个蛋白共同作用提高了植物的抗性。
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摘要Abstract1 绪论 1.1 课题背景 1.2 Prohibitin基因的研究进展 1.2.1 Prohibitin基因的结构 1.2.2 Prohibitin基因的功能 1.3 酵母双杂交技术 1.3.1 酵母双杂交技术的原理 1.3.2 酵母双杂交技术的应用 1.4 磺基转移酶SOT的研究进展 1.5 本研究的目的和意义2 AtPHB6基因的克隆及生物信息学分析 2.1 实验材料 2.1.1 植物材料 2.1.2 菌株和载体 2.1.3 实验试剂 2.2 实验方法 2.2.1 AtPHB6基因的克隆与载体的构建 2.2.2 生物信息学分析 2.3 结果与分析 2.3.1 AtPHB6基因的克隆与载体的构建 2.3.2 AtPHB蛋白的同源性比对 2.3.3 AtPHB蛋白的进化树分析 2.4 本章小结3 AtPHB6基因的抗逆性分析 3.1 实验材料 3.1.1 植物材料 3.1.2 菌株和载体 3.1.3 实验试剂 3.2 实验方法 3.2.1 逆境胁迫下AtPHB6在mRNA水平的表达分析 3.2.2 pBI121-AtPHB6的载体构建 3.2.3 拟南芥的遗传转化 3.2.4 AtPHB6过表达拟南芥的鉴定 3.2.5 atphb6突变体的鉴定 3.2.6 AtPHB6基因的过表达株系与突变体株系的抗性分析 3.3 结果与分析 3.3.1 逆境胁迫下AtPHB6在mRNA水平的表达分析 3.3.2 pBI121-AtPHB6的载体构建 3.3.3 AtPHB6过表达拟南芥的鉴定 3.3.4 atphb6突变体拟南芥的鉴定 3.3.5 AtPHB6基因的过表达植株与突变体植株的抗性分析 3.4 本章小结4 AtPHB6互作蛋白的筛选及共转化验证 4.1 实验材料 4.1.1 菌株 4.1.2 载体 4.1.3 培养基及试剂配方 4.2 实验方法 4.2.1 pGBKT7-AtPHB6的载体构建 4.2.2 酵母转化 4.2.3 “诱饵”蛋白的毒性和自激活检测 4.2.4 拟南芥cDNA文库筛选 4.2.5 酵母细胞DNA提取及鉴定 4.2.6 共转化验证 4.3 结果与分析 4.3.1 pGBKT7-AtPHB6的载体构建 4.3.2 “诱饵”蛋白的毒性检测和自激活检测 4.3.3 拟南芥cDNA文库筛选 4.3.4 共转化验证 4.4 本章小结5 Pull-down和BiFC验证AtPHB6与AtSOT12蛋白之间的相互作用 5.1 实验材料 5.1.1 植物材料 5.1.2 载体 5.1.3 实验试剂 5.2 实验方法 5.2.1 pQE30-AtPHB6的载体构建 5.2.2 His-AtPHB6融合蛋白的小量诱导表达 5.2.3 His-AtPHB6融合蛋白的大量诱导及纯化 5.2.4 pGEX-6p-3-AtSOT12的载体构建 5.2.5 GST-AtSOT12融合蛋白的小量诱导表达 5.2.6 GST-AtSOT12蛋白的大量诱导及纯化 5.2.7 体外Pull-down验证蛋白之间的相互作用 5.2.8 AtPHB6蛋白与AtSOT12蛋白的亚细胞定位 5.2.9 BiFC验证两个蛋白之间的相互作用 5.3 结果与分析 5.3.1 pQE30-AtPHB6的载体构建 5.3.2 His-AtPHB6融合蛋白的小量诱导表达 5.3.3 His-AtPHB6融合蛋白的大量诱导表达及纯化 5.3.4 pGEX-6p-3-AtSOT12的载体构建 5.3.5 GST-AtSOT12融合蛋白的小量诱导表达 5.3.6 GST-AtSOT12融合蛋白的大量诱导表达及纯化 5.3.7 Pull-down验证两蛋白之间的相互作用 5.3.8 pBI121-AtPHB6-GFP的载体构建 5.3.9 pBI121-AtSOT12-GFP的载体构建 5.3.10 AtPHB6和AtSOT12蛋白在洋葱表皮中亚细胞定位 5.3.11 pBS-35S:AtPHB6-VC80的载体构建 5.3.12 pBS-35S:AtSOT12-VN154的载体构建 5.3.13 BiFC验证蛋白之间的相互作用 5.4 本章小结6 拟南芥AtSOT12基因的抗逆性分析 6.1 实验材料 6.2 实验方法 6.2.1 逆境胁迫下AtSOT12基因在mRNA水平的表达分析 6.2.2 pBI121-AtSOT12的载体构建 6.2.3 拟南芥的遗传转化 6.2.4 AtSOT12过表达拟南芥的鉴定 6.2.5 拟南芥AtSOT12基因过表达植株的抗逆性分析 6.3 结果与分析 6.3.1 逆境胁迫下AtSOT12基因在mRNA水平的表达分析 6.3.2 pBI121-AtSOT12的载体构建 6.3.3 AtSOT12过表达拟南芥的鉴定 6.3.4 拟南芥AtSOT12基因的过表达植株的抗性分析 6.4 本章小结讨论结论参考文献攻读学位期间发表的学术论文致谢附件
文章来源
类型: 硕士论文
作者: 徐畅
导师: 金淑梅
关键词: 拟南芥,抑制素基因,酵母双杂交,磺基转移酶基因,盐碱胁迫
来源: 东北林业大学
年度: 2019
分类: 基础科学
专业: 生物学,生物学
单位: 东北林业大学
基金: 黑龙江省自然科学基金联合引导项目(LH2019C011),东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室开放基金(SAVER1701)
分类号: Q943.2
DOI: 10.27009/d.cnki.gdblu.2019.000117
总页数: 74
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标签：拟南芥论文; 抑制素基因论文; 酵母双杂交论文; 磺基转移酶基因论文; 盐碱胁迫论文;
